手掌參多糖延緩衰老作用的研究

余培芝,韓鴻萍,尚 軍,陳 志

(青海師范大學,青藏高原藥用動植物資源重點實驗室,西寧 810008)

手掌參別名手參、佛手參、陰陽草、手兒參等,藏藥名為旺拉,系蘭科手參屬多年生草本植物手掌參(Gymnadeniaconopsea)的塊莖。手掌參是蒙醫(yī)常用的中藥材,在多部典籍中有記載[1-3],具有補氣養(yǎng)血、活血止痛、益腎健脾等多種功效。目前關于手掌參的藥理活性研究較少,而植物多糖是大多藥用植物的主要活性物質(zhì),在抗衰老、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等[4-7]方面發(fā)揮著重要功能,是近年來研究的熱點。本實驗用D-半乳糖制備小鼠亞急性衰老模型[8],探討手掌參多糖延緩衰老的可能機制,以期為手掌參多糖的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器 Eppendorf AG 22331 Hamburg高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；UV-1800型紫外分光光度計(日本島津公司)；xMark BIO-RAD酶標儀(BIO-RAD公司)；MB100-4P微孔板孵育器(金壇市盛藍儀器制造有限公司)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；可調(diào)移液器(上海榮泰生化工程有限公司)。

1.2試藥 D(+)-半乳糖(上海中秦化學試劑有限公司)；天然維生素E軟膠囊(山東圣海保健品有限公司)；總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒、過氧化氫酶(CAT)測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測試盒、丙二醛(MDA)測試盒和BCA法蛋白定量測試盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3動物 昆明種小鼠,由蘭州大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。

2 方法

2.1手掌參多糖的制備 手掌參來源于青海省果洛藏族自治州,經(jīng)陳志教授鑒定為蘭科植物手掌參(Gymnadeniaconopsea)的干燥塊莖。手掌參經(jīng)干燥、粉碎,過60目篩,石油醚脫脂,乙醇除雜,水提醇沉,除蛋白,醇沉,用無水乙醇、丙酮和乙醚洗滌,真空干燥等程序,得手掌參多糖,質(zhì)量分數(shù)達89.80%。

2.2實驗動物分組、造模及給藥方法 昆明種小鼠,6周齡,體質(zhì)量為18～22 g,雌雄各半,共60只。實驗室適應1周后按體質(zhì)量隨機分為6組,分別為空白對照組,衰老模型組,陽性對照組和手掌參多糖高、中、低劑量組。每組10只,自由飲食和飲水,每5 d稱定1次體質(zhì)量。第1～10天,空白對照組每日頸背部皮下注射生理鹽水10 mL·kg-1·BW-1,灌胃等體積生理鹽水；衰老模型組,陽性對照組和手掌參多糖高、中、低劑量組每日頸背部皮下注射0.5 g·kg-1D-半乳糖溶液,灌胃生理鹽水10 mL·kg-1·BW-1。從第11 天開始,空白對照組每日頸背部皮下注射生理鹽水10 mL·kg-1·BW-1,灌胃等體積生理鹽水；衰老模型組,陽性對照組和手掌參多糖高、中、低劑量組,分別灌胃生理鹽水10 mL·kg-1·BW-1、21.6 mg·kg-1維生素E溶液以及0.20,0.10和0.05 g·kg-1手掌參多糖溶液,并同時頸背部皮下注射0.5 g·kg-1D-半乳糖溶液。連續(xù)給藥60 d。

2.3生化指標測定 末次給藥24 h后摘取眼球取血,血液4 ℃靜置,待析出血清后以3 000 r·min-14 ℃離心15 min,在-80 ℃保存上清液。迅速取肝臟、全腦,用4 ℃生理鹽水漂洗,除去血液和結締組織,用濾紙拭干,稱定質(zhì)量,計算小鼠臟器指數(shù),臟器指數(shù)(%)=臟器質(zhì)量(g)/小鼠體質(zhì)量(g)×100%。分別取部分肝臟和全腦,稱定質(zhì)量,按照質(zhì)量∶體積=1∶9的比例,加入9倍體積的4 ℃生理鹽水制成肝勻漿和腦勻漿,即得質(zhì)量分數(shù)為10%的組織勻漿。血清、肝組織和腦組織中T-SOD、CAT、GSH-PX活性及MDA含量按照試劑盒說明書進行操作。

3 結果與分析

3.1小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的測定結果 實驗結果顯示,與衰老模型組比較,空白對照組、陽性對照組和手掌參多糖高劑量組體質(zhì)量均明顯增加(P<0.01),手掌參多糖中、低劑量組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與衰老模型組比較,空白對照組和陽性對照組肝臟指數(shù)均顯著提高(P<0.01),手掌參多糖高劑量組肝臟指數(shù)顯著提高(P<0.05),手掌參多糖中、低劑量組肝臟指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1多糖對小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的影響

Tab.1 Effects of polysaccharide on body weight and liver index in mice (n=10)

注：與衰老模型組比較*P<0.05,**P<0.01。

3.2血清中T-SOD、CAT和GSH-PX的活性以及MDA含量的測定結果 實驗結果顯示,空白對照組血清中的T-SOD、CAT和GSH-PX活性均大于衰老模型組(P<0.01),MDA含量則小于衰老模型組(P<0.01)。陽性對照組與衰老模型組比較,血清T-SOD(P<0.05)、CAT(P<0.05)和GSH-PX(P<0.01)活性均顯著提高,而MDA含量降低(P<0.01)。手掌參多糖高劑量組與衰老模型組比較,血清T-SOD(P<0.05)、CAT(P<0.01)和GSH-PX(P<0.05)活性均顯著提高,而MDA含量下降(P<0.05)。手掌參多糖中、低劑量組與衰老模型組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

3.3肝組織中T-SOD、CAT和GSH-PX活性以及MDA含量的測定結果 實驗結果顯示,空白對照組肝組織中T-SOD、CAT和GSH-PX活性均大于衰老模型組(P<0.01),而MDA含量小于衰老模型組(P<0.01)。陽性對照組與衰老模型組比較,T-SOD(P<0.01)、CAT(P<0.05)和GSH-PX(P<0.05)活性均顯著提高,MDA含量降低(P<0.05)。手掌參多糖高劑量組與衰老模型組比較,T-SOD(P<0.01)、CAT(P<0.05)和GSH-PX(P<0.05)活性均顯著提高,MDA含量下降(P<0.01)。手掌參多糖中、低劑量組與衰老模型組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表2多糖對小鼠血清中T-SOD、CAT和GSH-PX活性以及MDA含量的影響

Tab.2 Effects of polysaccharide on the activities of T-SOD,CAT,GSH-PX and the content of MDA in serum of mice (n=10)

注：與衰老模型組比較*P<0.05,**P<0.01。

表3多糖對小鼠肝組織中T-SOD、CAT、GSH-PX和MDA含量的影響

Tab.3 Effects of polysaccharide on the activities of T-SOD,CAT,GSH-PX and the content of MDA in liver tissue of mice (n=10)

注：與衰老模型組比較*P<0.05,**P<0.01。

3.4腦組織中T-SOD、CAT和GSH-PX活性以及MDA含量的測定結果 實驗結果顯示,空白對照組的腦組織T-SOD、CAT和GSH-PX活性均大于衰老模型組(P<0.01),MDA含量低于衰老模型組(P<0.01)。陽性對照組與衰老模型組比較,T-SOD、CAT和GSH-PX活性均顯著提高(P<0.01),MDA含量降低(P<0.01)。手掌參多糖高劑量組與衰老模型組比較,T-SOD(P<0.05)、CAT(P<0.05)和GSH-PX(P<0.01)活性均顯著提高,MDA含量下降(P<0.01)。手掌參多糖中、低劑量組與衰老模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4多糖對小鼠腦組織中T-SOD、CAT和GSH-PX活性以及MDA含量的影響

Tab.4 Effects of polysaccharide on the activities of T-SOD,CAT,GSH-PX and the content of MDA in brain tissue of mice (n=10)

注：與衰老模型組比較*P<0.05,**P<0.01。

4 討論

小鼠衰老模型的建立方法主要有以下4種：自然衰老法、D-半乳糖注射法、臭氧損傷法和胸腺摘除法[8]。D-半乳糖注射法因其價格低廉、操作簡便、結果穩(wěn)定而廣泛應用于各種與衰老相關的實驗中[9-11]。衰老代謝學說認為[8],長期給動物注射D-半乳糖,會使機體細胞內(nèi)D-半乳糖質(zhì)量濃度上升,在糖醛還原酶作用下還原成細胞不能繼續(xù)代謝的半乳糖醇,影響正常滲透壓,導致機體代謝發(fā)生紊亂,氧化防御系統(tǒng)遭到破壞,大量自由基和超氧陰離子、過氧化脂質(zhì)等集聚,引起機體衰老。

體質(zhì)量是動物實驗中非常重要的指標之一,能反映機體綜合代謝和體能[18]。本實驗衰老模型組體質(zhì)量減輕,可能與D-半乳糖所致的代謝紊亂有關。臟器指數(shù)是實驗動物重要的生物指標之一,其大小能在一定程度上反映器官功能的強弱[19]。肝臟是人體重要的生命器官,在機體代謝、免疫和膽汁生成等方面起著重要作用,因此檢測實驗動物的肝臟指數(shù)能更好地評價機體狀態(tài)。

本實驗中,手掌參多糖高劑量組能顯著提高衰老小鼠血清、腦組織和肝組織中T-SOD、CAT、GSH-PX活性(P<0.01,P<0.05),降低MDA含量(P<0.01,P<0.05),增加衰老小鼠體質(zhì)量(P<0.01),還能顯著提高衰老小鼠肝臟指數(shù)(P<0.05),結果表明,本實驗成功復制了D-半乳糖亞急性衰老模型。

綜上所述,手掌參多糖能通過提高機體T-SOD、CAT和GSH-PX等抗氧化酶活性,降低MDA含量和增加免疫器官指數(shù)而延緩小鼠的衰老進程。

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