miR—155在腎癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

劉泰榮 陳華 宋樂明

[摘要]目的 探討miR-155在腎癌組織中的表達(dá)及臨床意義。方法 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量（RT-PCR）技術(shù)檢測21例腎癌組織及配對癌旁正常腎臟組織標(biāo)本中miR-155的表達(dá)水平，并分析與腎癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系。結(jié)果 腎癌組織中miR-155表達(dá)為（12.63±6.22），明顯高于癌旁正常腎組織的（2.71±1.38）（P<0.01）；腎癌組織中miR-155表達(dá)與臨床分期、分化程度、性別、年齡及腫瘤直徑無關(guān)（P>0.05）。結(jié)論 腎癌患者癌組織中的miR-155的表達(dá)較癌旁正常組織明顯增高，但其表達(dá)水平與腎癌的病理分級和臨床分化程度無明顯相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞]腎癌；miR-155；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；表達(dá)

[中圖分類號] R737.11 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）10（a）-0082-03

[Abstract] Objective To investigate the expression and clinical significance of miR-155 in renal cell carcinoma. Methods Real-time quantitative analysis （RT-PCR） was used to detect the expression of miR-155 in 21 renal cell carcinoma tissues and matched normal renal tissues. The relationship between its expression and clinicopathological parameters of renal cell carcinoma was analyzed. Results The expression of miR-155 in renal cell carcinoma was （12.63±6.22）， which was significantly higher than that in adjacent normal renal tissues， （2.71±1.38） （P<0.01）. The expression of miR-155 in renal cell carcinoma was not related with the clinical stage， degree of differentiation， gender， age， or tumor diameter （P>0.05）. Conclusion The expression of miR-155 in cancer tissues in patients with renal cell carcinoma is significantly higher than that in adjacent normal tissues， but without correlation of the pathological grade or clinical differentiation of renal cell carcinoma.

[Key words] Renal cancer； MiR-155； Real-time fluorescent quantitative PCR； Expression

腎癌又稱腎細(xì)胞癌，是起源于腎實(shí)質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)的惡性腫瘤，占腎臟惡性腫瘤的80%，占成人惡性腫瘤的2%～3%，在我國腎癌發(fā)病率僅次于膀胱癌，居泌尿系統(tǒng)瘤第2位，在過去20年里發(fā)病率以每年2.5%的速度遞增，并向低齡化發(fā)展，每年大約有2.7萬例新發(fā)病例，11萬例患者死于該病[1-2]。腎癌目前依然以手術(shù)治療為主，常規(guī)放化療鋪助治療，但均不能取得令人滿意的效果。血尿、疼痛和包塊是腎癌的主要癥狀，50%～60%的患者在發(fā)病初期無明顯癥狀，在癥狀出現(xiàn)或確診時(shí)已近中晚期，已錯(cuò)過治療最佳時(shí)機(jī)[3-4]。因此尋找靈敏度高、特異性好的標(biāo)志物輔助臨床診斷并評估病情嚴(yán)重程度，對改善患者預(yù)后，提高患者生存率具有重要意義[5-6]。MicroRNAS（miRNAs）是一類重要的非編碼RNA，最先由Lee等于1993年在線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，廣泛存在于動、植物中，可通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)蛋白編碼基因的表達(dá)，如通過降解或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮作用。越來越多的證據(jù)表明[7-8]，許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與miRNAs的表達(dá)相關(guān)，如Juan等[9]研究發(fā)現(xiàn)多種miRNA在腎細(xì)胞癌中表達(dá)異常，其中miR-155在腎癌細(xì)胞中高表達(dá)。但是目前關(guān)于miR-155與腎癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)報(bào)道較少。本研究采用實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）的方法檢測腎癌組織及癌旁正常腎組織中miR-155的表達(dá)，探討miR-155在腎細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1資料與方法

1.1一般資料

選取贛州市人民醫(yī)院泌尿外科2016年1～6月收治的21例行腎癌治療患者的腎癌及距離腎癌3～5 cm的癌旁正常腎組織標(biāo)本。樣本均預(yù)留2份，其中一份離體10 min內(nèi)放液氮灌中凍存，以防RNA裂解；另一份放于福爾馬林溶液中保存，用于病理診斷。本研究21例患者中男13例，女8例；年齡36～71歲，中位年齡52歲。所有患者臨床病理學(xué)資料完整，術(shù)前均未行放化療，術(shù)前檢查確定無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

1.2主要試劑

Trizol、逆轉(zhuǎn)錄酶及二硫代蘇糖醇（DTT，購自美國Qiagen公司）；隨機(jī)引物、dNTP、HS ExTaq酶等（購自日本Takara公司）；Calibration、SYBR I（購自美國Bio.Rad公司）；RNasin（購自美國Promega公司）；引物則由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3總RNA提取及檢測

樣本切成薄片，在液氮中碾碎至粉狀，按Trizol試劑說明書提取總RNA，DEPC處理過的蒸餾水溶解。瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA的完整性。

1.4 miR-155表達(dá)分析

miR-155的正向特異性引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGGGCA ATTCAGTTG AGCCCCTACT -3′。1 μg總RNA以莖環(huán)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為：25℃ 10 min，42℃ 60 min，52℃ 15 min，70℃ 15 min，反應(yīng)結(jié)束后-20℃保存。PCR擴(kuò)增上游引物為：5′- TGCCTCCAACTGACTCCTAC-3′，下游引物為：5′-GCGAGCACAGAATAATACGAC-3′，PCR擴(kuò)增條件為：95℃變性5 min后，95℃ 30 s，60℃ 30 s，68℃ 30 s，22個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物大小63 bp。U6內(nèi)參PCR以oligo dT逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，U6上游引物為5′-CTCGC TTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGC TTCAC GAATTTGCGT-3′。PCR擴(kuò)增 條件為：95℃變性5 min后，95℃ 30 s，56℃ 30 s， 68℃ 30 s，25個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物大小94 bp。RT-PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min變性；95℃15 s，60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。設(shè)立3個(gè)復(fù)孔、記錄反應(yīng)管中的熒光信號到達(dá)所設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（Ct值），設(shè)定U6為內(nèi)參照，采用定量PCR中的相對定量法測定相對表達(dá)量，其中ΔCt=（CtmiR155-CtU6）。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，腎癌組織與癌旁正常組織miR-155的表達(dá)比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，不同病理特征中表達(dá)比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1腎癌組織與癌旁正常組織miR-155表達(dá)的比較

21例腫癌組織中的miR-155的相對表達(dá)量為2.17～24.85，平均（12.63±6.22），顯著高于癌旁正常組織的（2.82±1.25），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.521，P=0.016）。

2.2不同病理特征表達(dá)的比較

miR-155的表達(dá)與臨床分期、分化程度、性別、年齡及腫瘤直徑無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

3討論

腎臟位于人體隱蔽位置，且早期腎癌體積較小，癥狀多不典型腎臟病變早期不易發(fā)現(xiàn)，根據(jù)癥狀診斷較為困難，約1/3的患者初次診斷時(shí)已經(jīng)擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移[10-11]。腎癌的生物學(xué)行為及特征較為復(fù)雜，其發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚未完全明確，目前主要考慮腎細(xì)胞癌的危險(xiǎn)因素包括吸煙、肥胖、職業(yè)、城鄉(xiāng)和文化經(jīng)濟(jì)狀況、飲酒和食物、放射和藥物及其他慢性腎病患者等[12-13]。腎癌缺乏有效的治療措施，預(yù)后不理想，患者5年生存率不足10%，局限性腎癌首選外科手術(shù)治療，根治性切除術(shù)已被公認(rèn)可能治愈腎癌，然而對于局部進(jìn)展性腎癌，手術(shù)后仍有1/3患者會發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，此類患者難以通過外科手術(shù)延長生存期，傳統(tǒng)放化療亦不敏感，對于轉(zhuǎn)移的患者，以內(nèi)科治療為主，免疫療法作為內(nèi)科治療中最為有效的治療方式，具有增強(qiáng)免疫和抗腫瘤的效果，但價(jià)格昂貴且毒副作用大[14]。因此對于腎癌發(fā)生、發(fā)展過程中關(guān)鍵基因的研究，尋找可能存在的腎癌分子治療靶點(diǎn)，具有非常重要的意義。

micorRNA是近年研究熱點(diǎn)，是一種長度為21～25 nt，具有基因調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼小RNA，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)，microRNA作為一種重要的轉(zhuǎn)錄后因子參與了腫瘤相關(guān)基因的調(diào)控[17-18]。而miR-155作為micorRNA家族中的一員，是較早被證實(shí)具有促癌作用的miRNA之一，在大多數(shù)血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實(shí)體瘤中均呈高表達(dá)，如白血病、胰腺癌等[19-20]。在腎細(xì)胞癌中，miR-155的表達(dá)異常升高[21-22]，但對于miR-155是否參與腎癌的發(fā)生、發(fā)展過程及在腎癌中的作用機(jī)制，目前相關(guān)研究較少。

本研究采用RT-PCR技術(shù)檢測腎癌及癌旁正常組織中miR-155的表達(dá)，結(jié)果顯示，在腎癌組織中miR-155表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此推測miR-155的過度表達(dá)可能與腎癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，同時(shí)也為腎癌的早期診斷、預(yù)后評估以及治療提供了一定依據(jù)，進(jìn)一步深入分析發(fā)現(xiàn)，miR-155的表達(dá)與腎癌的病理分級、分化程度、腫瘤大小、年齡等均無關(guān)。提示miR-155表達(dá)可能與腎癌病理分級及臨床分化程度及腫瘤大小均無明顯關(guān)系。但是由于本實(shí)驗(yàn)樣本量不大，因此尚不能肯定miR-I55的表達(dá)與的病理分級、臨床分化程度無關(guān)。同時(shí)本研究中患者術(shù)前通過影像學(xué)檢查未查出淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，術(shù)中也沒有檢出局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，今后研究需加大樣本，進(jìn)一步完善此類不足。

miR-155在腎癌組織中表達(dá)含量升與那些因素的相關(guān)，以及miR-155表達(dá)升高后通過調(diào)控那些因子來影響腎癌的發(fā)生、發(fā)展是下一步的研究重點(diǎn)。可以預(yù)見，當(dāng)能夠闡明miRNA參與腎癌的發(fā)生過程，分析腎癌發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制，將會對腎癌的診療起重要作用，也將帶來更廣闊的臨床應(yīng)用前景。

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（收稿日期：2018-05-18 本文編輯：崔建中）