五味子半仿生提取物改善小鼠睡眠的作用研究

楊彩媚

(漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，漳州 363000)

目前市場(chǎng)上改善睡眠的藥物主要通過(guò)對(duì)相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)產(chǎn)生作用而延長(zhǎng)睡眠時(shí)間，但容易產(chǎn)生比較強(qiáng)烈的依賴性和停藥反應(yīng)，目前仍沒(méi)有較為理想的催眠藥[1]。而中藥及其提取物展現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)。五味子為木蘭科多年生藤本植物五味子的干燥成熟果實(shí)，本品酸、甘、溫，歸肺、心、腎經(jīng)，具有收斂固澀，益氣生津，補(bǔ)腎寧心的作用，用于久嗽、夢(mèng)遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、自汗盜汗、津傷口渴、內(nèi)熱消渴和心悸失眠[2]。半仿生提取法(SBE)是將整體藥物研究法與分子藥物研究法相結(jié)合而創(chuàng)立的一種中藥和方藥提取的新技術(shù)[3,4]，該法模擬胃腸道環(huán)境，采用一定pH值的酸性和堿性水依次提取得到有效成分更高的活性混合物。有文獻(xiàn)報(bào)道，半仿生提取法有效成分提取量?jī)?yōu)于傳統(tǒng)的水、乙醇-水提取法[5-7]。本研究運(yùn)用半仿生法提取原理，考查五味子的半仿生提取物對(duì)小鼠睡眠功能的影響。

1 材料與試藥

pHS-3C型精密pH計(jì)(上海雷磁儀器廠)；BS110 電子天平(德國(guó)賽多利斯公司)；秒表；灌胃針；1 ml注射器等。五味子(江西致和堂藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地遼寧，批號(hào)16001)；戊巴比妥鈉、巴比妥鈉(北京普博斯生物科技有限公司，白色粉末，純度大于99%，批號(hào)3761)；試驗(yàn)用水為蒸餾水，濃鹽酸和氫氧化鈉均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1提取溶劑的配制 參照半仿生原理，模擬人體胃腸道環(huán)境，用水作為提取溶劑，1 mol/L的氫氧化鈉和1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)溶劑的pH值，使pH值分別為2.0、7.5和8.3[7]，備用。

2.2五味子半仿生提取物的制備 取五味子100 g，浸泡30 min，依次加入10倍量的pH值分別為2.0、7.5和8.3的酸水和堿水，常壓下加熱回流提取3次，每次30 min。將三煎提取液粗濾，5 000 r/min離心10 min，合并上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至200 ml，得到0.5 g/ml的五味子半仿生提取物。

2.3動(dòng)物分組與劑量選擇 供試動(dòng)物為ICR小鼠，雄性，160只，體重(20±2)g，由閩侯縣吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCX(閩)20042002。小鼠正常飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分成四組，每組40只。受試樣品設(shè)置低(5倍)、中(10倍)、高(30倍)3個(gè)不同的劑量，分別是4.5、9.0和27.0 g/kg，灌胃30 d，末次給藥后20 min測(cè)定各指標(biāo)。

2.4改善睡眠保健功能的評(píng)價(jià)[8]本實(shí)驗(yàn)依據(jù)衛(wèi)生部《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003 年版)，按照改善睡眠功能檢測(cè)方法，評(píng)價(jià)五味子半仿生提取物對(duì)小鼠睡眠的改善作用。實(shí)驗(yàn)安排晚8點(diǎn)進(jìn)行。

2.4.1直接睡眠實(shí)驗(yàn) 五味子半仿生提取物組每日按時(shí)灌胃，陰性對(duì)照組灌胃給予同等體積的蒸餾水，睡眠以翻正反射消失為指標(biāo)，末次給藥后觀察各組小鼠是否出現(xiàn)睡眠現(xiàn)象，記錄陰性對(duì)照組與五味子給藥組入睡動(dòng)物數(shù)及睡眠時(shí)間。

2.4.2延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn) 通過(guò)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，小鼠100%入睡并且睡眠時(shí)間不會(huì)過(guò)長(zhǎng)的戊巴比妥鈉的劑量為50 mg/kg。戊巴比妥鈉臨用配制，稱取戊巴比妥鈉0.05 g，生理鹽水溶解，定容于10 ml量瓶中，配制成濃度為5 mg/ml戊巴比妥鈉溶液。各組小鼠末次給予不同劑量五味子提取物及蒸餾水20 min后，腹腔注射戊巴比妥鈉。在戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠睡眠的基礎(chǔ)上，以翻正反射消失為指標(biāo)，觀察五味子提取物組能否延長(zhǎng)小鼠的睡眠時(shí)間。

2.4.3戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn) 通過(guò)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，戊巴比妥鈉的最大閾下劑量為30 mg/kg，即使80%～90%小鼠翻正反射不消失的戊巴比妥鈉劑量。戊巴比妥鈉臨用配制，稱取戊巴比妥鈉0.03 g，生理鹽水溶解，定容于10 ml量瓶中，配制成濃度為3 mg/ml戊巴比妥鈉溶液。各組小鼠末次給予不同劑量五味子提取物及蒸餾水20 min后，腹腔注射戊巴比妥鈉最大閾下催眠劑量，記錄30 min內(nèi)入睡小鼠數(shù)(翻正反射消失達(dá)60 s以上者)，計(jì)算睡眠發(fā)生數(shù)。

2.4.4巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn) 通過(guò)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，小鼠100%入睡并且睡眠時(shí)間不會(huì)過(guò)長(zhǎng)的巴比妥鈉劑量為300 mg/kg。巴比妥鈉臨用配制，稱取巴比妥鈉0.3 g，取適量生理鹽水溶解，定容于10 ml量瓶中，配制成濃度30 mg/ml巴比妥鈉溶液。各組小鼠末次給予不同劑量五味子提取物及蒸餾水20 min后，腹腔注射巴比妥鈉，以翻正反射消失為指標(biāo)，觀察睡眠潛伏期(從巴比妥鈉注射開(kāi)始，至小鼠翻正反射消失達(dá)60 s的這段時(shí)間為睡眠潛伏期)。

2.4.5數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，分析差異顯著性。

3 結(jié)果

3.1五味子半仿生提取物對(duì)小鼠的直接睡眠實(shí)驗(yàn) 各組小鼠分別給予受試物和蒸餾水后，觀察60 min，給藥組與陰性對(duì)照組均無(wú)睡眠現(xiàn)象，翻正反射存在。小鼠活動(dòng)正常，精神狀態(tài)正常，說(shuō)明五味子半仿生提取物沒(méi)有直接催眠的功能，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同組別小鼠直接睡眠實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2五味子半仿生提取物對(duì)延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間的影響 與陰性對(duì)照組相比，各給藥組均能明顯延長(zhǎng)小鼠的睡眠時(shí)間，與陰性對(duì)照組比差異顯著(P<0.05)。表明五味子半仿生提取物各劑量組與戊巴比妥鈉有協(xié)同作用。結(jié)果見(jiàn)表2。

3.3五味子半仿生提取物對(duì)巴比妥鈉閾下劑量催眠的影響 各給藥組均不能明顯增加小鼠在30 min內(nèi)的入睡率，與陰性對(duì)照組相比差異性不顯著。結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 不同組別對(duì)延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間的影響

注：與陰性對(duì)照組比較*P<0.05

表3 不同組別對(duì)戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)的影響

3.4五味子半仿生提取物對(duì)巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響 五味子半仿生提取物各劑量組均能明顯縮短小鼠睡眠潛伏期，與陰性對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同組別對(duì)巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響

4 討論

五味子是一種十分珍貴的中藥材，因其具有良好的藥用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，不僅在臨床上廣泛使用，在民間也常常作為養(yǎng)生保健品。我國(guó)五味子資源豐富，因此具有極強(qiáng)的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)價(jià)值。

本研究首次以半仿生提取法提取五味子中的活性成分，以活性混合物進(jìn)行改善小鼠睡眠作用的研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，五味子半仿生提取物各劑量組(5倍、10倍、30倍)均能延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間，能明顯縮短小鼠巴比妥鈉睡眠潛伏期，并且沒(méi)有直接睡眠作用。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003版)[8]，表明五味子半仿生提取物各劑量組均具有改善睡眠的作用。遺憾的是本實(shí)驗(yàn)根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》中的要求以10倍劑量作為中間劑量，選取了5倍、30倍作為低、高劑量設(shè)置了劑量梯度，而實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示這3個(gè)劑量組之間并沒(méi)有顯著的差異性，應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步的摸索和探討。本研究采用半仿生提取的方法，符合中醫(yī)中藥綜合成分相互作用的特點(diǎn)，提取方法更加簡(jiǎn)便，縮短了生產(chǎn)周期，節(jié)約成本。從理論上講，該提取物已經(jīng)經(jīng)歷了胃腸道有關(guān)酶的生物轉(zhuǎn)化，生物活性增強(qiáng)，可以作為口服制劑以及保健品的生產(chǎn)原料，為五味子提取物改善睡眠保健品的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。而對(duì)于五味子半仿生提取物中的成分以及改善睡眠的作用機(jī)制，還有待于進(jìn)一步深入研究。

1 趙世晶,孫渠.鎮(zhèn)靜催眠藥物的研究進(jìn)展[J].黑龍江科技信息,2014，15:72

2 中國(guó)藥典[S].一部.2015:66-67

3 張兆旺,孫秀梅.試論“半仿生提取法” 制備中藥口服制劑[J].中國(guó)中藥雜志, 1995,20(11)：670-673

4 孫秀梅,張兆旺.建立中藥用“半仿生提取”研究的技術(shù)平臺(tái)[J].中成藥,2006,28(4): 614-616

5 郭志紅,周鴻立. 玉米須多糖和黃酮的半仿生提取及抗氧化活性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43(4):273

6 張慧,譚秋龍,黎行山,等.結(jié)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化復(fù)方金錢草中君藥的半仿生提取工藝[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào),2013,29(1):29-34

7 王蕙,付燕,郎久義,等.酶法及半仿生法提取銀杏黃酮的工藝研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2009,11(2):146-148

8 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范[M].北京:清華同方電子出版社(3版),2003:81-83