離子通道病基因檢測的進(jìn)展及臨床應(yīng)用評價*

田少華 張樹龍

離子通道病多數(shù)由編碼心臟離子通道的基因異常所引起，如長QT綜合征(LQTS)、 Brugada綜合征(BrS)、兒茶酚胺敏感性室性心動過速( CPVT)、J波綜合征(JWSs)等。離子通道病的基因檢測在診斷、預(yù)防及治療上扮演著重要角色，越來越受到學(xué)者的關(guān)注。隨著新一代測序技術(shù)(NGS)的展開，使得基因檢測變得越來越容易，越來越多的致病基因和變異被篩選出來。離子通道病基因檢測的潘多拉盒子似乎要打開了，但事實真的如此嗎？筆者將對離子通道病基因檢測的最新進(jìn)展和相關(guān)離子通道疾病基因檢測的應(yīng)用評論作一綜述。

1 離子通道病基因檢測的新進(jìn)展

近些年，隨著離子通道病共識的推出，離子通道病的基因檢測在診斷、預(yù)防及治療上扮演著重要角色，越來越受到學(xué)者的關(guān)注。近兩年，離子通道病的基因檢測又有了一些新的進(jìn)展。

1.1LQTS的基因檢測 根據(jù)孟德爾遺傳定律，LQTS分為兩種類型：多數(shù)為常染色體顯性遺傳的RW綜合征(Romano-Wardsyndrome syndrome)，少數(shù)為常染色隱形遺傳的JLN綜合征(Jervell Lange-Nielsen syndrome )。以往研究認(rèn)為RWS相關(guān)突變基因有13個，但Marsman等[1]通過更先進(jìn)的NGS技術(shù)篩選基因組范圍內(nèi)的罕見致病基因，發(fā)現(xiàn)表達(dá)鈣調(diào)蛋白的CALM1、CALM2基因變異與LQT有關(guān)，這一發(fā)現(xiàn)使RWS的候選基因庫增加到15個。但這一發(fā)現(xiàn)未能明確基因表型和臨床表型之間的關(guān)聯(lián)，目前還不適于用于臨床基因檢測[2]。但NGS通過對人基因庫篩選發(fā)現(xiàn)致病基因，對推動離子通道病的基因檢測與臨床應(yīng)用有重要意義，會成為一種常規(guī)基因檢測手段。

另外，對LQT2的基因檢測又有新發(fā)現(xiàn)，Kondo等[3]對1例LQT2研究發(fā)現(xiàn)了新的HERG突變A78T，同時對該變異進(jìn)行熱休克(heat shock)干預(yù)來檢驗其穩(wěn)定性。結(jié)果表明A78T-HERG蛋白表達(dá)并不穩(wěn)定，而且使快速延遲整流K通道表達(dá)下降。但運用熱休克因子-1(heat shock factor-1，HSF-1)干預(yù)后A78T-HERG的變異得以恢復(fù)。這提示，對A78T-HERG的LQT2病人通過HSF-1靶點干預(yù)將會是新的治療手段。

1.2CPVT的基因檢測 截止目前，CPVT共發(fā)現(xiàn)3種致病基因，1-2型CPVT分別為RYR2、CASQ2，它們引起肌漿網(wǎng)離子通道鈣離子通道蛋白及跨膜蛋白的結(jié)構(gòu)及功能改變[4]，CPVT3型基因位于7p22-p14，但犯罪基因至今仍未明確[5]。RYR2、CASQ2分別為常染色體顯性、隱性遺傳，以往對它們的研究發(fā)現(xiàn)較多。通過NGS技術(shù)研究RYR2，發(fā)現(xiàn)了諸多變異。近期，Roston等[6]又通過對一個CPVT合并左室致密化不全(LVNC)的多代遺傳的家系進(jìn)行了研究，通過基因檢測發(fā)現(xiàn)了新的RYR2變異位點(I4855M)，該變異在該家系的兩位先證者發(fā)現(xiàn)。I4855M可能干擾了Ca2+釋放，在野生型RYR2中引起負(fù)顯性效應(yīng)，最終通過基因結(jié)構(gòu)及功能檢測發(fā)現(xiàn)，這一變異為功能缺失變異。他們的研究提示，這一新的RYR2變異可能是CPVT和LVNC的重疊變異。除了以上三種基因變異，Makita等[7]還報道了少見的CPVT致病基因，鈣調(diào)蛋白表達(dá)異常的CALM1、CALM2基因也與CPVT的發(fā)生相關(guān)。這也提示，CPVT和LQTS存在著重疊致病基因。近期，學(xué)者們通過對CALM、TRD進(jìn)行基因檢測發(fā)現(xiàn)，它們是CPVT的致病變異，分別為CPVT4、CPVT5[8]。Vega等[9]發(fā)現(xiàn)，與LQT7有關(guān)的KCNT2變異及與LQT4有關(guān)的ANK2變異，可能是CPVT的變異基因亞型，這些證據(jù)也表明，CPVT和LQTS存在著很多的基因重疊。

1.3BrS的基因檢測 BrS是沒有器質(zhì)性心臟病的常染色顯性遺傳病。迄今為止，發(fā)現(xiàn)多達(dá)19種致病基因[10]，這些基因引起鈉、鉀、鈣通道結(jié)構(gòu)或功能改變。以往研究發(fā)現(xiàn)，SCN5A是BrS最常見的致病基因。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，單一的SCN5A變異會在同一個體或家系出現(xiàn)多種臨床表型，如BrS、LQT3、病竇綜合征(SSS)、心臟傳導(dǎo)障礙(CCD)，出現(xiàn)所謂的重疊綜合征[11]。并且，相同基因型的BrS臨床表型可能會出現(xiàn)很大差別，甚至有些患者僅僅通過表現(xiàn)出早復(fù)極綜合征(ERS)而被識別[11]。以上發(fā)現(xiàn)，提示BrS更容易表現(xiàn)出重疊綜合征和基因異質(zhì)性，這或許和BrS的致病基因類型較多，和其他離子通道病基因重疊概率大有關(guān)。

1.4JWSs的基因檢測 JWSs包括BrS和ERS。目前，與 BrS相關(guān)的SCN5A基因變異就超過300個，在BrS和ERS中有很多與SCN5A基因變異相關(guān)。SCN5A的功能缺失突變與BrS和ERS都有關(guān)系，也與SSS、CCD、Lenegre病有關(guān)。當(dāng)存在顯著增大的短暫外向鉀電流(Ito)時，功能缺失突變導(dǎo)致INa減低表現(xiàn)為BrS/ERS，否則表現(xiàn)為傳導(dǎo)異常[12]。在BrS先證者中發(fā)現(xiàn)，13%病人包括下列基因變異：CACNA1C(Cav1.2)、CACNB2b(Cavβ2b)和CACNA2D1(Cavα2δ)。相對罕見基因突變包括：三磷酸甘油脫氫酶1基因(GPD1L)、SCN1B(鈉通道的β1亞基)、KCNE3(MiRP2)、SCN3B(鈉通道的β3亞 基)、KCNJ8 (Kir6.1)、KCND3(Kv4.3)、RANGRF(MOG1)、SLMAP、ABCC9(SUR2A)、(Navβ2)、PKP2(plakophillin-2)、FGF12(FHAF1)、HEY2和SEMA3A(腦信號蛋白)[13]。最近發(fā)現(xiàn)編碼鈉通道的SCN10A基因突變也可引起B(yǎng)rS。Behr等[14]分析了SCN10A突變及罕見突變的患病率，發(fā)現(xiàn)兩者具有很高的相關(guān)性(5%～16.7%)。這些基因突變引起鈉和鈣通道電流(INa、ICa)的功能缺失，以及Ito和ATP敏感性鉀電流(IK-ATP)的功能獲得[14]。另外，最新報道的易感但仍需驗證的基因有：瞬時受體電位M通道蛋白-4基因(TRPM4)和KCND2基因[15]。

早期復(fù)極樣改變(ERP)的心電圖改變具有明顯家族聚集性。目前已確定的與ERP和ERS都相關(guān)的基因變異有7個。另外，在ERS先證者中也發(fā)現(xiàn)了L型鈣通道(CACNA1C、CACNB2和CACNA2D1)的α1、β2、α2δ亞基，Nav1.5的α1亞基，以及Nav1.8(SCN5A、 SCN10A)的功能缺失突變[13]。

1.5緩慢型心律失常的基因檢測 SCN5A在心房肌表達(dá)豐富，這在以往已經(jīng)明確。Baskar等[16]報道過某一SCN5A變異可引起整個心房傳導(dǎo)阻滯，從而引起心房靜止或SSS，但具體作用機(jī)制不明。Chiang等[17]對緩慢型心律失常患者進(jìn)行回顧性研究發(fā)現(xiàn)，功能缺失的SCN5A變異和竇房結(jié)功能不良、心房靜止及起搏奪獲不良相關(guān)。以往也有學(xué)者報道調(diào)控心房鈉尿肽(ANP)表達(dá)的鈉尿肽前體蛋白A(NPPA)基因變異與心房靜止有關(guān)，這可能與ANP啟動第二信使環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)參與調(diào)控離子通道有關(guān)，但NPPA變異引起的心房電生理效應(yīng)仍不清楚[18]。越來越多的證據(jù)顯示，LMNA、SCN1B、SCN10A、GJA5(Cx40)、KCNJ2、TRPM4、KCNK17等基因變異參與了心臟傳導(dǎo)阻滯的發(fā)生[18]。

2 基因檢測臨床應(yīng)用的評價

2.1LQTS基因檢測評價 以往研究發(fā)現(xiàn)，在LQTS中KCNQ1基因(LQT1)占30%～35%，KCNH2基因(LQT2)占25%～30%，SCN5A基因(LQT3)占5%～10%，這三種基因占LQTS基因檢測陽性病例的90%。雖然其他類型LQTS相關(guān)基因<5%，但在LQTS基因檢測中仍會遇到假陽性的可能[19]。

另外，在確診的LQTS中，LQT1～3基因表型和臨床表型相關(guān)，并且根據(jù)臨床特點(癥狀、家族史、心電圖)可以推斷基因型，這在以往已經(jīng)明確，對這類明確基因表型和臨床表型關(guān)聯(lián)的候選基因進(jìn)行基因檢測更合理[20]。少數(shù)的LQTS，其基因型和臨床特點并無關(guān)聯(lián)。某些表現(xiàn)出明顯臨床特點的LQTS患者，其陽性基因檢出率只有10%[21]，這在LQT7和LQT8基因檢測中更常見[22]。因此，對未能明確基因表型和臨床表型有確信關(guān)聯(lián)的致病基因型，并不適合用于臨床基因檢測。由于LQTS相關(guān)基因變異較大，最近有學(xué)者[23]試圖通過全外顯子測序(WES)篩選可疑基因，這或許能揭示LQTS的真實世界數(shù)據(jù)，但基因序列的高變異性和相關(guān)基因的低覆蓋率會使這一檢測手段的敏感性降低。

2.2CPVT基因檢測評價 Makita等[7]報道了CALM1、CALM2基因與CPTV的發(fā)生相關(guān)。近期，學(xué)者們通過對CALM、TRD進(jìn)行基因檢測發(fā)現(xiàn)，它們是CPVT的致病變異，分別為CPVT4、CPVT5[8]。Vega等[9]發(fā)現(xiàn)，與LQT7有關(guān)的KCNT2變異及與LQT4有關(guān)的ANK2變異，可能是CPVT的變異基因亞型，這些證據(jù)表明，CPVT和LQTS存在著很多的基因重疊。NGS的出現(xiàn)解決了基因測序的問題，但通過NGS無法提高重疊綜合征的基因檢測特異度。CPVT的基因檢測，對合理選擇治療策略(藥物、ICD、LCSD、RFCA)有指導(dǎo)意義，但對重疊綜合征相關(guān)基因進(jìn)行檢測，較低的特異度或許會限制基因檢測的臨床應(yīng)用。

2.3BrS基因檢測評價 最近的專家共識認(rèn)為，已在先證者發(fā)現(xiàn)BrS致病基因突變者，推薦其家族成員及相關(guān)親屬進(jìn)行該特定突變的檢測(Ⅰ類推薦)[24]。BrS發(fā)作前心電圖正常，暈厥、室性心動過速或心臟驟停可能是首發(fā)表現(xiàn)，具有較高的心源性猝死(SCD)風(fēng)險。有學(xué)者認(rèn)為SCN5A是BrS最常見的致病基因，對此致病進(jìn)行基因檢測，有很強的預(yù)測價值。然而，真實世界似乎并非如此。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，SCN5A變異似乎并不是BrS的未來心臟事件(暈厥或SCD)的獨立預(yù)測因子[25]。通過亞組分析發(fā)現(xiàn)，和錯義的SCN5A變異相比，引起蛋白表達(dá)截短(中斷或移碼)的SCN5A變異中出現(xiàn)了PR、QRS間期延長。通過對中國臺灣的漢族人群研究發(fā)現(xiàn)，SCN5A變異很可能并不是BrS心律失常復(fù)發(fā)的預(yù)測因子，但可能能夠預(yù)測心律失常事件的啟動時間(數(shù)據(jù)尚未發(fā)布)。對BrS進(jìn)行基因檢測前，必須有能夠診斷BrS的臨床證據(jù)(臨床發(fā)作史、家族史、心電圖)，而且對臨床確診的BrS，不同于LQTS，無論藥物或ICD，均不依賴于基因檢測指導(dǎo)?；驒z測更多是體現(xiàn)在心臟事件復(fù)發(fā)的預(yù)測價值上。以上研究顯示，BrS相關(guān)基因似乎并非心律失常事件的預(yù)測因子，預(yù)測價值有限。對臨床確診的BrS，進(jìn)行基因檢測或許并不合適，但對家系中的其他成員檢測，對早期發(fā)現(xiàn)可疑基因及豐富變異基因位點有一定意義。

盡管目前專家共識推薦BrS1或復(fù)雜BrS基因檢測有益，但對SCN5A檢測發(fā)現(xiàn)，仍有2%～5%的正常人群出現(xiàn)了SCN5A稀有變異，這也提示并非所有已知的SCN5A變異必須進(jìn)行基因檢測[26]。此外，根據(jù)2012年外顯子組排序計劃(ESP)提供的數(shù)據(jù)，與BrS相關(guān)的SCN5A變異，在人群中的分布特點仍不清楚。ESP僅僅發(fā)現(xiàn)7%(22/300)的SCN5A變異與BrS相關(guān)，原先學(xué)者們認(rèn)為的所謂致病變異，只是基于這一變異在正常人群中沒有出現(xiàn)?，F(xiàn)在來看，這類變異可能本來就罕見或者出現(xiàn)頻率很低，單純歸結(jié)為致病變異而進(jìn)行基因檢測或許并不合適。此外，很多的BrS變異基因呈不顯性表達(dá)或變異表達(dá)，對此類變異進(jìn)行合理解釋更難，基因檢測對此類變異幾乎沒有什么幫助[27]。

BrS更容易表現(xiàn)出重疊綜合征和基因異質(zhì)性，單一的SCN5A變異會在同一個體或家系出現(xiàn)多種臨床表型，如BrS、LQT3、SSS、CCD[11]。雖然NGS通過高通量測序使變異基因的檢測更準(zhǔn)確全面，但由于重疊綜合征的存在，對基因檢測的特異度提出了挑戰(zhàn)。

2.4JWSs基因檢測評價 針對BrS和ERS的眾多致病基因，當(dāng)前僅僅對很小一部分變異進(jìn)行了功能表達(dá)研究，確定了這些變異與疾病的因果關(guān)系，闡明了合理的致病機(jī)制。學(xué)者們運用轉(zhuǎn)基因動物模型進(jìn)行研究的基因變異也很少，而對BrS或ERS先證者分離的原代心肌細(xì)胞或誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞的研究更少。通過計算模擬技術(shù)有益于預(yù)測突變的功能，但至今仍未進(jìn)行嚴(yán)格測試。Schwartz等[28]強調(diào)：缺乏對基因變異的功能學(xué)或生物學(xué)驗證，是基因檢測解讀中最嚴(yán)重的不足所在。

源于NGS方法的應(yīng)用，擴(kuò)大了對一些特異性疾病的認(rèn)識。 如大幾率外顯子排序工程(GO-ESP)和外顯子組聚集研究(ExAC)，極大地改變了以往關(guān)于心臟離子通道病易感基因所謂的“正?！钡募膊∝?fù)擔(dān)和背景基因變異認(rèn)知的程度[29]。對BrS患者基因檢測發(fā)現(xiàn)，18%～28%的患者可檢測到SCN5A基因變異，而在普通人群中同樣存在3%～5%的“良性” SCN5A基因變異。這表明，對基因檢測結(jié)果的解釋非常復(fù)雜。這提示即使是攜帶最常見致病突變且有典型BrS表型的患者，基因檢測出現(xiàn)“假陽性”的概率仍高達(dá)10%。目前，已經(jīng)確定了20余個JWSs易感基因。 這些基因信息僅增加了檢測結(jié)果解釋中總的 “基因?qū)W噪音”，并未實質(zhì)性地增加基因檢測中發(fā)現(xiàn)真致病突變的機(jī)會[30]。以上這些基因檢測中存在的問題使我們認(rèn)識到，以純粹的概率論來解讀JWSs基因檢測的結(jié)果很有必要，但卻不能據(jù)此得出是否有病或確診疾病的結(jié)論。

3 小結(jié)

近30年，離子通道病的基因檢測取得了輝煌的成就。盡管更加先進(jìn)的DNA測序技術(shù)應(yīng)用于離子通道病的基因檢測中，使基因結(jié)構(gòu)和功能復(fù)雜的離子通道病得以明確，但NGS基因檢測技術(shù)應(yīng)用于臨床實踐仍面臨挑戰(zhàn)。NGS篩選多致病基因的同時，不可避免的納入了有意義的不確定罕見變異(VUS)，并增加了后續(xù)基因功能研究的難度。盡管有這些技術(shù)的幫助， 基因檢測中發(fā)現(xiàn)的大量基因變異仍成為我們被迫面對的“基因?qū)W煉獄”，這些變異的數(shù)目也會隨著外顯子或基因?qū)W測序的廣泛應(yīng)用而更趨增多。這就要求建立一個包含有臨床確診和變異分級證據(jù)相關(guān)的基因變異數(shù)據(jù)庫。這樣或許更能推動離子通道病的基因檢測，至少現(xiàn)階段，離子通道病基因檢測的潘多拉盒子仍未打開。

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