歐前胡素衍生物的合成與血管舒張活性研究

黃立敏,李友佳,侯亞靜,王 程,魏 迪,賀懷貞*

(1.西安交通大學藥學院,西安 710061；2.西安交通大學第二附屬醫(yī)院,西安 710004)

高血壓是最常見的心血管疾病,嚴重影響人類健康,甚至威脅生命[1-3]。高血壓治療周期長,化學藥物治療是其防治的重要手段,目前,臨床上常用的降壓藥主要有利尿劑、β受體阻滯劑、鈣通道拮抗劑、血管緊張素轉換酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑以及腎素抑制劑六大類[4-9]。這些藥物在發(fā)揮藥效的同時,也會產(chǎn)生一些毒性和不良反應,如利尿劑的長期使用會造成電解質紊亂,鈣通道拮抗劑會產(chǎn)生水腫、面紅、頭痛、頭暈等現(xiàn)象[10-14]。因此,新的降壓藥物的研究與開發(fā)仍是目前藥物研究關注的熱點。

血管緊張素轉換酶抑制劑通過抑制血管緊張素Ⅰ轉換為血管緊張素Ⅱ,不滅活緩激肽,產(chǎn)生降壓效應。鈣通道拮抗劑通過選擇性地減少Ca2+內(nèi)流,干擾細胞內(nèi)Ca2+濃度,從而產(chǎn)生降壓效應。盡管各類降壓藥物作用機制不同,但舒張血管是它們起效的基本途徑[15]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),白芷中主要成分歐前胡素具有一定的血管舒張活性,在此基礎上優(yōu)化結構,得到系列具有血管舒張?zhí)匦缘幕衔颷16-18]。本研究擬保留歐前胡素活性母核結構,以Williamson醚化為關鍵反應步驟,設計合成4個歐前胡素衍生物,產(chǎn)物結構經(jīng)IR,MS,1H-NMR,13C-NMR進行確證。采用多通道微血管張力測定方法對其血管舒張活性進行初步考察,應用計算機輔助藥物設計軟件中的Surflex-dock模塊,對所得化合物與可能靶標蛋白的相互作用進行初步分析。

1 儀器與試藥

1.1儀器 X-4型顯微熔點測定儀(予華儀器有限責任公司)；LC-MS-8040質譜儀(日本島津公司)；AVANCE 400 MHz核磁共振波譜儀(NMR,德國布魯克公司)；DMT血管張力測量系統(tǒng)(丹麥DMT公司)；倒置顯微鏡(上海光學儀器廠)；優(yōu)譜超純水制備機(成都超純科技有限公司)；微量移液器(大龍醫(yī)療設備有限公司)；電子天平(德國賽多利斯集團)。

1.2試藥 8-甲氧基補骨脂素(南京春秋生物工程有限公司)；氘代試劑CDCl3(薩恩化學技術有限公司)；柱層析硅膠(300～400目,青島海洋化工有限公司)；雄性SD大鼠(250～300 g,西安交通大學實驗動物中心提供)；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1目標化合物的合成 見圖1。

圖1歐前胡素衍生物的合成路線

Fig.1 The synthetic route of imperatorin derivatives

2.1.18-羥基補骨脂素(化合物2)的合成 將2.50 g(11.57 mmol)8-甲氧基補骨脂素置于圓底燒瓶中,用35 mL干燥的二氯甲烷溶解,氮氣保護,0 ℃下攪拌10 min,避光條件下緩慢滴入10 mL溶有6.5 mL三溴化硼的二氯甲烷溶液。室溫反應4 h,TLC監(jiān)測(乙酸乙酯∶石油醚=1∶2)反應進程。反應完畢后,將反應液緩慢倒入100 mL飽和碳酸氫鈉溶液中,室溫攪拌1 h后,抽濾,洗滌,干燥,得白色固體粉末8-羥基補骨脂素2.15 g(10.65 mmol),產(chǎn)率92.1%。mp249～251 ℃[11]；Rf=0.24(乙酸乙酯∶石油醚=1∶1)；IR (KBr):υmax3 294 (-OH),3 132 (furan-CH),3 063(ArH),1 697(-C=O),1 157(-C-O-C-)cm-1；1H-NMR (400 MHz,CDCl3):δ 8.07(d,J=9.6 Hz,1H,H-pyrano),8.04 (d,J=2.4 Hz,1H,H-furan),7.42 (s,1H,ArH),7.01(d,J=2.4 Hz,1H,H-furan),6.35 (d,J=9.6 Hz,1H,H-pyrano)；EI-MS(m/z):201.9[M]+。

2.1.29-(2-溴乙氧基)-7H-呋喃并[3,2-g]苯并吡喃-7-酮(化合物3)的合成 將1.01 g(5.00 mmol)化合物2溶于75 mL無水丙酮中,加入0.83 g(6.00 mmol)無水碳酸鉀,在氮氣保護下室溫攪拌30 min,在反應液中分別加入2.5 mL(28.88 mmol)1,2-二溴乙烷,在50 ℃下反應12 h,反應結束后,將反應液降至室溫,并將其倒入冰水中,用乙酸乙酯萃取,合并有機相,有機相依次用清水和飽和食鹽水洗滌,無水硫酸鈉干燥,濃縮,柱層析分離(乙酸乙酯∶石油醚=1∶2)得白色固體9-(2-溴乙氧基)-7H-呋喃并[3,2-g]色烯-7-酮1.32 g(4.27 mmol),產(chǎn)率85%。mp148～149 ℃[11]；Rf=0.63(乙酸乙酯∶石油醚=1∶1)；IR(KBr):υmax3 155 (furan-CH),3 070(ArH),2 878 (-CH2-),1 697(-C=O),1 589 (-C=C-),1 157(-C-O-C-)cm-1；1H-NMR (400 MHz,CDCl3):δ7.78 (d,J=9.6 Hz,1H,CH=HC-C=O),7.72 (s,1H,CH=HCO),7.41(1H,s,ArH),6.84 (s,1H,CH=HCO),6.39 (d,J=9.2 Hz,1H,CH=HC-C=O),4.76(t,J=6.4 Hz,2H,-OCH2CH2Br),3.75 (t,J=6.4 Hz,2H,-OCH2CH2Br)；EI-MS(m/z):307.9 [M]+。

2.1.3化合物4～7的合成 將5.00 mmol化合物3溶于150 mL無水丙酮中,加入0.83 g(6.00 mmol)無水碳酸鉀,在氮氣保護下室溫攪拌30 min,在反應液中分別加入6.00 mmol不同的有機胺鹽,在50 ℃下繼續(xù)反應12 h,反應結束后,減壓蒸去溶劑,將殘余固體溶于乙酸乙酯,有機相依次用清水和飽和食鹽水洗滌,無水硫酸鈉干燥,濃縮進行柱層析分離得產(chǎn)品。

2.1.3.19-(2-(4-甲基-1-哌嗪基)乙氧基)-7H-呋喃并[3,2-g]色烯-7-酮(化合物4) 白色固體,產(chǎn)率90%；mp73-74 ℃；Rf=0.29 (氯仿∶甲醇,10∶1)；IR (KBr):υmax3 148(furan-CH),3 063 (ArH),2 937(-CH3),2 880(-CH2-),1 732(-C=O),1 587(-C=C-),1 541(-C=C-),1 148 (-C-O-C-)cm-1；1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δ7.77 (d,J=9.6 Hz,1H,H-pyrano),7.69 (s,1H,H-furan),7.37 (s,1H,ArH),6.82 (s,1H,H-furan),6.37 (d,J=9.2 Hz,1H,H-pyrano),4.60 (t,J=5.2 Hz,2H,-OCH2CH2N),2.91 (t,J=5.2 Hz,2H,-OCH2CH2N),2.66 (s,4H,-N(CH2CH2)2NCH3),2.45 (s,4H,-N(CH2CH2)2NCH3),2.28 (s,3H,-N(CH2CH2)2NCH3)；EI-MS(m/z):328.1[M]+。

2.1.3.29-(2-(2-甲基-1-哌啶基)乙氧基)-7H-呋喃并[3,2-g]色烯-7-酮(化合物5) 白色固體,產(chǎn)率68%；mp102～103 ℃；Rf=0.60 (氯仿∶甲醇=10∶1)；IR (KBr):υmax3 148 (furan-CH),3 067(ArH),2 930(-CH3),2 853(-CH2-),1 728(-C=O),1 587(-C=C-),1 508(-C=C-),1 150(-C-O-C-)cm-1；1H-NMR(400 MHz,CDCl3):δ7.77(d,J=9.6 Hz,1H,H-pyrano),7.69 (s,1H,H-furan),7.35(s,1H,ArH),6.82 (s,1H,H-furan),6.37 (d,J=9.6 Hz,1H,H-pyrano),4.62 (d,J=3.6 Hz,2H,-OCH2CH2N),3.31～3.15 (m,1H,-(CH2)2NCHCH3),3.08～2.83(m,2H,-OCH2CH2N),2.52～2.33(m,2H,-CH2NCH(CH3)CH2-),1.68～1.46(m,4H,-CH3CHCH2CH2CH2CH2N),1.36～1.21(m,2H,-CH2NCH(CH3)CH2-),1.11(d,J=6.0 Hz,3H,-(CH2)2NCHCH3)； EI-MS(m/z):327.1[M]+。

2.1.3.39-(2-(3,4-二氫喹啉-1(2H)-基)乙氧基)-7H-呋喃并[3,2-g]色烯-7-酮(化合物6) 白色固體,產(chǎn)率77%；mp143～145 ℃；Rf=0.27(石油醚∶乙酸乙酯=1∶4)；IR(KBr):υmax3 150(furan-CH),3 063(ArH),2 845(-CH2-),1 734(-C=O),1 590(-C=C-),1 504(-C=C-),1 150(-C-O-C-)cm-1；1H-NMR (400 MHz,CDCl3):δ7.76 (d,J=9.6 Hz,1H,H-pyrano),7.65(s,1H,H-furan),7.34 (s,1H,ArH),7.04 (t,J=7.8 Hz,1H,ArH),6.95 (d,J=6.6 Hz,1H,ArH),6.80 (s,1H,H-furan),6.68(s,1H,ArH),6.59 (s,1H,ArH),6.37(d,J=9.6 Hz,1H,H-pyrano),4.72 (s,2H,-OCH2CH2N),3.82 (t,J=5.8 Hz,2H,-OCH2CH2N),3.56 (s,2H,-NCH2CH2CH2-),2.77 (s,2H,-NCH2CH2CH2-),1.99 (s,2H,-NCH2CH2CH2-)；EI-MS(m/z)361[M]+。

2.1.3.49-(2-(哌嗪基)乙氧基)-7H-呋喃并[3,2-g]色烯-7-酮(化合物7) 白色固體,產(chǎn)率31%；mp178～180 ℃；Rf=0.09(氯仿∶甲醇=10∶1)；IR(KBr):υmax3 416(NH),2 835(-CH2-),1 718(-C=O),1 589(-C=C-),1 126(-C-O-C-)cm-1；1H-NMR(400 MHz,CDCl3):δ 7.63 (s,1H,ArH),7.31(d,J=8.4 Hz,1H,H-pyrano),6.87～6.82(m,1H,H-furan),6.78～6.74(m,1H,H-furan),6.65 (d,J=9.2 Hz,1H,H-pyrano),6.24 (s,1H,NH),5.18(s,2H,-OCH2CH2N),3.88 (s,2H,-OCH2CH2N),3.53(s,4H,-N(CH2CH2)2NH),3.44(s,4H,-N(CH2CH2)2NH)；EI-MS(m/z):314.1[M]+。

2.2血管舒張活性評價

2.2.1Kreb′s溶液的配制 制取1 000 mL新鮮的三蒸水。見表1,按照表1配制緩沖鹽體系,用1 mol·L-1的鹽酸調節(jié)pH值至7.4,將Kreb′s溶液置于4 ℃冰箱中保存,現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2.2供試品溶液的配制 歐前胡素衍生物濃度梯度溶液：精密稱取化合物4,5,6和7,并用一定量的DMSO溶液溶解為儲備液,用水或DMSO稀釋,配制成終濃度分別為1×10-7,3×10-7,1×10-6,3×10-6,1×10-5,3×10-5和1×10-4mol·L-1的系列化合物溶液,置于4 ℃冰箱中避光保存。

2.2.3微血管的分離 將雄性SD大鼠脫頸處死,取其腸系膜動脈、腎動脈和腦基底動脈。置于4 ℃Kreb′s溶液中,分別制備成每段3～4 mm的血管環(huán)[12-13]。

表1Kreb′s溶液的配制

Tab.1 The preparation of Kreb′s solution

試劑名稱相對分子質量/M用量/g·L-1摩爾量/mmol·L-1氯化鈉58.486.954119.0碳酸氫鈉84.011.26015.0氯化鉀74.550.3434.6氯化鈣110.980.1661.5六水合氯化鎂203.300.2441.2二水合磷酸二氫鈉156.010.1871.2葡萄糖180.161.0906.1

2.2.4實驗測定 將分離好的血管用兩根長3.0 cm的細鋼絲貫穿血管腔,兩端分別與浴槽內(nèi)的2個灌流針連接即固定在張力換能器水浴槽的中心位置,加熱,設定溫度37 ℃,血管環(huán)置于95%氧氣和5%二氧化碳混合氣體飽和的Kerb′s溶液中。調零穩(wěn)定后,給予血管環(huán)3 mN的預張力,平衡1.5～2.0 h,期間每隔20 min換1次Kreb′s溶液。待血管環(huán)張力穩(wěn)定平衡后,去除滯留的Kreb′s液,將60 mmol·L-1K+rich-Kreb′s溶液置于張力換能器中的水浴槽中檢驗動脈環(huán)收縮性,待血管環(huán)收縮達到穩(wěn)定平臺后,用Kreb′s溶液沖洗血管環(huán)3遍,使其張力恢復至基線水平。2次收縮幅度相差小于10%者用于實驗。血管收縮穩(wěn)定后依次加入5 μL待測藥物的濃度梯度溶液,記錄血管環(huán)張力的變化,分別考察目標化合物對高鉀溶液所致不同血管收縮的舒張作用。

2.3分子對接 前期研究表明,歐前胡素降壓作用的作用位點可能是電壓依賴的L-型鈣離子通道中的α-1C受體[12]。因此,在本實驗中,在PDB蛋白數(shù)據(jù)庫中選取L-型鈣離子通道中α-1C受體蛋白(PDB ID：3G43),選用Sybyl-X軟件中的Sulflex對接模型與目標化合物進行模擬對接。采用Sybyl/Sketch模塊構建底物分子,優(yōu)化過程中采用Powell′s 能量梯度法,利用Tripos分子力場進行能量最小化計算,能量收斂限定為0.005 Kcal·mol-1,化合物中各原子凈電荷類型為Gasteiger-Hückle型,迭代次數(shù)設定為1 000次獲得最佳構象。

3 結果與討論

3.1合成部分 實驗以8-甲氧基補骨脂素為原料,以Williamson醚化反應為關鍵步驟合成目標化合物。在歐前胡素衍生物中引入含氮側鏈,使得衍生物易于成鹽,有利于提高歐前胡素衍生物的水溶性,增強衍生物的成藥性。通過考察反應溶劑、縛酸劑優(yōu)化Williamson醚化反應。反應溶劑考察了N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和丙酮,在合成目標產(chǎn)物的過程中,DMF作為溶劑時,生成的副產(chǎn)物多且后處理不易除去；縛酸劑考察了強堿氫氧化鈉和弱堿碳酸鉀,氫氧化鈉可導致吡喃酮環(huán)發(fā)生分子環(huán)反應。因此,選擇丙酮作為反應溶劑,碳酸鉀作為酸結合劑,50 ℃下反應12 h,得到目標產(chǎn)物。

3.2血管舒張活性 歐前胡素衍生物對腸系膜動脈、腎動脈和腦基底動脈的血管舒張效應見表2和圖2。由表2和圖2可知,所得4種衍生物對3種不同血管均具有不同程度的舒張活性,最大舒張率基本均達到90%以上；與腎動脈和腦基底動脈相比,4種衍生物在腸系膜動脈中血管舒張效應相對較好,其中化合物5在3種不同血管中的舒張效應均高于歐前胡素；化合物5～7的側鏈分別為2-甲基哌啶、四氫喹啉及哌嗪,三者在所測血管上作用趨勢相同,其血管舒張活性均逐漸降低；在腸系膜動脈中,化合物4與7相比,將側鏈哌嗪環(huán)的仲胺氫置換為甲基后,脂溶性增加,化合物活性增強,然而在腎動脈和腦基底動脈中活性差別不大。與前期研究相比[11],本實驗合成的化合物總體血管舒張活性優(yōu)于前期合成的化合物,在后期研究中可繼續(xù)對其結構進行優(yōu)化,期待得到活性更強的化合物。

表2歐前胡素(IMP)及其衍生物對大鼠腸系膜動脈、腎動脈及腦基底動脈舒張的pEC50和Emax(%)值

Tab.2 The pEC50and Emax(%) of imperatorin(IMP)and its derivatives on rat mesenteric artery,renal artery and basilar arterymodel

化合物R1腸系膜動脈pEC50Emax/%腎動脈pEC50Emax/% 腦基底動脈pEC50Emax/%IMP-5.20±0.09 96.00±1.004.95±0.14 85.60±4.005.26±0.25 65.00±4.2045.47±0.33 88.80±9.154.33±0.02 99.80±0.594.32±0.07100.00±0.0055.67±0.05109.00±11.315.19±0.01107.40±2.445.69±0.21107.30±9.6664.79±0.10 93.90±4.164.97±0.08104.50±3.854.77±0.02102.80±3.1174.59±0.31 92.40±5.714.52±0.12 94.10±2.874.69±0.31 93.30±5.67

圖2歐前胡素衍生物在大鼠動脈的量效曲線(n=6)

A.腸系膜動脈；B.腎動脈；C.腦基底動脈。

Fig.2 The dose-effect curve of imperatorin derivatives on the rat artery model(n=6)

A.rat mesenteric artery；B.renal artery；C.basilar artery.

3.3分子對接 化合物5與α-1C受體蛋白(PDB ID：3G43)的作用結果見圖3A?；衔?中內(nèi)酯環(huán)2位羰基上的-O-與Thr110殘基上的H形成1個氫鍵,鍵長為2.22 ?；內(nèi)酯環(huán)1位的-O-與His 107殘基上的H形成1個氫鍵,鍵長為1.95 ?；呋喃環(huán)的-O-與Lys94殘基上的H形成1個氫鍵,鍵長為2.28 ?；酚醚中的-O-分別與His 107和Lys94殘基上的H形成2個氫鍵,鍵長分別為2.35和2.32 ??；谝陨戏治?化合物5與α-1C受體蛋白氨基酸殘基上的H形成了5個氫鍵,且鍵長均小于3 ?；與前期合成的聯(lián)苯型香豆素類化合物相比[11],此類化合物與靶標蛋白相互作用中,氫鍵作用力可能是主要貢獻,且化合物5與靶標蛋白形成的氫鍵數(shù)量多,其含氮柔性側鏈伸入到活性空腔,有較好的契合性,見圖3B?；衔?與靶標蛋白的作用模式與化合物4,6和7不同,見圖3C?；衔?與受體有較好親和力,這與活性實驗結果一致。

圖3分子對接圖

A,B.化合物5與α-1C受體蛋白(PDB ID：3G43)作用模式圖；C.化合物4,5,6和7與α-1C受體蛋白作用模式圖。

Fig.3 Molecular docking

A,B.binding mode of compound5toα-1C(PDB ID：3G43)；C.binding mode of compounds4,5,6and7toα-1C.

4 結論

本研究在保留歐前胡素母核結構的基礎上,以Williamson醚化反應為關鍵步驟,設計合成4個歐前胡素衍生物,產(chǎn)物結構經(jīng)IR,MS,1H-NMR和13C-NMR進行確證，反應步驟簡單,條件溫和。多通道微血管張力測定結果表明,4個化合物均具有不同程度的血管舒張活性,其中化合物5在3種不同血管中的舒張效應均高于歐前胡素。進一步分子對接研究表明,化合物5與可能作用受體有較好的親和力,為歐前胡素衍生物結構優(yōu)化提供理論依據(jù)。

[1] Kanaoka T,Tamura K,Ohsawa M,et al.Relationship of ambulatory blood pressure and the heart rate profile with renal function parameters in hypertensive patients with chronic kidney disease[J].Clin Exp Hypertens,2012,34(4):264-269.

[2] Ghosh R K,Ball S,Das A,et al.Selexipag in pulmonary arterial hypertension:most updated evidence from recent preclinical and clinical studies[J].J Clin Pharmacol,2017,57(5):547-557.

[3] 潘俊龍.高血壓常見藥物與治療方法的研究進展[J].中國當代醫(yī)藥,2014,21(5)：185-187.

[4] 吳金珊,李佳.抗高血壓藥物的研究進展和臨床應用[J].中國實用醫(yī)藥,2009,4(23)：231-232.

[5] 蘇定馮.新型抗高血壓藥物研究進展[J].中國藥理學通報,1991,7(2)：92-94.

[6] 郭永輝,張小民.阿托伐他汀聯(lián)合普羅布考對糖尿病合并高血壓患者的影響[J].西北藥學雜志,2015,30(2)：191-192.

[7] 謝娜.抗高血壓藥物研究新進展[J].中國現(xiàn)代藥物應用,2009,3(14)：198-200.

[8] 王艷春,呂巧莉,孫建勛,等.我國近5年降脂藥藥物經(jīng)濟學研究文獻分析[J].中國藥房,2016,27(26)：3609-3613.

[9] Julius S.Amlodipine in hypertension:an overview of the clinical dossier[J].J Cardiovasc Pharmacol,1988,12(Suppl 7)：S27-S33.

[10]盧奕,何英,李東,等.阿托伐他汀不良反應的流行病學特征研究[J].中國藥業(yè),2014,23(3)：46-49.

[11]蔣麗華,薛愛英.阿托伐他汀鈣致29例不良反應文獻分析[J].包頭醫(yī)學院學報,2015,31(4)：80-81.

[12]鄢琳,王振綱.探討中國、美國及歐洲高血壓防治指南中有關藥物治療的問題[J].中國藥理學通報,2006,22(1)：14-19.

[13]梁峰,胡大一,沈珠軍,等.2014年美國成人高血壓治療指南[J].中華臨床醫(yī)師雜志:電子版,2014,8(2)：252-260.

[14]Widelski J,Popova M,Graikou K,et al.Coumarins fromAngelicaLucidaL.-antibacterial activities[J].Molecules,2009,(14)：2729-2734.

[15]Zhou N,He J Y,Wang T,et al.Design,synthesis,and vasorelaxation activity of novel imperatorin derivatives[J].J Asian Nat Prod Res,2013,15(6)：650-657.

[16]王程,周楠,潘曉艷,等.聯(lián)苯型呋喃香豆素類衍生物的設計合成與活性評價[J].西北大學學報：自然科學版,2014,44(4)：573-577.

[17]Li N,He J,Zhan Y Z,et al.Design,synthesis and preliminary evaluation of novel imperatorin derivatives as vasorelaxant agents[J].Med Chem,2011,7(1):18-23.

[18]Xu Y C,Leung S W S,Yeung D K Y,et al.Structure-activity relationships of flavonoids for vascular relaxation in porcine coronary artery[J].Phytochemistry,2007,(68):1179-1188.