臨床應用干細胞治療心肌梗死面臨的問題及進展

羅志榮，蔡 昊，王強利，牟芳芳，邵水金，國海東

（上海中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院：1人體解剖學教研室，2組織胚胎學教研室，上海201203）

0 引言

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）是造成人類死亡的主要原因。在我國，CVD占所有死亡人數(shù)的45%左右。其中，急性心肌梗死（acute myo?cardial infarction，AMI）因其突發(fā)性和高致死率、高致殘率，已成為全世界范圍內(nèi)的一個重大公共衛(wèi)生問題。心肌梗死后心肌細胞發(fā)生凝固性壞死，并在細胞間隙中出現(xiàn)水腫和中性粒細胞浸潤。壞死的肌細胞被巨噬細胞清除，并最終被膠原瘢痕所代替［1］。

快速有效地恢復血流是減少梗死面積的最佳治療方案。然而，高達60%的AMI患者仍可能發(fā)生心肌重構。目前的常規(guī)治療，包括藥物、介入或外科手術，均不能挽救已經(jīng)壞死的心肌細胞，從而導致整個心臟的大小、形狀、結構和功能發(fā)生變化［2］。近十幾年來，干細胞領域的快速興起與發(fā)展為AMI的治療帶來了新的希望。干細胞治療AMI的可能機制包括直接向心肌和血管內(nèi)皮細胞分化、促進血管新生或旁分泌途徑。其中，干細胞移植后經(jīng)旁分泌途徑保護受損心肌，促進骨髓和／或心臟內(nèi)干細胞遷移到損傷部位已成為近年來研究的焦點［3］。

過去十幾年，已有多種干細胞用于臨床前動物模型和臨床試驗，包括骨髓單核細胞（bone marrow mononuclear cell，BM?MNC），骨骼肌成肌細胞，內(nèi)皮祖細胞，間充質(zhì)干／基質(zhì)細胞（mesenchymal stem cells，MSC），心臟干細胞（cardiac stem cells，CSC），胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESC）和誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）等。 大部分動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后，干細胞移植可促進心肌再生，提高心功能。臨床試驗表明，干細胞治療可以改善心臟功能，減少梗死面積和死亡率［4－5］。 然而，也有部分臨床試驗［6］證明，干細胞移植并未讓心肌梗死患者受益。然而，在干細胞療法最終應用到臨床之前尚需解決或完善諸多關鍵問題，包括細胞來源、細胞體外培養(yǎng)、移植細胞的數(shù)量、移植途徑、移植后在宿主體內(nèi)的存活和分化、免疫排斥等。

1 干細胞來源和類型

到目前為止，已有多種來源的干細胞用于臨床試驗，包括外周血、BM、心臟活檢組織、臍帶血和脂肪組織。其中，自體BM?MNC是最常見的用于治療AMI的干細胞類型。BM?MSC由于其易于從人體組織中分離以及多向分化潛力和低免疫原性而獲得了較多的關注［7］。CSC具有更好地向心肌分化的能力，但CSC培養(yǎng)具有侵襲性（需要心臟活檢），且需要較長時間的體外培養(yǎng)才能獲得足夠數(shù)量的細胞。近來，iPSC及其衍生細胞如心肌細胞代表了新的心臟再生細胞來源［8］。然而，在用于AMI患者的大規(guī)模試驗之前，需要明確并解決其致瘤性和分化形成的心肌細胞的成熟性。

細胞的健康狀態(tài)是選擇干細胞來源的重要因素之一。老年人CSC喪失自我更新能力，端?？s短或功能障礙，進入不可逆的靜止狀態(tài)［9］。并且，在每個細胞分裂期間，存在老化細胞可能無法糾正的有害DNA突變的風險［10］。除了年齡之外，還存在其他限制細胞再生潛力的影響因素。譬如，與健康人相比，從糖尿病和高血壓患者或終末期心臟病患者分離的CSC 擴增能力明顯下降［11－12］。

對不同干細胞治療的作用進行比較和評估，是今后臨床篩選合適干細胞類型的依據(jù)之一。有研究［13］比較了 BM?MSC與 BM?MNC的作用，并提出在改善局部心臟功能和減少梗死面積上，BM?MSC比BM?MNC更有優(yōu)勢。此外，心臟的形態(tài)發(fā)生十分復雜，包括多種不同的譜系提交的細胞類型。除心肌細胞之外，促進梗死區(qū)平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞的再生也是十分有價值的。然而，臨床試驗需要明確兩個不同類型干細胞聯(lián)合使用時可能的不良反應［13］。為了研究最佳的干細胞組合，CSC和MSC聯(lián)合移植已被用于豬的移植實驗［14］，并且至少有兩項研究正在進行臨床Ⅰ和Ⅱ期試驗（NCT02501811和NCT02503280）。

2 體外培養(yǎng)

目前干細胞移植治療AMI還沒有建立標準化的細胞培養(yǎng)方案。不同的培養(yǎng)方法導致細胞的均一性、純度和效力都不同。另外，細胞來源個體的性別、采用不同的試劑、從不同的位置分離細胞都可能影響細胞的數(shù)量、純度和功能。 Seeger等［15］對 REPAIR?AMI［16］與 ASTAMI［17］試驗進行比較，發(fā)現(xiàn)在 ASTAMI中使用Lymphoprep而不是Ficoll梯度離心導致總細胞數(shù)的恢復減少30%，包括CD34＋細胞和MSC。從心房獲得的CSC和來自心室的CSC具有差異基因表達和功能特性［18］。因此，在進行任何臨床試驗之前，需要建立統(tǒng)一的細胞培養(yǎng)方案，包括對細胞的狀態(tài)、純度和功能等進行鑒定［19］。

3 細胞數(shù)量

細胞數(shù)量的多少是影響干細胞療效的一個關鍵問題。理論上，需要足夠多的功能性心肌細胞才能獲得較為理想的治療作用。目前的研究中，細胞數(shù)量差別較大，在 1×106到 2×108之間［20］。 在實踐中，為了達到完全的心臟再生，可以移植大量的心肌細胞或較少數(shù)量的具有高增殖能力的前體／干細胞。一些臨床研究如 PROCHYMAL［21］，ACT34?CMI［22］，AMR?1［23］和POSEIDON［24］試驗表明，低細胞數(shù)量比高劑量獲益更好。移植大數(shù)量的細胞可能導致細胞聚集體的形成，從而導致不良反應，如心律失常［25］。然而，高度增殖細胞的注射也有可能形成腫瘤的潛在風險。此外，高增殖能力的前體／干細胞在移植微環(huán)境中能否保持較高的增殖能力，以及是否很快發(fā)生分化都是需要闡明的問題。

4 移植方式

到目前為止，臨床研究采用的細胞移植途徑主要有以下三種：心肌內(nèi)（intramuscular，IM）注射，經(jīng)冠狀動脈（intracoronary，IC）和靜脈（intravenous，IV）注射［26］。這三種移植途徑各有優(yōu)劣，究竟哪種移植方式最佳尚未達成共識。此外，不同細胞類型、疾病急緩狀態(tài)、患者年齡和體質(zhì)以及有無其他危險因素都會影響 移 植 途 徑 的 選 擇。 REGENERATE?IHD［27－28］（NCT00747708）和 Alster?MACS（NCT01337011）臨床試驗的結果將有助于闡明在慢性心力衰竭患者IC或IM之間的優(yōu)劣。

IM途徑可以通過開胸或通過心內(nèi)膜導管將細胞直接注射到心?。?9］。一般將細胞注射到梗死周邊區(qū)域，以確保細胞有足夠的血液供應維持存活。這種方法的優(yōu)勢是有較多的細胞被移植入病變部位。然而，有可能導致一些副反應，例如心肌穿孔、血管損傷、栓塞和室性心律失常的風險［29］。

IC途徑是將細胞注射到冠狀動脈循環(huán)中，包括使用標準經(jīng)皮冠狀動脈導管。這種方法與IM途徑相比更具有優(yōu)勢，因為它具有低侵襲性，并且有助于注射細胞相對均勻分布，并且細胞生存率也更高（因為細胞注入有氧氣和營養(yǎng)供應的心肌區(qū)域）。因此，這種方式在臨床相對容易操作和推廣。然而，IC途徑仍然具有一定缺點，例如通過體循環(huán)到達其他組織器官，而進入心肌的細胞數(shù)量不多［30－31］。 另一個重要的缺點是可能導致冠狀動脈栓塞，尤其是注射大直徑細胞（50～200 μm）時。

有些臨床試驗也采用了IV途徑。該方法操作最簡便，不會對患者造成損傷。但是大部分細胞潴留在肺中或被網(wǎng)狀血管上皮系統(tǒng)清除［30］。因此，在采用IV注射時，如何增強移植細胞向病變部位遷移和募集值得深入研究和探討。

5 存活和分化

干細胞在移植后能夠在心肌內(nèi)停留并存活下來是細胞療法最關鍵的一步。動物實驗［32－33］和臨床試驗［34－35］發(fā)現(xiàn)，在移植后 24 h，只有不到 10%的細胞留存下來。而移植4周后，心臟中僅檢測到1%移植的細胞［36］。大部分細胞可能被血液循環(huán)沖洗、從注射部位溢出以及細胞死亡。細胞死亡（包括壞死和凋亡）的原因可能包括：炎癥、缺氧、酸中毒、缺乏底物和代謝物累積的缺血缺氧微環(huán)境；被吞噬細胞吞噬。

目前，提高細胞移植后存活的策略主要包括：①基因修飾：如轉(zhuǎn)染抗細胞凋亡基因如 AKT［37］或Bcl?2［38］。 ②生物材料：通過纖維蛋白膠、自聚肽納米纖維等生物材料構建移植混合物或細胞片［39－40］。預處理：細胞移植前通過 eNOS增強物質(zhì)［41］、他汀類［42］、缺氧［43］或熱休克［44］預處理以提高細胞存活。

存活的干細胞能否有效向心肌細胞分化是心肌再生的主要問題。BM?MNC和MSC等移植后向心肌細胞分化效率極其有限。ESC和iPSC向心肌細胞分化的效率較高，但其安全性尚未得到有效評價。目前，多數(shù)學者認為，干細胞移植后可能主要通過旁分泌途徑發(fā)揮改善心臟功能的作用。盡管如此，干細胞向心肌細胞分化并替代受損的心肌仍是干細胞療法的主要目的，如何提高干細胞向心肌細胞分化值得進一步研究。此外，干細胞移植后向血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、淋巴管內(nèi)皮細胞的分化也具有較為重要的意義。

6 細胞排斥

自體干細胞是最理想的干細胞來源，因為它不存在免疫反應。然而，自體干細胞移植最大的缺陷在于它在體外培養(yǎng)和鑒定需要較長一段時間，無法用于AMI的治療，這極大地限制了它的應用。

同種異體間移植最值得關注的問題就是細胞免疫排斥反應，它可能直接影響細胞療法的最終效果。盡管 MSC 具有免疫豁免的特性［45－46］，但有研究［47］報道其分化以后又重新獲得免疫原性，這可能在一定程度上解釋了MSC效果不佳的原因。在解決細胞免疫排斥方面，有以下幾種策略：HLA供體?受體匹配［48］；使用免疫抑制劑，但具有較大的副作用［49］；與免疫排斥有關的基因修飾［50］；使用化學或生物材料降低免疫反應［51］。此外，細胞儲存、細胞示蹤、移植時機、移植次數(shù)以及患者特征等也將在一定程度上影響干細胞治療的效果。

7 展望

盡管干細胞移植對心肌梗死治療有較好的應用前景，然而，在細胞來源和體外培養(yǎng)、移植細胞的數(shù)量、移植途徑和時機、移植后在宿主體內(nèi)的存活和分化、免疫排斥等方面尚不規(guī)范，也未建立相應的可控的標準，這些都會影響干細胞治療的效果。同種異體移植的細胞來源選擇性較大，質(zhì)量容易控制，并且可以儲存，能夠滿足急性應用。因此，同種異體移植應該是心臟再生醫(yī)學最主要的方式。盡管到目前為止，該領域還存在諸多的問題需要解決，但干細胞療法對于心肌梗死以及梗死后心力衰竭仍是最有希望的治療手段。在解決目前存在的問題的基礎上，相信在不久的將來，干細胞療法最終將成為臨床上應用于心肌梗死等缺血性心臟病的有效而成熟的治療方式。

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