榛蘑多糖提取液脫蛋白方法的研究

侯 越，包鴻慧

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

0 引言

多糖也稱多聚糖，是10個(gè)以上單糖殘基用糖苷鍵相連而成的聚合體，是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一[1]。在自然界中90%以上的碳水化合物都是以多糖形式存在的，它直接參與生物體的基本代謝過(guò)程，對(duì)生物體的代謝過(guò)程產(chǎn)生積極影響。中外醫(yī)藥學(xué)家現(xiàn)已證實(shí)，多糖及多糖類產(chǎn)品對(duì)慢性疾病有著顯著的食療效果。隨著生活水平的提高和人口老齡化時(shí)代的到來(lái)，人們將更加關(guān)注保健與養(yǎng)生，而多糖類的廣泛性與顯著的生物學(xué)活性，正好契合這種需要。而且，研究發(fā)現(xiàn)多糖對(duì)人體無(wú)毒副作用，被譽(yù)為“21世紀(jì)”人類醫(yī)學(xué)保健領(lǐng)域的救星。因其特殊的生理作用，多糖現(xiàn)已成為國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)科領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。但截至目前，人們對(duì)多糖的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如蛋白質(zhì)和核酸那樣深入。

榛蘑，學(xué)名蜜環(huán)菌，為白蘑科植物蜜環(huán)菌的子實(shí)體，是我國(guó)一種十分重要的藥食兼用真菌。榛蘑營(yíng)養(yǎng)豐富，含有人體必需的多種氨基酸和維生素?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，榛蘑多糖具有抗輻射、促進(jìn)造血、抑制腫瘤生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[2]，相關(guān)研究表明，在多糖的提取過(guò)程中，提取液中的部分多糖會(huì)與一些游離蛋白質(zhì)共存，并形成糖蛋白復(fù)合物，使得蛋白質(zhì)難以脫除。而脫除蛋白是多糖純化的一個(gè)重要步驟，純化程度對(duì)研究多糖的生物功能性尤為重要，如何在盡可能多地保留多糖的有效成分的前提下將蛋白質(zhì)除去，是多糖純化試驗(yàn)的關(guān)鍵部分。

1 脫蛋白的方法

應(yīng)用蛋白質(zhì)沉淀、多糖不沉淀的原理，可將多糖提取液中的蛋白質(zhì)脫去。主要采用Sevage法、三氯乙酸法、三氟三氯乙烷法等方法[3]，在多糖的純化除雜中，將結(jié)合成糖蛋白形式的結(jié)構(gòu)復(fù)雜、組成多樣的蛋白質(zhì)和多糖分離開(kāi)來(lái)。

1.1 Sevage法

根據(jù)氯仿等有機(jī)溶劑會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性的特點(diǎn)，將多糖提取液與Sevage試劑[氯仿∶正丁醇=5∶1（V/V）]按照 5∶1的比例混勻后，劇烈振搖 20～30 min，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞，變性形成凝膠，變性的蛋白質(zhì)存在于水層和有機(jī)溶劑層分層交界處，經(jīng)離心可除去[4]。張立娟等人[5]通過(guò)研究Sevage試劑配比（氯仿∶正丁醇）、多糖提取液與Sevage試劑的體積比對(duì)多糖含量及蛋白脫除率的影響，通過(guò)試驗(yàn)得出Sevage試劑配比（氯仿∶正丁醇） 5∶1，多糖提取液與Sevage試劑的體積比4∶1為最優(yōu)配比，由此提取條件得出的多糖含量42.39%，蛋白質(zhì)的脫除率82.07%。

此方法條件溫和，雖不會(huì)引起多糖的變性，但只局限于將多糖提取液中游離的蛋白質(zhì)去除，不適于脫除與多糖緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)，且需重復(fù)多次，效率也低，同時(shí)由于試驗(yàn)次數(shù)過(guò)多，也會(huì)造成少量的多糖流失。在試驗(yàn)操作過(guò)程中可以配合加入一些蛋白質(zhì)水解酶，使脫除蛋白的效果更佳。

1.2 三氯乙酸法

三氯乙酸除蛋白的原理是利用蛋白質(zhì)會(huì)在有機(jī)酸的作用下發(fā)生變性，形成不可逆的沉淀這一特性除去提取液中的蛋白質(zhì)，通常是于低溫條件下將5%等體積的三氯乙酸溶液滴加至多糖提取液中，充分混勻后，于4℃條件下靜置過(guò)夜，將膠狀沉淀通過(guò)離心后除去。反復(fù)多次試驗(yàn)至不再渾濁，最終得到除去蛋白的多糖溶液[6]。三氯乙酸體積分?jǐn)?shù)越大，除蛋白質(zhì)效果越好，但對(duì)多糖的影響也越大，可能是三氯乙酸對(duì)多糖結(jié)構(gòu)具有破壞作用，使多糖降解，結(jié)構(gòu)受到影響，經(jīng)該法脫蛋白的多糖復(fù)溶性變差，而且這種破壞作用隨著三氯乙酸體積分?jǐn)?shù)增大而增強(qiáng)[7]。趙師師等人[8]在三氯乙酸法脫除石榴皮多糖蛋白質(zhì)試驗(yàn)中采用三氯乙酸體積分?jǐn)?shù)5%，振搖時(shí)間10 min，脫蛋白次數(shù)3次，在此條件下石榴皮多糖中蛋白率脫除率達(dá)89.0%，多糖損失率為8.4%。陳湘[9]在黃蘑除蛋白試驗(yàn)中直接向多糖溶液中加入三氯乙酸晶體，通過(guò)不同TCA用量考查其吸光度和多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)后發(fā)現(xiàn)，粗多糖與三氯乙酸質(zhì)量比為1∶6時(shí)除蛋白效果較好。

1.3 三氟三氯乙烷法

三氟三氯乙烷法是將等體積的三氟三氯乙烷加入到多糖提取液中，混合均勻后于低溫下攪拌10 min，水層經(jīng)離心后分離，重復(fù)處理2次，即可得到除去蛋白質(zhì)的多糖溶液[10]。楊景明等人[11]將制備的防風(fēng)粗多糖用水溶解，將等體積的三氟三氯乙烷加入到多糖溶液中，低溫?cái)嚢?0 min，離心后分取水層，再用上述溶劑處理2次，得到無(wú)蛋白質(zhì)的防風(fēng)多糖溶液。三氟三氯乙烷法的優(yōu)點(diǎn)是蛋白去除率較高，但由于三氟三氯乙烷沸點(diǎn)較低、易揮發(fā)，不宜大量應(yīng)用，同時(shí)攪拌時(shí)應(yīng)注意在低溫下進(jìn)行。

1.4 鹽酸法

鹽酸法就是利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低的這一特性，使多糖中的蛋白在酸性溶液中沉淀，此方法是為了降低多糖在酸性條件下的分解[12]。張海燕[13]在山藥多糖除蛋白的相關(guān)試驗(yàn)中通過(guò)測(cè)定其蛋白質(zhì)含量和多糖含量，綜合蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率，確定鹽酸法除蛋白的最佳條件為pH值2.0，此時(shí)脫蛋白率為93.95%，多糖保留率為67.74%。鹽酸脫蛋白法的優(yōu)點(diǎn)是高效，但因其需要嚴(yán)格的試驗(yàn)條件，如條件不足則會(huì)使得多糖被水解，從造成損失。

1.5 酒精變性法

酒精變性法的原理是利用蛋白質(zhì)經(jīng)有機(jī)溶劑變性處理后難與水互溶，而多糖沉淀后可復(fù)溶于水這一特點(diǎn)將蛋白去除。董宏平等人[14]在對(duì)水花微囊藻多糖除蛋白試驗(yàn)中采用酒精變性法除蛋白。試驗(yàn)結(jié)果表明，酒精可以有效去除蛋白，多糖提取液的蛋白去除量可達(dá)64.8%～75.8%。該法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、試劑無(wú)毒無(wú)污染。但會(huì)降低多糖的回收率，原因是部分多糖會(huì)與蛋白結(jié)合，導(dǎo)致復(fù)溶性變差，難以回收。同時(shí)，在大量提取時(shí)會(huì)消耗大量的乙醇，成本較高，不宜采用此方法。

2 結(jié)語(yǔ)

每一種脫蛋白的方法，除蛋白效率都較高，但卻有各自的缺點(diǎn)。Sevage法作為最常用的除蛋白方法，會(huì)消耗較多有機(jī)溶劑，容易造成多糖的損失，應(yīng)用時(shí)應(yīng)著重考慮去蛋白的次數(shù)來(lái)減少損耗。三氯乙酸法脫蛋白后多糖的復(fù)溶性明顯減弱。三氟三氯乙烷沸點(diǎn)較低、易揮發(fā)，不宜大量應(yīng)用。鹽酸法脫蛋白率雖然高，但多糖的損失率也較高。酒精變性法雖可獲得較高的蛋白去除率且操作簡(jiǎn)便，但會(huì)降低多糖的回收率，原因是部分多糖會(huì)與蛋白結(jié)合，導(dǎo)致復(fù)溶性變差，難以回收。除以上幾種常用方法外，近年來(lái)人們還在不斷探索其他有效的脫蛋白法，如氫氧化鈉法、氯化鈣法、反復(fù)凍融法、陰離子交換樹(shù)脂法、徑向流動(dòng)色譜法、蛋白酶法等[15]。在進(jìn)行榛蘑脫蛋白純化試驗(yàn)中可以選擇不同的方法進(jìn)行聯(lián)用，以此達(dá)到最佳的脫蛋白效果。