骨肉瘤中EGFR、HER-2的表達(dá)及其臨床意義

秦曉飛，張勇勇，陳文吉，韓 志

骨肉瘤是全球青少年最常見的骨原發(fā)惡性腫瘤，由于轉(zhuǎn)移和化療抵抗，骨肉瘤患者預(yù)后較差。廣泛的腫瘤切除，新輔助放、化療使骨肉瘤患者存活率有顯著改善，但5年生存率仍保持15%～30%[1]。尋找判斷腫瘤的預(yù)后或?qū)εR床治療具有指導(dǎo)意義的分子標(biāo)記并進(jìn)行選擇性靶向治療，對(duì)提高骨肉瘤治療的效果有重要意義。兩者作為肺癌、乳腺癌、胃癌等靶向治療的靶點(diǎn)及化療耐藥相關(guān)的基因得到廣泛深入的研究，并已應(yīng)用于臨床。本文檢測(cè)骨肉瘤中EGFR、HER-2的表達(dá)，分析EGFR、HER-2在骨肉瘤中的作用及其與臨床病理特征的關(guān)系，旨在為骨肉瘤的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1臨床資料收集2009年1月～2016年12月河南省洛陽正骨醫(yī)院收治的骨肉瘤45例，其中男性27例，女性18例，年齡10～64歲，平均28歲，中位年齡20.5歲，病程15天～18個(gè)月；組織學(xué)類型：低級(jí)別骨肉瘤8例(髓內(nèi)高分化骨肉瘤5例、皮質(zhì)旁骨肉瘤3例)，普通型骨肉瘤37例。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)術(shù)前病理穿刺確診為骨肉瘤；(2)穿刺前未經(jīng)放、化療及藥物治療；(3)在我院擬采取新輔助化療后手術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有除骨肉瘤以外的其他惡性腫瘤；(2)合并嚴(yán)重的心肝腎等系統(tǒng)性疾病。本實(shí)驗(yàn)獲醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，患者均知情同意。另收集37例骨肉瘤患者腫瘤周圍正常骨組織作為對(duì)照。

1.2試劑兔抗人單克隆抗體EGFR、HER-2及EnVision法檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自福州邁新公司。

1.3方法活檢的腫瘤組織均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，包埋石蠟，4 μm厚連續(xù)切片，脫蠟水化；磷酸鹽緩沖液沖洗，滴加EGFR、HER-2一抗，4 ℃過夜；磷酸緩沖液沖洗，滴加二抗，37 ℃孵育20 min；磷酸緩沖液沖洗，DAB顯色；自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水透明，封固。

1.4結(jié)果判斷EGFR陽性表達(dá)于胞膜或胞質(zhì)，HER-2陽性表達(dá)于胞膜，陽性信號(hào)均為淡黃色至棕褐色。結(jié)果判讀采用半定量計(jì)分法，即染色強(qiáng)度結(jié)合陽性腫瘤細(xì)胞百分比綜合評(píng)分。按染色強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)計(jì)分：細(xì)胞弱著色，即陽性信號(hào)在400倍視野下可見但在低倍視野下不清晰為1分；細(xì)胞中度著色，即陽性信號(hào)在40倍視野下清晰可見為2分；細(xì)胞強(qiáng)著色，即陽性信號(hào)在40倍視野下清晰可見為3分。按陽性細(xì)胞百分比標(biāo)準(zhǔn)計(jì)分：≤5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；>50%為3分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0分為不表達(dá)；1～2分為弱表達(dá)；3～6分為中度表達(dá)；7～9分為強(qiáng)表達(dá)。將不表達(dá)和弱表達(dá)定義為陰性，中度表達(dá)和強(qiáng)表達(dá)定義為陽性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。陽性率比較采用χ2檢驗(yàn)，應(yīng)用Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1EGFR在骨肉瘤中的表達(dá)45例患者骨肉瘤組織中EGFR陽性34例(75.6%)，其中24例強(qiáng)陽性(圖1)，11例陰性(24.4%)。腫瘤周圍正常骨組織中未見EGFR表達(dá)。骨肉瘤組織中EGFR蛋白陽性率高于腫瘤周圍正常骨組織(P均<0.05)。

2.2HER-2在骨肉瘤中的表達(dá)45例患者骨肉瘤組織HER-2陽性9例(20%)(圖2)，陰性36例(80%)，未見有強(qiáng)陽性。腫瘤周圍正常骨組織中未見HER-2表達(dá)。骨肉瘤組織中HER-2蛋白陽性率高于腫瘤周圍正常骨組織(P均<0.05)。

①②

圖1EGFR在骨肉瘤組織中的表達(dá)，EnVision法圖2HER-2在骨肉瘤組織中的表達(dá)，EnVision法

2.3EGFR、HER-2表達(dá)與骨肉瘤臨床病理特征的關(guān)系EGFR、HER-2表達(dá)與骨肉瘤患者性別、年齡、腫瘤大小無關(guān)(P均>0.05)；EGFR在普通型骨肉瘤中的陽性率顯著高于高分化型骨肉瘤，HER-2在普通型骨肉瘤中的陽性率與高分化型骨肉瘤無明顯差異；有肺部或其它部位轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者EGFR陽性率顯著高于無轉(zhuǎn)移組，HER-2在有骨肉瘤轉(zhuǎn)移組和無轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)無明顯差異；TNM分期Ⅰ期骨肉瘤組織EGFR陽性率與Ⅱ+Ⅲ、Ⅳ期組織比較，差異有顯著性(P均<0.05)；TNM分期Ⅰ期骨肉瘤組織HER-2陽性率與Ⅱ+Ⅲ期、Ⅳ期比較，差異無顯著性(P>0.05，表1)。

2.4骨肉瘤中HER-2表達(dá)與EGFR表達(dá)的相關(guān)性45例骨肉瘤中，9例EGFR、HER-2共表達(dá)，25例EGFR陽性、HER-2陰性，無HER-2陽性、EGFR陰性骨肉瘤。采用Spearman相關(guān)分析，骨肉瘤中HER-2與EGFR表達(dá)，無顯著相關(guān)性。

表1 EGFR、HER-2表達(dá)與骨肉瘤臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

HER家族(HER-1/EGFR、HER-2、HER-3、HER-4)受體蛋白在腫瘤發(fā)生和疾病進(jìn)展中起關(guān)鍵性作用，它們與相應(yīng)的配體結(jié)合后，形成同源二聚體或異源二聚體，使受體的酪氨酸激酶發(fā)生自磷酸化，從而激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、血管發(fā)生、黏附和運(yùn)動(dòng)性。許多腫瘤發(fā)生均與該受體突變、過表達(dá)、自泌反饋環(huán)刺激等導(dǎo)致的EGFR激活有關(guān)[2]。EGFR是原癌基因C-erbB-1的表達(dá)產(chǎn)物，與腫瘤細(xì)胞的增殖、黏附、侵襲、轉(zhuǎn)移和腫瘤細(xì)胞的凋亡等密切相關(guān)。EGFR在多種腫瘤中如結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤中存在高表達(dá)或基因擴(kuò)增[3-5]。

本組結(jié)果顯示：EGFR在骨肉瘤組織中的陽性率為75.6%，且與腫瘤分化程度、TNM分期、肺轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。普通型骨肉瘤組EGFR陽性率顯著高于高分化型骨肉瘤。TNM分期Ⅱ+Ⅲ、Ⅳ期組EGFR陽性率明顯高于Ⅰ期組。EGFR陽性增加骨肉瘤患者發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。提示EGFR參與骨肉瘤的瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程。EGFR蛋白表達(dá)可作為骨肉瘤惡性程度判斷指標(biāo)。EGFR靶向抑制劑，在針對(duì)不同腫瘤的治療中，取得顯著的療效[6]。2004年美國(guó)FDA批準(zhǔn)酪氨酸激酶抑制劑阿法替尼用于攜帶EGFR基因突變的晚期非小細(xì)胞肺癌患者的治療；然而酪氨酸激酶抑制劑目前尚未用于治療骨肉瘤。EGFR陽性率與正常骨組織相比顯著升高，且與骨肉瘤惡性程度密切相關(guān)，提示EGFR可能成為骨肉瘤治療的靶點(diǎn)。EGFR抑制劑發(fā)揮直接的抗骨肉瘤效應(yīng)并呈劑量依賴的方式[7]，研發(fā)新的EGFR抑制劑可以成為骨肉瘤治療的有效途徑。

HER-2與EGFR具有約50%的同源性，可接受表皮生長(zhǎng)因子樣物質(zhì)的信息，刺激細(xì)胞增殖，具有酪氨酸激酶的活性。在15%～20%的乳腺中發(fā)現(xiàn)HER-2過表達(dá)，HER-2靶向藥物曲妥珠單抗成為治療乳腺癌最有希望的突破之一[8-9]。HER-2在食管鱗狀細(xì)胞癌中也存在過表達(dá)，是潛在預(yù)后好的指標(biāo)[10]。本組結(jié)果顯示HER-2在骨肉瘤中陽性率為20%，比Mardanpour等[11]報(bào)道的結(jié)果稍低。本組骨肉瘤中9例HER-2陽性者，EGFR均陽性，提示兩者的表達(dá)有一定關(guān)系，但分析結(jié)果顯示兩者的相關(guān)性無顯著性，可能與樣本量相對(duì)較小有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)HER-2表達(dá)與骨肉瘤患者肺轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性，提示HER-2陽性不能成為骨肉瘤患者腫瘤轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素。

綜上所述，骨肉瘤中EGFR表達(dá)增高與骨肉瘤分化程度、TNM分期密切相關(guān)，與骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能參與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展，并促進(jìn)骨肉瘤轉(zhuǎn)移，其可作為骨肉瘤惡性程度的判斷指標(biāo)。

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