自噬相關(guān)基因Beclin1和LC3在卵巢漿液性癌中的表達(dá)及臨床意義

晉 龍，眭玉霞，孫 陽(yáng)，陳小巖，陳志忠，陳靈鋒，李艷輝，王麗萍

自噬(autophagy)是細(xì)胞對(duì)內(nèi)外環(huán)境壓力變化的一種反應(yīng)，是蛋白降解和細(xì)胞器循環(huán)的途徑之一，指雙層膜包裹部分的胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體，與溶酶體融合形成自噬溶酶體，并降解其內(nèi)容物的過(guò)程[1]。自噬可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡，被認(rèn)為是有別于凋亡的另一種細(xì)胞程序性死亡[2]。卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的三大惡性腫瘤，由于其位于盆腔深部，早期病變不易發(fā)現(xiàn)，故70%的卵巢癌臨床確診時(shí)已經(jīng)屬于晚期，易出現(xiàn)盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，因此卵巢癌病死率居?jì)D科惡性腫瘤之首[3]。卵巢漿液性癌(ovarian serous carcinoma, OSC)是卵巢惡性上皮性腫瘤中最常見(jiàn)的病理組織學(xué)類型，本文采用免疫組化MaxVision兩步法、RT-PCR和Western blot法檢測(cè)自噬相關(guān)基因Beclin1和LC3在OSC中的表達(dá)，并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1材料收集福建省立醫(yī)院病理科2010年1月～2013年6月確診的63例OSC。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋。年齡32～75歲，平均50.3歲。29例>50歲，HE染色后，按WHO(2014)卵巢腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行重新分類[4]，將OSC分為低級(jí)別17例和高級(jí)別46例。臨床分期按FIGO(2006)分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期6例、Ⅱ期14例、Ⅲ期33例、Ⅳ期10例，隨機(jī)選取同期手術(shù)切除的20例卵巢漿液性囊腺瘤作對(duì)照分析。另選取同期手術(shù)切除的10例新鮮OSC組織及其相應(yīng)癌旁組織，用于RT-PCR和Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。切除新鮮標(biāo)本迅速放置于液氮中，再保存于-80 ℃低溫冰箱。

1.2試劑Beclin1和LC3兔抗人多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。兔超敏兩步法免疫組化檢測(cè)試劑盒和DAB顯色試劑盒均購(gòu)自福州邁新公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Promega公司。引物序列由TaKaRa公司合成，引物序列(5′→3′)：Beclin1上游引物：AAACGCATTTGCCATCACA；下游引物：GGACCTTCAGCAGTTTACAGTCAG。LC3上游引物：AAACGCATTTGCCATCACA；下游引物：GGACCTTCAGCAGTTTACAGTCAG。GAPDH上游引物：ACCACAGTCCATGCCATCAC；下游引物：TCCACCACCCTGTTGCTGTA。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于碧云天生物研究所。Super ECL超敏發(fā)光液、SDS-PAGE試劑配置購(gòu)于北京普利萊基因公司。

1.3免疫組化采用免疫組化MaxVision兩步法染色，石蠟切片脫蠟、水化后PBS沖洗，過(guò)氧化物酶阻斷劑封閉內(nèi)源性過(guò)氧化酶活性，加入一抗，室溫孵育，加生物素標(biāo)記的二抗，加鏈霉素抗生物素的過(guò)氧化酶溶液，孵育后滴加DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，封固。

1.4結(jié)果判定Beclin1和LC3以胞質(zhì)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞。按細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)陽(yáng)性著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分(染色深淺需與背景著色相對(duì)比)。按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比計(jì)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，陽(yáng)性細(xì)胞≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。兩項(xiàng)計(jì)分相乘為最終結(jié)果：>3為陽(yáng)性，≤3為陰性[5]。

1.5RT-PCR(1)組織RNA提取，每份凍存標(biāo)本取大小1 mm3剪碎研磨，用Trizol法分別提取總RNA。(2)cDNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明合成。(3)RT-PCR擴(kuò)增目的基因。PCR反應(yīng)體系共25 μL：2×PCR Master-Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板5 μL，去離子水5.5 μL，總體積為25 μL。擴(kuò)增條件：96 ℃ 4 min，1個(gè)循環(huán)；93 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，合計(jì)30個(gè)循環(huán)。(3)PCR產(chǎn)物的相對(duì)定量分析，計(jì)算方法：目的基因定量拷貝數(shù)=2-ΔΔC(t)，C(t)值是熱循環(huán)儀中熒光達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)。根據(jù)ΔC(t)實(shí)驗(yàn)組=C(t)目的基因-C(t)GAPDH，ΔC(t)對(duì)照組= C(t)目的基因-C(t)GAPDH，ΔΔC(t)=ΔC(t)實(shí)驗(yàn)組-ΔC(t)對(duì)照組，對(duì)每一標(biāo)本計(jì)算目的基因的拷貝數(shù)，取平均值。

1.6Westernblot(1)腫瘤組織總蛋白提取，將OSC和相應(yīng)癌旁組織約100 mg加入組織蛋白裂解液盡量研碎。(2)按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定蛋白濃度，取10 μL蛋白樣品在SDS-PAGE凝膠上電泳。(3)將電泳分離的樣本轉(zhuǎn)移到固相載體PVGE膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加一抗(Beclin1和LC3 工作濃度1 ∶1 000)，β-catin一抗以1 ∶2 000稀釋，4 ℃孵育過(guò)夜。(4)加入二抗(工作濃度為1 ∶2 000)常溫水平搖床孵育1 h。(5)洗膜后ECL反應(yīng)顯影和定影。(6)膠片采用Quantity One圖像分析軟件進(jìn)行灰度分析，β-catin作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1Beclin1、LC3表達(dá)與OSC臨床病理特征的關(guān)系Beclin1在OSC中陽(yáng)性率為36.51%，漿液性囊腺瘤中陽(yáng)性率為65.00%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.02，P=0.025)。Beclin1蛋白表達(dá)與腫瘤臨床FIGO分期和病理分級(jí)有關(guān)(P均=0.001)；與患者年齡、發(fā)病部位、腫瘤大小及有無(wú)盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(P>0.05)。LC3蛋白在OSC和卵巢漿液性囊腺瘤的陽(yáng)性率分別為33.33%和60.00%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.51，P=0.034)。LC3蛋白表達(dá)與腫瘤臨床FIGO分期和有無(wú)盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P=0.013，P=0.041)，與患者年齡、發(fā)病部位、腫瘤大小及病理分級(jí)無(wú)關(guān)(P>0.05，表1，圖1)。

ABCD

圖1A. Beclin1在漿液性囊腺瘤中表達(dá)，MaxVision兩步法；B. Beclin1在OSC中表達(dá)，MaxVision兩步法；C.LC3在漿液性囊腺瘤中表達(dá)，MaxVision兩步法；D. LC3在OSC中表達(dá)，MaxVision兩步法

2.2Beclin1和LC3蛋白在OSC中表達(dá)的相關(guān)性在23例Beclin1陽(yáng)性的OSC中，LC3陽(yáng)性13例；40例Beclin1陰性的OSC中，LC3陽(yáng)性8例，通過(guò)Spearman相關(guān)性分析表明兩者呈顯著正相關(guān)(rs=0.373，P=0.003，表2)。

表2 Beclin1和LC3在OSC中表達(dá)的相關(guān)性

2.3RT-PCR檢測(cè)內(nèi)參基因與Beclin1、LC3基因的溶解曲線呈單一峰值，擴(kuò)張曲線光滑平穩(wěn)，熒光吸收?qǐng)D譜曲線似S形，符合定量檢測(cè)要求。OSC組織中Beclin1和LC3的mRNA相對(duì)含量分別為(0.581±0.091、0.650±0.090)顯著低于相應(yīng)癌旁正常組織(t=8.083，t=6.614；P=0.016，P=0.022，圖2)。

2.4Westernblot檢測(cè)Beclin1和LC3蛋白在10例新鮮OSC組織中的相對(duì)表達(dá)量(0.654±0.061，0.894±0.122)顯著低于相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)量(1.423±0.058、1.122±0.082)，兩者差異有顯著性(t=34.674，t=9.875；P=0.001，P=0.01，圖3)。

圖2 RT-PCR檢測(cè)Beclin1(A)和LC3(B)在OSC和癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量

圖3 Western blot檢測(cè)Beclin1和LC3 蛋白在OSC和癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量

A.Western blot實(shí)驗(yàn)；B.Beclin1/β-catin相對(duì)表達(dá)；C.LC3Ⅱ/LC3Ⅰ相對(duì)表達(dá)；T：漿液性癌；N：相應(yīng)癌旁組織

2.5Beclin1和LC3表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系隨訪截止日期2015年12月31日，隨訪時(shí)間3～63.5個(gè)月。5例失訪，死亡27例，生存31例。結(jié)果顯示：Beclin1陽(yáng)性患者生存率為69.57%，陰性患者生存率42.86%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.028 3)。LC3陽(yáng)性患者生存率80.95%，陰性患者生存率37.84 %，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.018 5，圖4、5)。

圖4 Beclin1陽(yáng)性組和陰性組OSC患者的生存曲線

圖5 LC3陽(yáng)性組和陰性組OSC患者的生存曲線

3 討論

細(xì)胞的死亡形式有3種：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型程序性細(xì)胞死亡，Ⅰ型指凋亡、Ⅱ型指自噬性細(xì)胞死亡、Ⅲ型指細(xì)胞壞死，三者的形態(tài)學(xué)表型不同。自噬性程序性細(xì)胞死亡表現(xiàn)：在胞質(zhì)中出現(xiàn)大量的自噬泡，其內(nèi)包裹著胞質(zhì)成分和細(xì)胞器，并與溶酶體融合后再降解[6]。自噬是既廣泛存在于正常的生理過(guò)程中，如細(xì)胞廢物清除、結(jié)構(gòu)重建、生長(zhǎng)分化等，同時(shí)又可以是一種細(xì)胞對(duì)不良環(huán)境的防御機(jī)制，如對(duì)抗?fàn)I養(yǎng)缺乏、電離輻射，并參與多種疾病的病理過(guò)程。

自噬是在自噬相關(guān)基因的調(diào)控下將細(xì)胞質(zhì)中膜包裹的自噬泡降解的過(guò)程，在維持細(xì)胞代謝平衡及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面至關(guān)重要[7]。自噬基因Beclin1可通過(guò)影響細(xì)胞周期、調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的凋亡及調(diào)控腫瘤血管生成等參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[8-9]。自噬現(xiàn)象貫穿于真核細(xì)胞正常生長(zhǎng)增殖和病理、生理過(guò)程，有研究表明自噬活性的異常與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有直接的關(guān)系，目前已經(jīng)成為探討腫瘤發(fā)生和抑制腫瘤生長(zhǎng)及克服腫瘤化療耐藥性研究的熱點(diǎn)。

Beclin1基因是第一個(gè)被鑒定的自噬基因，是酵母自噬基因Atg6的同源類似物，位于人類染色體17q21上，約150 kb，是哺乳動(dòng)物參與自噬的特異性基因，通過(guò)調(diào)節(jié)自噬強(qiáng)弱對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起重要作用[10]。

LC3是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中酵母Atg8(Aut7/Apg8)基因的同源物，LC3蛋白主要定位于自噬泡和自噬泡膜表面，參與自噬體的形成。LC3分為Ⅰ、Ⅱ型，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)合成新的LC3，后者經(jīng)Atg4加工成LC3Ⅰ，LC3Ⅰ經(jīng)過(guò)泛素樣反應(yīng)酶加工修飾，與膜表面磷脂酰乙醇胺(PE)偶聯(lián)生成LC3Ⅱ。LC3Ⅱ的含量或LC3Ⅱ/Ⅰ的比值與自噬體的數(shù)量呈正比，因此LC3Ⅱ的含量或LC3Ⅱ/Ⅰ的比值在一定程度上能反應(yīng)細(xì)胞的自噬活性[11]。由于LC3Ⅱ的含量與自噬體的數(shù)量呈正比，且在電泳過(guò)程中LC3Ⅱ比LC3Ⅰ的遷移速度快，因此可以應(yīng)用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)LC3Ⅱ和LC3Ⅱ/Ⅰ的比值變化判斷細(xì)胞的自噬程度。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，石蠟標(biāo)本經(jīng)免疫組化MaxVision兩步法染色，OSC中Beclin1和LC3的陽(yáng)性率明顯低于卵巢漿液性囊腺瘤組織，同時(shí)應(yīng)用RT-PCR 及Western blot檢測(cè)同期新鮮OSC組織及相應(yīng)癌旁組織顯示，在OSC中Beclin1和LC3的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯低于其癌旁組織。提示自噬相關(guān)基因Beclin1和LC3的mRNA和蛋白在OSC中的表達(dá)降低，自噬活性水平顯著下調(diào)，可能參與OSC的發(fā)生。另發(fā)現(xiàn)Beclin1蛋白表達(dá)與OSC患者臨床FIGO分期和病理分級(jí)有關(guān)，LC3蛋白表達(dá)與OSC患者臨床FIGO分期和盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，提示Beclin1和LC3表達(dá)與OSC的發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，促進(jìn)OSC的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。同時(shí)，研究結(jié)果還顯示，Beclin1和LC3在OSC組織中蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，可以推測(cè)Beclin1、LC3在OSC的發(fā)生、發(fā)展和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮協(xié)同作用。

文獻(xiàn)報(bào)道Beclin1和LC3在子宮頸癌[12]、甲狀腺乳頭狀癌[13]、胰腺癌[14]、肝癌[15]等惡性腫瘤中呈低表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相符，但也有研究顯示Beclin1和LC3在胃癌[16]、食管癌[17]、結(jié)直腸癌[18]等惡性腫瘤中呈高表達(dá)。自噬在不同器官腫瘤或同一器官不同類別腫瘤，甚至同一腫瘤的不同發(fā)展階段中的表達(dá)報(bào)道不同。提示自噬在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中可能起雙重作用，對(duì)不同腫瘤、不同階段發(fā)揮促進(jìn)或抑制作用。

本組分析Beclin1和LC3表達(dá)與OSC患者生存及預(yù)后的關(guān)系，結(jié)合隨訪資料發(fā)現(xiàn)，死亡患者中Beclin1和LC3的陽(yáng)性率低，而生存患者中Beclin1和LC3的陽(yáng)性率高。生存曲線結(jié)果顯示：Beclin1和LC3陽(yáng)性患者的預(yù)后好于Beclin1和LC3陰性患者，提示Beclin1和LC3可能作為判斷OSC臨床預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)。

綜上所述，Beclin1和LC3在OSC中表達(dá)降低，導(dǎo)致自噬功能減弱，可能與OSC的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后不良相關(guān)。隨著本實(shí)驗(yàn)組研究不斷深入[19]，通過(guò)誘導(dǎo)干預(yù)腫瘤細(xì)胞的自噬活性，如過(guò)表達(dá)Beclin1和LC3基因，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的自噬死亡，為OSC的腫瘤臨床治療領(lǐng)域提供新的基因靶點(diǎn)。

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