BZR1基因表達(dá)模式分析

孫安南

摘 要：花藥是被子植物產(chǎn)生雄性配子體的重要生殖器官，它的正常發(fā)育對植物的繁衍和傳代非常重要。而植物生長發(fā)育的每一個階段，從種子萌發(fā)到開花結(jié)果，都受到體內(nèi)激素的調(diào)控。目前，包括生長素在內(nèi)的六大植物激素及其相應(yīng)的信號調(diào)控通路參與調(diào)控植物生長發(fā)育過程的功能和機(jī)制研究已經(jīng)被廣泛報道。其中，蕓苔素（brassinosteroids， BRs）是植物中一種促進(jìn)生長的甾體激素，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中的相關(guān)遺傳學(xué)研究奠定了BR在植物發(fā)育過程中的重要地位，BR合成以及信號傳導(dǎo)通路的相關(guān)基因也被報道在植物營養(yǎng)生長、葉片發(fā)育、開花、光形態(tài)建成以及雄性生殖等過程中發(fā)揮重要作用。目前，這些基因參與調(diào)控花藥發(fā)育背后的具體機(jī)制尚不清晰。我們通過運用mRNA原位雜交的方法分析了蕓苔素信號通路中編碼了轉(zhuǎn)錄因子的重要基因BZR1在擬南芥不同發(fā)育時期的花藥中的表達(dá)模式，為BR信號通路調(diào)控雄蕊發(fā)育的機(jī)制研究提供了新的認(rèn)識和重要的參考。

關(guān)鍵詞：擬南芥；花藥；蕓苔素；BZR1；轉(zhuǎn)錄因子

中圖分類號：Q789 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1671-2064（2017）23-0199-04

雄性生殖在開花植物繁衍傳代的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，對農(nóng)作物的產(chǎn)量有重要的影響。雄性不育是指植物體中雄蕊發(fā)育由于受到內(nèi)、 外因素的影響而發(fā)育不正常的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象會嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量。研究植物雄性生殖器官花藥的正常發(fā)育過程以及揭示參與調(diào)控這一過程的重要基因的功能，對于我們通過遺傳改良來增加糧食等作物的產(chǎn)量由重要的意義。

擬南芥植株小且產(chǎn)生的種子多，非常適合作為模式植物來進(jìn)行遺傳學(xué)研究。擬南芥是十字花科植物，擁有六個雄蕊，四長兩短，四個較長的雄蕊被稱為四強(qiáng)雄蕊。雄蕊由花絲和花藥兩部分組成。根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征，前人將擬南芥花藥的發(fā)育過程總共分成14個階段：發(fā)育到第5期時，具有四角結(jié)構(gòu)的花藥原基孢子體細(xì)胞開始分化形成了由表皮層、內(nèi)皮層、中間層、絨氈層，這四層體細(xì)胞包圍小孢子母細(xì)胞形成了花藥的典型的蝴蝶狀結(jié)構(gòu)。第6-7期，小孢子母細(xì)胞經(jīng)過減數(shù)分裂形成單倍體小孢子的四分體，四分體被胼胝質(zhì)層包裹。花藥發(fā)育進(jìn)入第8期時，胼胝質(zhì)酶復(fù)合體降解了胼胝質(zhì)層，小孢子從四分體中釋放出來，孢粉素等物質(zhì)隨著絨氈層的降解，積聚到花粉母細(xì)胞表面，慢慢形成花粉壁。在第9到12期，經(jīng)過兩次有絲分裂，三核的花粉粒形成；此后，花藥開裂，成熟花粉釋放。

在擬南芥中，絨氈層是一層特殊的細(xì)胞層，該類細(xì)胞內(nèi)含較多的RNA和蛋白質(zhì)，并有油脂和類胡蘿卜素等營養(yǎng)物質(zhì)，為花粉粒發(fā)育提供了所需養(yǎng)料和信號分子。在花藥的正常的發(fā)育中，絨氈層細(xì)胞分裂、分化成體細(xì)胞層，包圍花粉母細(xì)胞（PMCs），絨氈層細(xì)胞的形成對成熟花粉的形成和釋放有直接的作用，因此直接決定了雄蕊的育性，進(jìn)而影響植株的雄性育性。在花藥發(fā)育的第5期，各層細(xì)胞命運決定后，絨氈層細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)與其他孢子體細(xì)胞并沒有明顯的差異。而在減數(shù)分裂期間，絨氈層細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)則變得濃密，其中充滿了核糖體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等等，顯示其代謝高度活躍。減數(shù)分裂完成后，小孢子外的胼胝質(zhì)在絨氈層分泌的胼胝質(zhì)酶作用下降解，小孢子從四分體中釋放出來并開始發(fā)育成熟，而絨氈層進(jìn)一步特化為海綿狀的細(xì)胞，分泌小泡釋放小孢子發(fā)育所需要的蛋白質(zhì)、脂類及其他營養(yǎng)物質(zhì)。在花粉第一次有絲分裂完成 時，絨氈層細(xì)胞開始降解，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞殘余與脂體釋放到花粉表面成為對花粉粘著和信號識別很重要的花粉包被。

近些年國內(nèi)外以擬南芥為材料，在花藥發(fā)育過程中的分子調(diào)控機(jī)制研究取得了一定的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)了多個雄性不育的突變體并克隆了相關(guān)基因，包括重要的轉(zhuǎn)錄因子如：DYT1、AMS和TDF1。DYT1在花藥發(fā)育的第5期和第6期有較高的特異表達(dá)，dyt1突變體絨氈層細(xì)胞出現(xiàn)提前的異?？张莼?，向藥室內(nèi)部擠壓且無法順利降解，生殖細(xì)胞不能發(fā)育形成成熟花粉粒。TDF1編碼一個在絨氈層、減數(shù)分裂細(xì)胞以及小孢子細(xì)胞中高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，TDF1突變后，突變體花藥的絨氈層細(xì)胞無法進(jìn)一步分化并分泌胼胝質(zhì)酶，從而導(dǎo)致小孢子母細(xì)胞的提前降解。AMS編碼了對于花藥絨氈層與減數(shù)分裂后小孢子發(fā)育至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子，在ams突變體中，絨氈層細(xì)胞在四分體被釋放后出現(xiàn)空泡化，小孢子在四分體時期后逐漸降解。

蕓苔素最早由Michelle于1970年發(fā)現(xiàn)，他從油菜（Brassica napus）花粉中提取出了一種能促進(jìn)植物莖桿伸長和細(xì)胞分裂的高活性物質(zhì)，將其稱為蕓苔素（brassinolide，BL），蕓苔素可以強(qiáng)烈誘導(dǎo)細(xì)胞的生長和分化，此后，具有與BL相似結(jié)構(gòu)和活性的甾體分子不斷被發(fā)現(xiàn)，統(tǒng)稱為蕓苔素甾醇（brassinosteroids，BRs）。隨后，在擬南芥中，大量BR 相關(guān)的突變體被發(fā)現(xiàn)，BR在發(fā)育中的功能也逐漸清晰。目前，我們已經(jīng)研究證明了BR信號通路相關(guān)的基因參與調(diào)控植物營養(yǎng)生長、葉片發(fā)育、開花、光形態(tài)建成以及雄性生殖過程。BR被認(rèn)為是廣泛調(diào)控如細(xì)胞伸長、維管分化、根生長、對光的反應(yīng)、抗逆、衰老等發(fā)育過程和生理過程的基本激素之一。這些基因除了編碼了受體蛋白激酶的BR INSENSITIVE 1（BRI1）、編碼擬南芥糖原合酶激酶3（GSK3）樣激酶的BR INSENSITIVE 2（BIN2）等外，還包括編碼轉(zhuǎn)錄因子的BZR1（BRASSINAZOLE RESISTANT 1）等。進(jìn)一步的生物化學(xué)研究將這些組分整合起來，形成了一條連接從BR在細(xì)胞表面的感知到細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子激活的磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，即BR信號通路。

BR影響植物雄性育性，而BZR1是BR調(diào)控下游基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，但目前并未有BZR1在花藥發(fā)育過程中所發(fā)揮功能的研究報道。要了解基因功能，首先我們需要從目的基因的表達(dá)水平和模式研究入手，原位雜交（In situ Hybridization）是一種從細(xì)胞學(xué)角度研究基因表達(dá)水平和模式的有效的分子生物學(xué)技術(shù)，用原位雜交技術(shù)來探討植物基因的時空表達(dá)研究是一種重要且成熟的研究手段。因此確定BZR1基因在不同發(fā)育時期的花藥中的表達(dá)模式，可以為我們進(jìn)一步了解BZR1在花藥中可能發(fā)揮的分子功能提供線索，從而為從遺傳上提高植物育性、增加作物產(chǎn)量提供一定的理論依據(jù)，無疑是必要且具創(chuàng)新性的。endprint

1 材料與方法

1.1 植物材料和植物培養(yǎng)

本研究所用到的擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）野生型（Col-0）植株材料為哥倫比亞（Columbia）生態(tài)型背景。擬南芥植物種子點播在PH值為5.8的1/2MS培養(yǎng)基上，4℃處理48h后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)箱（16h光照8h黑暗），7天后將幼苗移栽至培養(yǎng)土中繼續(xù)生長，溫室的生長條件為：22攝氏度、濕度為65%、光周期為16h/8h（光/暗）。

1.2 植物總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

首先取擬南芥花序，放入在1.5ml的離心管中，用液氮冷凍后研磨，待細(xì)胞組織破碎后加入1mL的Trizol試劑，劇烈震蕩15秒，在室溫靜置15分鐘。隨后再加入200微升的氯仿，震蕩混勻后靜置2分鐘，在4攝氏度以12000g轉(zhuǎn)速離心15分鐘，移取上層清液，轉(zhuǎn)入新的1.5毫升的離心管中。加入等體積的異丙醇，顛倒混勻后，在-20攝氏度沉淀1小時。4攝氏度低溫12000g 離心15分鐘，棄上清，加入1mL 75%的乙醇清洗沉淀。7000g轉(zhuǎn)速離心5分鐘，去除上清溶液后開蓋風(fēng)干，加入適當(dāng)體積的RNase-free水溶解RNA。

測量所提RNA溶液A260nm、A280nm吸光值，計算A260nm/A280nm以衡量總RNA純度。

使用TAKARA公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒對RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。先使用gDNA Eraser酶在42攝氏度下消除所提RNA中混雜的基因組DNA。隨后使用反轉(zhuǎn)錄酶于37攝氏度將RAN反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.3 原位雜交探針的制備

在NCBI網(wǎng)站上搜索BZR1基因的cDNA序列，找到特異性高的序列區(qū)段（400bp）左右，針對這一序列設(shè)計探針引物。然后以擬南芥花序cDNA為模板，擴(kuò)增探針序列，用T4連接酶連接至pGEM-T載體（Promega公司），連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，使用氨芐抗性平板篩選陽性克隆，提質(zhì)粒測序，測序結(jié)果正確者進(jìn)一步進(jìn)行質(zhì)粒酶切（分別用Apa1酶和Spe1酶進(jìn)行單酶切），酶切產(chǎn)物用SP6及T7轉(zhuǎn)錄酶分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后的RNA產(chǎn)物經(jīng)過純化后即為反義及正義探針。

1.4 石蠟切片的制備

用RNase Free的FAA固定液對Col-0花序進(jìn)行固定，講過低溫抽真空后，花序材料完全浸透于固定液中，換新鮮的FAA固定液后4攝氏度低溫靜置過夜。用50%、60%、70%、80%、90%、95%及100%的梯度濃度的酒精進(jìn)行材料脫水處理，再用25%、50%、75%及100%的二甲苯梯度濃度溶液進(jìn)行透明化處理，逐步加入蠟片，直至材料完全置入100%純蠟中。包埋蠟塊，并用石蠟切片機(jī)進(jìn)行花序組織的切片。

1.5 原位雜交實驗

對石蠟切片進(jìn)行脫蠟覆水，在37攝氏度條件下用蛋白酶K對切片上的花序細(xì)胞組織的骨架蛋白進(jìn)行消化，經(jīng)過逐級脫水后每張片子加探針（50%甲酰胺，300mmoL/L NaCl，10mmoL/L Tris，1mmoL/L EDTA，1% Blocking Reagent），42攝氏度雜交過夜，次日依次用2×SSC溶液、0.5×SSC溶液、0.2×SSC溶液洗片，RNase消化30min，0.2×SSC溶液、PBS洗片，Blocking Reagent封閉1h，BSA封閉1h，抗-DIG-AP偶聯(lián)二抗2h，NBT-BCIP顯色，光鏡下待顯色程度合適后中止反應(yīng)，封片觀察，拍片。

2 實驗結(jié)果

2.1 BZR1基因探針序列PCR

我們以擬南芥花序cDNA為模板，用正向引物（TCTAAGAACCCGAAACCGTT）和反向引物（TGTATCCTCTCTCCTTCCCAG）來對BZR1基因的特異序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳（圖1），以Trans 2k plus（全式金公司）DNA marker為指示，可見大小為600bp左右，與目的片段大小一致。

2.2 轉(zhuǎn)錄探針的檢測

用Roche公司的DIG轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行BZR1基因的探針轉(zhuǎn)錄，正反義探針經(jīng)過電泳檢測，均顯示出明亮的RNA條帶（圖2），證明探針合成過程正常，可用于原位雜交實驗。

2.3 BZR1基因在花藥絨氈層及花粉母細(xì)胞中特異表達(dá)

為了進(jìn)一步明確BZR1基因在花藥發(fā)育過程中的時空表達(dá)模式，本研究通過原位雜交的方法檢測了該基因在花藥4-12期的表達(dá)模式。

結(jié)果如圖3所示。

BZR1基因從花藥第5期開始在花粉母細(xì)胞和絨氈層中表達(dá)，信號持續(xù)至第8期開始減弱，隨著絨氈層的降解，信號逐漸減弱，最后完全消失。BZR1在花藥絨氈層及孢子母細(xì)胞中的表達(dá)模式暗示了其可能在花藥發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。

3 討論

原位雜交的結(jié)果顯示BZR1基因在花藥細(xì)胞中有表達(dá)，說明BZR1在其發(fā)育過程中可能發(fā)揮著重要的作用。BZR1基因表現(xiàn)出了較高的表達(dá)豐度，在花藥發(fā)育中、晚期（5-9期）顯示了一定的表達(dá)水平，且主要在絨氈層細(xì)胞中表達(dá)。絨氈層細(xì)胞對花藥的發(fā)育至關(guān)重要，因此我們可以推測BZR1基因可能主要通過參與調(diào)控花藥絨氈層細(xì)胞的發(fā)育來發(fā)揮其在雄性生殖方面的功能。

生命個體的遺傳信息經(jīng)歷從DNA轉(zhuǎn)錄為RNA，再進(jìn)一步翻譯成各種功能蛋白的過程，最后執(zhí)行相應(yīng)的生物學(xué)功能。僅mRNA水平的表達(dá)分析無法反映基因在翻譯水平的情況，因此，想要更多地了解BZR1基因參與雄性生殖過程的調(diào)控機(jī)制，在本研究的成果，還需要進(jìn)行更為深入的蛋白質(zhì)表達(dá)水平及功能分析。

參考文獻(xiàn)

[1]Bedinger， P.A.， Hardeman， K.J.， and Loukides， C.A. （1994）. Travelling in style： the cell biology of pollen[J]. Trends Cell Biol. （4）， 132-138.endprint

[2]Blackmore， S.， Wortley， A.H.， Skvarla， J.J.， and Rowley， J.R. （2007）. Pollen wall development in flowering plants. New Phytol[J]. （174）， 483-498.

[3]Goldberg， R.B.， Beals， T.P.， and Sanders， P.M. （1993）. Anther development： basic principles and practical applications[J]. Plant Cell （5）， 1217-1229.

[4]Sorensen， A.M.， Krber， S.， Unte， U.S.， Huijser， P.， Dekker， K.， and Saedler， H. （2003）. The Arabidopsis ABORTED MICROSPORES （AMS） gene encodes a MYC class transcription factor[J]. Plant J. （33）， 413-423.

[5]Ye， Q.， Zhu， W.， Li， L.， Zhang， S.， Yin， Y.， Ma， H.， and Wang， X. （2010b）. Brassinosteroids control male fertility by regulating the expression of key genes involved in Arabidopsis anther and pollen development[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA （107）， 6100-6105.

[6]Zhang， W.， Sun， Y.， Timofejeva， L.， Chen， C.， Grossniklaus， U.， and Ma， H. （2006）. Regulation of Arabidopsis tapetum development and function by DYSFUNCTIONAL TAPETUM1 （DYT1） encoding a putative bHLH transcription factor[J]. Development （133）， 3085-3095.

[7]Zhu， J.， Chen， H.， Li， H.， Gao， J.， Jiang， H.， Wang， C.， Guan， Y.， and Yang， Z. （2008）. Defective in Tapetal Development and Function 1 is essential for anther development and tapetal function for microspore maturation in Arabidopsis[J]. Plant J. （55）， 266-277.

[8]Zinkl， G.M.， Zwiebel， B.I.， Grier， D.G.， and Preuss， D. （1999）. Pollen-stigma adhesion in Arabidopsis： a species-specific interaction mediated by lipophilic molecules in the pollen exine[J]. Development （126）， 5431-5440.endprint