肌肉生長抑制素基因的研究進(jìn)展

楊 瑾，周播江

(遵義醫(yī)學(xué)院 解剖學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

生長分化因子-8，也被稱為肌肉生長抑制素(Myostatin，Mstn)，是轉(zhuǎn)化生長因子β超家族的一員。Mstn基因是一種主要表達(dá)于肌肉組織的分泌蛋白,其主要功能是調(diào)節(jié)肌細(xì)胞的生長與分化，在哺乳動(dòng)物生長發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用。近來一直倍受研究者密切關(guān)注。

在動(dòng)物體出生后，肌肉生長抑制素基因主要通過限制骨骼肌纖維數(shù)量和大小對(duì)骨骼肌生長發(fā)育起著重要的抑制作用[1]。因此，在許多哺乳動(dòng)物和魚類體內(nèi)，該基因損傷或目的性抑制肌細(xì)胞生長抑制素蛋白可以引起肌肉大量增生的相應(yīng)表型出現(xiàn)，并引起肌纖維類型發(fā)生變化。除了影響骨骼肌生長發(fā)育外，近年來還發(fā)現(xiàn)Mstn基因還參與糖類代謝，并對(duì)脂肪沉積起抑制作用[2-3]；在骨密度調(diào)控及雌性哺乳動(dòng)物的生殖調(diào)控中，Mstn基因也起到一定作用[4-6]。本文主要對(duì)有關(guān)Mstn基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、在動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)、作用機(jī)制、基因表達(dá)調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等的方面相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以便為骨骼肌纖維類型轉(zhuǎn)換相關(guān)機(jī)制的研究提供資料。

1 Mstn基因的發(fā)現(xiàn)

Mstn，全稱肌肉生長抑制素，于1997年由美國John Hopkins大學(xué)醫(yī)學(xué)部研究人員McPherron等在研究轉(zhuǎn)化因子-β(TGF-β)時(shí)通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在小鼠骨骼肌中發(fā)現(xiàn)的新型生長因子[1]。McPherron在研究中發(fā)現(xiàn)Mstn基因缺失的小鼠肌肉增大，體重約是野生鼠的2倍[3]。研究顯示，小鼠Mstn基因cDNA序列中只有一個(gè)開放閱讀框架，共編碼376個(gè)氨基酸。Mstn基因具有TGF-β共有的結(jié)構(gòu)特性，但與家族其他成員的同源性很低，因而被歸為新的一類并命名為生長/分化因子-8(Growth/differentiation factor-8，GDF-8)。同年，研究人員通過基因連鎖，于mh軌跡中發(fā)現(xiàn)牛型Mstn，更好地證明了該基因可能是雙肌型牛(double muscling，DM)產(chǎn)生的重要因素。隨后的研究顯示，比利時(shí)藍(lán)牛Mstn編碼區(qū)外顯子缺失11bp堿基造成移碼突變，從而導(dǎo)致自該堿基缺失后的第14個(gè)密碼子起停止翻譯，而皮埃蒙特牛同區(qū)域G-A錯(cuò)義突變也可導(dǎo)致雙肌型牛的產(chǎn)生[7]。這種現(xiàn)象充分說明Mstn基因在骨骼肌生長發(fā)育中具有重要作用。大鼠、人、綿羊、狒狒等動(dòng)物的Mstn也相繼在后續(xù)研究中被研究并克隆[8]。其中，人的Mstn基因全長約7.7kb，含375個(gè)氨基酸，蛋白分子量為45-55ku，通常形成二聚體復(fù)合物[8]。

2 Mstn基因的基本結(jié)構(gòu)

轉(zhuǎn)化生長因子家族所有成員均含有三個(gè)明顯不同的結(jié)構(gòu)域：氨基端信號(hào)結(jié)構(gòu)域、前肽結(jié)構(gòu)域和C端成熟肽。作為TGF-β超家族中的一員，Mstn屬于激活素/肌肉生長抑制素亞群，與其他成員的成熟結(jié)構(gòu)域信號(hào)有約90%相同性[9]，都有以下顯著特征：1、N端氨基酸有一個(gè)疏水核心；2、C端有RSRR保守性蛋白水解處理信號(hào)；3、C端結(jié)構(gòu)域中有可促進(jìn)“半胱氨酸結(jié)”結(jié)構(gòu)形成的半胱氨酸殘基。Mstn與其超家族其他成員之間的區(qū)別在于該基因C端氨基酸序列相對(duì)更短[10]。Mstn基因在不同物種內(nèi)結(jié)構(gòu)相似，有高度同源性，目前已研究的哺乳動(dòng)物Mstn基因均含有3個(gè)外顯子、2個(gè)內(nèi)含子，除鼠類含有376個(gè)氨基酸殘基，其余已被鑒定的哺乳動(dòng)物均含有375個(gè)氨基酸殘基[4]。

3 Mstn基因在組織中的分布

在哺乳動(dòng)物中，Mstn基因主要在生長期和成熟期的骨骼肌中表達(dá)[8]。不僅骨骼肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Mstn基因，在其他組織中該基因也可發(fā)揮作用。最初的研究顯示，牛和鼠的骨骼肌和脂肪組織中均發(fā)現(xiàn)Mstn基因表達(dá)。隨后的研究表明，Mstn在哺乳動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞、心臟浦肯野纖維及心肌細(xì)胞、脾臟組織、淋巴組織以及胎盤組織中，甚至人類子宮平滑肌和內(nèi)膜細(xì)胞以及腦嗅覺系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞中均有表達(dá)[4，11-13]。這些研究說明Mstn基因不僅可在骨骼肌細(xì)胞中存在，也可存在于哺乳動(dòng)物其他組織中并發(fā)揮作用。研究還發(fā)現(xiàn)，Mstn基因在魚類如羅非魚、大馬哈魚等體內(nèi)有更高的表達(dá)性，在骨骼肌、腮、腸、大腦、眼、性腺等組織中均可被檢測(cè)到，且表達(dá)的時(shí)序性與肌形成順序一致[6]。雞的Mstn基因除存在于骨骼肌之外，在小腸、脾臟、腦等組織中也有少量表達(dá)[8]。

另外，在胎兒和成人心肌中，Mstn均有表達(dá)，且在失代償性心衰患者及先天性心臟病患者心肌細(xì)胞中表達(dá)量顯著增加[14]。肌組織局部缺血后，Mstn蛋白水平顯著上升[15]，研究顯示，在心臟主動(dòng)脈收縮誘導(dǎo)性心肌肥大模型大鼠的體循環(huán)中Mstn水平也有所增加[16]。Mstn在心肌細(xì)胞細(xì)胞系內(nèi)失活與心肌細(xì)胞肥大或心臟重量增加并無關(guān)系，在肌營養(yǎng)不良鼠模型中，該基因也不能降低心肌纖維化的發(fā)生，說明Mstn基因不能作為體內(nèi)心肌纖維生長和再生的主要調(diào)節(jié)劑，從而說明該基因在心肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞中的作用方式不同[17]。

4 Mstn基因在骨骼肌中的表達(dá)

4.1 Mstn基因在哺乳動(dòng)物骨骼肌中的表達(dá) 研究顯示，在人類Mstn蛋白對(duì)培養(yǎng)的鼠類骨骼肌細(xì)胞系的抑制實(shí)驗(yàn)中，較之鼠類該基因的蛋白活性更低,提示在不同動(dòng)物體內(nèi)Mstn的表達(dá)產(chǎn)物具有高度保守性。Mstn在骨骼肌細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)，而Mstn缺如鼠中的肌肉量大量增加則表明肌肉生長抑制素蛋白對(duì)于骨骼肌細(xì)胞而言是一種肌肉特異性負(fù)調(diào)控因子[18]。牛、羊、狗等動(dòng)物體內(nèi)Mstn基因突變導(dǎo)致骨骼肌肌細(xì)胞數(shù)量增加表明該基因在哺乳動(dòng)物體內(nèi)均可表達(dá)其功能。Mstn也參與調(diào)節(jié)成年小鼠的肌群：通過注射中和抗體或拮抗劑可引起該基因抑制，從而導(dǎo)致健康的成年小鼠和肌營養(yǎng)不良的小鼠模型中骨骼肌質(zhì)量增加[3]。因此，研究人員在研究肌萎縮疾病相關(guān)治療中，對(duì)Mstn基因產(chǎn)生濃厚興趣。

作為一個(gè)完整前體，被合成的肌肉生長抑制素蛋白可裂解成一個(gè)氨基末端肽和以分子活化形式存在的羧基末端成熟區(qū)域。在骨骼肌和血液循環(huán)中，肌肉生長抑制素是類似于其自身前肽、卵泡樣抑素-3、潛在TGF-β結(jié)合蛋白等非活躍蛋白復(fù)合物的組分之一[19]。

Mstn基因缺失可誘導(dǎo)肌肉量增加，降低脂肪含量，抑制飲食引起的肥胖。Guo等[19]研究表明大鼠Mstn基因敲除可使肌肉量大量增加，與此同時(shí)葡萄糖利用率增加，胰島素敏感性上升，脂肪含量下降，從而抑制肥胖。

王林嵩等[20]于2005年以EST片段為探針,運(yùn)用Southern 雜交技術(shù)篩選相應(yīng)文庫，對(duì)兔Mstn基因進(jìn)行cDNA克隆，得其全長為1269bp，編碼375個(gè)氨基酸。由于實(shí)驗(yàn)所得兔cDNA克隆產(chǎn)物與人mRNA序列有高度同源性，達(dá)95%，推測(cè)嚙齒類動(dòng)物兔與人的Mstn基因組結(jié)構(gòu)類似。因此，在研究人類骨骼肌Mstn作用的實(shí)驗(yàn)中，可應(yīng)用兔作為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段的材料。另外，家兔Mstn基因中含有多個(gè)蛋白激酶C、酪蛋白激酶、酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)，提示該基因活性可受磷酸化和去磷酸化的調(diào)控。Mstn是骨胳肌生長發(fā)育過程中的負(fù)調(diào)節(jié)因子，已經(jīng)引起生物醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注,研究該基因結(jié)構(gòu)和功能對(duì)于闡明骨胳肌生長發(fā)育與再生的機(jī)理，及認(rèn)識(shí)該基因在此過程中的作用至關(guān)重要。

4.2 Mstn基因表達(dá)在骨骼肌纖維類型轉(zhuǎn)換中的作用 現(xiàn)有研究顯示，一些信號(hào)通路在骨骼肌纖維類型轉(zhuǎn)換中起重要作用，其中包括肌細(xì)胞增強(qiáng)因子-2、Mstn、肌纖維調(diào)節(jié)因子、胰島素樣生長因子、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)、插頭轉(zhuǎn)錄因子-1、促分裂原活化蛋白激酶等。在對(duì)關(guān)于過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(PGC-1α)過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因豬的肌細(xì)胞纖維類型轉(zhuǎn)換的研究中[21]，學(xué)者發(fā)現(xiàn)PGC-1α通過降低Mstn基因表達(dá)水平來調(diào)節(jié)豬體內(nèi)肌纖維類型轉(zhuǎn)換。在該項(xiàng)研究中，PGC-1α過表達(dá)，Mstn水平降低，伴隨特異性肌纖維類型表達(dá)因子肌球蛋白重鏈基因(myosin heavy chain，MHC)中MHC I和MHC IIx顯著上升，MHC IIa水平升高，MHC IIb水平下降。 Mstn基因主要通過肌組織內(nèi)肌分化因子(MyoD)的轉(zhuǎn)錄活化來抑制肌細(xì)胞生長和發(fā)育[22-23]，在纖維類型轉(zhuǎn)換過程中作用顯著。

組織化學(xué)染色中不同肌纖維型的顯色差異為分子生物學(xué)區(qū)別不同肌纖維型提供形態(tài)支撐。根據(jù)肌纖維ATP酶染色顯示，與野生型鼠相比，Mstn敲除鼠的比目魚肌中絕大多數(shù)為快肌II型肌纖維，而慢肌I型纖維水平較低。在對(duì)趾長伸肌進(jìn)行活化琥珀酸脫氫酶染色得知，酵解型肌纖維占絕大多數(shù)，而氧化型肌纖維水平降低。纖維類型分布的差異伴隨著MHC亞型表達(dá)水平的不同。與同窩仔畜野生型相比，在Mstn敲除鼠的比目魚肌和趾長伸肌中，大量MHC II型，即快肌亞型表達(dá)，同時(shí)慢肌纖維類型減少。由此可得知，Mstn基因缺失，可導(dǎo)致快肌酵解型肌纖維大量增生。然而這一肌纖維表型很可能是發(fā)育過程的結(jié)果，而對(duì)成熟個(gè)體進(jìn)行基因抑制并不會(huì)導(dǎo)致肌纖維類型向快肌酵解型轉(zhuǎn)變[24]。因此，Mstn在肌細(xì)胞發(fā)育和分化過程中至關(guān)重要，且決定著肌纖維的表型發(fā)展。

4.3 Mstn基因抑制細(xì)胞生長的作用機(jī)制 為了驗(yàn)證Mstn基因具有抑制肌細(xì)胞生長的作用，研究人員檢測(cè)了重組Mstn基因?qū)π∈蠊趋兰〖?xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)重組蛋白可抑制骨骼肌細(xì)胞增生及DNA和蛋白質(zhì)的合成，從而抑制肌細(xì)胞生長[8]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)Mstn可以抑制細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白表達(dá)，上調(diào)細(xì)胞周期依賴性磷酸轉(zhuǎn)移酶抑制因子，抑制成肌細(xì)胞從G1向S期轉(zhuǎn)化[8]。

另外，Mstn可與多功能生長因子激活素受體結(jié)合，而高濃度的Mstn蛋白前體還可與卵泡抑制素結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)抑制激活素的活性。部分學(xué)者認(rèn)為Mstn可通過與卵泡抑制素相關(guān)基因結(jié)合形成復(fù)合物，競(jìng)爭(zhēng)性抑制其活性，從而抑制肌肉生長[8]。內(nèi)源性Mstn過表達(dá)可降低MyoD蛋白水平，誘導(dǎo)磷酸化發(fā)生改變，使MyoD在成肌細(xì)胞分化周期中的表達(dá)隨之變化。細(xì)胞周期G1期MyoD表達(dá)水平最高，此時(shí)Mstn基因啟動(dòng)子活性較高，推測(cè)Mstn為MyoD下游靶基因，通過調(diào)節(jié)Mstn基因表達(dá)水平可調(diào)控成肌細(xì)胞細(xì)胞周期。

5 Mstn基因的功能

5.1 Mstn基因的信號(hào)傳導(dǎo) 典型的TGF-β家族的信號(hào)傳導(dǎo)由一系列Smad蛋白介導(dǎo)。分泌蛋白Mstn需要通過一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)將其信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞核來發(fā)揮作用。 Mstn基因結(jié)合受體誘導(dǎo)受體調(diào)節(jié)性Smad(R-Smad)蛋白Smad2和Smad3的磷酸化和激活。隨后，磷酸化的R-Smad蛋白與普通型Smad4集合，形成低聚體復(fù)合物，這種聚合物在細(xì)胞核內(nèi)積聚，通過直接或間接與DNA結(jié)合來調(diào)控基因表達(dá)[8]。Mstn基因信號(hào)轉(zhuǎn)錄目標(biāo)至今仍未完全明確。近期研究表明，Mstn基因可以調(diào)節(jié)MyoD表達(dá)，進(jìn)而影響PPARγ，使其在細(xì)胞生成中發(fā)揮作用[25-26]。

C3H10T(1/2)細(xì)胞是一種胚胎源性間質(zhì)母細(xì)胞，通過不同體外條件培養(yǎng)可以分化成多種細(xì)胞系，例如成肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等[10，27]，而Mstn基因可以抑制肌源性細(xì)胞分化潛能，促進(jìn)間葉細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化。Rebbapragada等[28]研究發(fā)現(xiàn)，Mstn基因首先與II型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結(jié)合，隨后，激活素受體樣激酶-4或激活素受體樣激酶-5誘導(dǎo)Smad2或Smad3磷酸化從而促進(jìn)C3H10T(1/2)細(xì)胞成脂分化。

5.2 Mstn基因表達(dá)的調(diào)控 在肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的 Mstn基因中的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子都含有 E-box 結(jié)合序列，但序列不同[2]。啟動(dòng)子作為5’上游基因的一個(gè)重要調(diào)控因子，可以被轉(zhuǎn)錄因子約束從而參與基因表達(dá)的調(diào)控。對(duì)Mstn基因啟動(dòng)子的分析表明，Mstn可受控于多種轉(zhuǎn)錄因子。在豬的體內(nèi)，Mstn啟動(dòng)子活化受肌細(xì)胞增強(qiáng)因子-2的調(diào)控[10]。而牛、羊體內(nèi)，Mstn則受控于生肌決定因子-5、肌細(xì)胞增強(qiáng)因子-2及MyoD[9]。通過對(duì)豬Mstn基因啟動(dòng)子的研究，得知MyoD、PPARγ可正調(diào)控該基因，增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-α、C/EBP-β則可對(duì)其進(jìn)行負(fù)調(diào)控，而地塞米松可誘導(dǎo)Mstn生成[29]。

5.3 Mstn基因?qū)〖?xì)胞生長的影響 絕大部分Mstn表達(dá)于成熟或發(fā)育的肌肉組織中，可通過自分泌或旁分泌形式抑制成肌細(xì)胞增殖和分化，并參與糖類代謝和攝取的調(diào)控[4，30]。在小鼠體內(nèi)目的性消除Mstn基因可導(dǎo)致成年鼠體內(nèi)肌含量近雙倍增長，其中肌纖維數(shù)量和大小均有所增加，且纖維表型向酵解型肌纖維類型轉(zhuǎn)化[1，24]。Mstn缺失型動(dòng)物體內(nèi)肌細(xì)胞肥大增生的表現(xiàn)是否源于肌衛(wèi)星細(xì)胞上肌肉生長抑制素所介導(dǎo)調(diào)控的抑制現(xiàn)象至今尚不明確。雖然部分研究顯示肌肉生長抑制素抑制肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖，然而另一些研究則稱這其中并無關(guān)系[31]。同樣，一些學(xué)者在Mstn缺如的動(dòng)物模型肌肉中發(fā)現(xiàn)大量增生的肌衛(wèi)星細(xì)胞，而另一些人的研究中該細(xì)胞數(shù)量則顯著減少。有關(guān)Mstn基因過表達(dá)或增補(bǔ)的研究顯示，基因水平迅速增加可快速誘導(dǎo)肌萎縮，然而該基因水平緩慢提升則肌含量改善不顯著。相反的，應(yīng)用Mstn抑制性前肽對(duì)鼠進(jìn)行治療可誘導(dǎo)肌肥大[32]。Mstn可參與并激活TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)，激活MAPK等途徑，抑制IGF-AKT和Wnt途徑，各通路協(xié)同作用調(diào)控骨骼肌生長、分化，參與糖類代謝[4]。

5.4 Mstn基因也參與其他組織的調(diào)控 除了主要作用于骨骼肌生長和發(fā)育，Mstn基因還存在于胎兒和成體心臟組織中，參與調(diào)控心肌生長。而心臟器質(zhì)性病變可引起Mstn在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)濃度升高，抑制骨骼肌細(xì)胞的生長和分化，最終導(dǎo)致肌萎縮[4]。研究人員發(fā)現(xiàn)Mstn功能缺失型小鼠可以消耗更多的脂肪能量，脂肪含量減少，脂肪發(fā)生被抑制[33]。體外培養(yǎng)的原代前體黃色脂肪細(xì)胞向黃色脂肪細(xì)胞分化過程可被Mstn基因抑制，提示該基因可促進(jìn)脂肪細(xì)胞能量儲(chǔ)存[34]。另外，該基因還參與骨密度的調(diào)控，特別是在肌肉組織與骨組織粘連部位表現(xiàn)尤為明顯，但研究表明在大齡小鼠體內(nèi)注射Mstn抑制劑propeptide-Fc并不會(huì)增加骨密度和骨強(qiáng)度，只可使肌纖維增大，肌肉重量增加[35]，提示該基因在骨密度的調(diào)控機(jī)制中與年齡有關(guān)。而Hamrick等研究發(fā)現(xiàn)Mstn基因敲除鼠發(fā)生椎間盤退行性變的概率增加[36]，使得該基因在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有了新的研究視角。Mstn還能夠參與雌性哺乳動(dòng)物的生殖調(diào)控，主要影響胎盤的建立和葡萄糖的攝入[4]。

6 展望

目前發(fā)現(xiàn)Mstn基因的功能涉及很多方面，與很多系統(tǒng)性疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)。隨著研究的深入，Mstn基因有廣闊的應(yīng)用前景。例如，Mstn基因參與骨骼肌生長發(fā)育和纖維類型的轉(zhuǎn)換機(jī)制可應(yīng)用于運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)，探究是否有相關(guān)作用靶點(diǎn)可以優(yōu)化運(yùn)動(dòng)員肌肉耐力，也可應(yīng)用于對(duì)肌營養(yǎng)不良性疾病如肌萎縮等的研究和治療。心臟器質(zhì)性病變患者如各種原因?qū)е碌男牧λソ呋蛳忍煨孕呐K病等患者體內(nèi)Mstn水平發(fā)生變化，對(duì)該機(jī)制及Mstn抑制劑的研究可預(yù)防性降低或延緩相關(guān)疾病發(fā)生進(jìn)程。由于年齡、性別、健康狀況等均可影響Mstn基因在各組織中的表達(dá)水平，故隨著研究的深入，Mstn基因可在不同年齡、不同性別和不同健康狀況的人群，對(duì)相關(guān)疾病預(yù)防和治療發(fā)揮重要的指導(dǎo)作用。然而，有關(guān)Mstn基因與相關(guān)疾病的關(guān)系及其作用機(jī)制的還尚待闡明，而且該基因存在多態(tài)性，故Mstn基因的應(yīng)用還需要更多后續(xù)研究。