藏骨寶膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

周 虹,高素莉,楊志福,文愛東

(第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科,西安 710032)

中藥復(fù)方制劑藏骨寶膠囊[蘭制字(2011)F68012]為本院自制制劑,全方主要由打箭菊、甘青青蘭、秦皮和藏木香等組成,是藏藥秘方,具有接骨蓄筋、強(qiáng)身健體的功效,臨床用于治療骨折后的疼痛和抗骨質(zhì)疏松[1]。秦皮作為君藥,其活性成分為秦皮甲素和秦皮乙素,具有抗炎、鎮(zhèn)痛[2]的功效；土木香內(nèi)酯是藏木香[3-5]的主要成分,具有行氣止痛的功效；齊墩果酸是甘青青蘭的主要成分,具有清熱祛濕、疏風(fēng)解表的功效[6]?，F(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對TLC鑒別描述不規(guī)范,無含量測定的質(zhì)量控制。為了更好地控制藥品質(zhì)量,在原標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上完善了藏木香和甘青青蘭的TLC鑒別,建立了秦皮中秦皮甲素和秦皮乙素的含量測定,方法簡單準(zhǔn)確,提高了標(biāo)準(zhǔn)對藥品質(zhì)量的可控性。

1 儀器與試藥

1.1儀器 高效液相色譜儀,包括輸液泵(LC-10Atvp)和紫外檢測器(SPD-10Avp)(日本島津公司)；SQP分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；KQ5200DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 藏骨寶膠囊(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥劑科提供,批號：130810,130811,130812)；土木香內(nèi)酯對照品(批號110760-200507)、齊墩果酸對照品(批號110709-200505)、秦皮甲素對照品(批號 110740-200405,質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.5%)和秦皮乙素對照品(批號110741-200506,質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.1%),均購自中國食品藥品檢定研究院；陰性樣品為自制；硅膠G薄層板(青島海洋化工廠)；乙腈為色譜醇；其余試劑為分析純；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1土木香內(nèi)酯的TLC鑒別 取本品內(nèi)容物2 g,加氯仿20 mL,超聲處理30 min[7-8],濾過,將濾液濃縮至5 mL,作為供試品溶液。取按照樣品同樣工藝制備而成的缺藏木香的陰性樣品2 g,按照上述方法制備缺藏木香的陰性對照溶液。另取土木香內(nèi)酯對照品,加氯仿制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的對照品溶液；按照TLC法(《中國藥典》2015年版四部通則0502)實(shí)驗(yàn),吸取上述3種溶液各6 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(5∶2)為展開劑[9],展開,取出,晾干,噴以0.5 g·L-1的香草醛硫酸溶液,在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中,在與對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn),且陰性對照無干擾,見圖1A。

2.2齊墩果酸的TLC鑒別 取本品內(nèi)容物2 g,加甲醇35 mL,超聲30 min[10],濾過,濾液蒸干,殘?jiān)蛹状既芤? mL,作為供試品溶液。取按照樣品同樣工藝制備而成的缺甘青青蘭的陰性樣品2 g,按照上述方法制備缺甘青青蘭的陰性對照溶液。另取齊墩果酸對照品,加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的對照品溶液。按照TLC法(《中國藥典》2015年版四部通則0502)實(shí)驗(yàn),吸取上述3種溶液各5 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(14∶4∶0.5)為展開劑[11-12],展開,取出,晾干,噴以100 mL·L-1的硫酸乙醇溶液,在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中,在與對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn),且陰性對照無干擾,見圖1B。

2.3秦皮甲素和秦皮乙素的含量測定

2.3.1色譜條件 色譜柱：Kromasi1 C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液(12∶88)[13]；檢測波長：334 nm[14]；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

A B

圖1TLC圖

A.土木香內(nèi)酯：1,4.土木香內(nèi)酯對照品；2.藏骨寶膠囊樣品；3.缺藏木香陰性對照。B.齊墩果酸：1,4.齊墩果酸對照品；2.藏骨寶膠囊樣品；3.缺甘青青蘭陰性對照。

Fig.1 TLC chromatograms

A.alantolactone：1,4.reference of alantolactone；2.Zanggubao Capsules sample；3.negative control lack of Tibet inula.B.oleanic acid:1,4.reference of oleanic acid；2.Zanggubao Capsules sample；3.negative control lack ofHerbaDracocephaliTangutici.

2.3.2溶液的制備

2.3.2.1對照品溶液 分別精密稱取秦皮甲素和秦皮乙素對照品5和2 mg,分別置于50 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得系列對照品儲備液。分別精密吸取秦皮甲素和秦皮乙素儲備液4.0和3.0 mL,分別置于10 mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻,即得系列對照品溶液。

2.3.2.2供試品溶液 稱取本品0.5 g,置于50 mL量瓶中,加甲醇45 mL,超聲處理30 min,放冷,加甲醇定容至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,過0.45 μm濾膜,作為供試品溶液。

2.3.2.3陰性樣品溶液 按照處方比例和制備工藝制成不含秦皮甲素和秦皮乙素的樣品,按照2.3.2.2項(xiàng)下方法制成陰性樣品溶液。

2.3.3方法學(xué)考察 取對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各20 μL,依次進(jìn)樣進(jìn)行圖譜分析。結(jié)果顯示,在與對照品色譜峰相應(yīng)的位置上,供試品有相同保留時間的色譜峰,陰性樣品溶液則在此位置無吸收、無干擾。見圖2。

2.3.4線性關(guān)系 精密稱取秦皮甲素、秦皮乙素對照品2.71和1.64 mg,分別置于25 mL量瓶中,以甲醇為溶劑,配制成質(zhì)量濃度分別為108.4和65.6 μg·mL-1的秦皮甲素和秦皮乙素對照品溶液,分別吸取2種對照品溶液各0.5,1,2,3,4,5 mL,置于10 mL量瓶中,分別加甲醇定容至刻度。依次注入高效液相色譜儀,測定峰面積,記錄色譜圖。以對照品的質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)(x)、對照品的峰面積A為縱坐標(biāo)(y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。秦皮甲素的回歸方程為：y=16 302x-7 249.3,r=0.999 3,結(jié)果表明,秦皮甲素質(zhì)量濃度在5.42～54.2 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。秦皮乙素的回歸方程為：y=36 579x-9 377.2,r=0.999 5,結(jié)果表明,秦皮乙素質(zhì)量濃度在3.28～32.8 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2HPLC圖

1.秦皮甲素對照品；B.秦皮乙素對照品；C.供試品；D.陰性對照；1.秦皮甲素；2.秦皮乙素。

Fig.2 HPLC chromatograms

A.aesculin reference substance；B.esculi reference substance；C.sample；D.negative；1.aesculin； 2.esculi.

2.3.5精密度 精密吸取2.3.2.1項(xiàng)下制備的秦皮甲素(54.2 μg·mL-1)和秦皮乙素(32.8 μg·mL-1)對照品溶液各20 μL,按照2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,重復(fù)測定6次峰面積(A),考察其精密度。結(jié)果表明,秦皮甲素峰面積(A)和秦皮乙素峰面積(A)的RSD值分別為0.68%(n=6)和0.96% (n=6),結(jié)果表明,該方法精密度良好。

2.3.6穩(wěn)定性 精密吸取同一份供試品溶液(批號130810),分別在0,2,4,6,8和12 h進(jìn)行測定,秦皮甲素和秦皮乙素峰面積的RSD值分別為0.84% (n=6)和1.82% (n=6),結(jié)果表明,樣品溶液在配制后的12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7重復(fù)性 精密稱取同一批樣品6份(批號130810),按照2.3.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。秦皮甲素和秦皮乙素峰面積的RSD值分別為1.43% (n=6)和0.55% (n=6),結(jié)果表明,該方法重復(fù)性良好。

2.3.8加樣回收率 精密稱取已知含量的樣品9份(批號130811,含秦皮甲素8.330 0 mg·g-1,含秦皮乙素2.380 0 mg·g-1),各0.25 g,精密稱定,加入秦皮甲素和秦皮乙素對照品適量,按照2.3.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,依次進(jìn)樣測定,計算回收率,結(jié)果見表1～2。

表1秦皮甲素的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 Results of recovery test of aesculin (n=9)

表2秦皮乙素的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 Results of recovery test of esculetin (n=9)

2.3.9樣品測定 分別精密稱定藏骨寶膠囊的3批樣品(130601,130802,131001)各0.5 g,每批3份,按照2.3.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,計算秦皮甲素和秦皮乙素的總含量。結(jié)果表明,3批樣品中秦皮甲素和秦皮乙素的總含量分別為0.51,0.53和0.52 mg·g-1。

3 討論

藏藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定與完善在思路和方法上與中藥類似,后者的研究思路與技術(shù)為藏藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究提供了借鑒。藏藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立既能保持藏藥的特色,也有利于促進(jìn)各民族醫(yī)藥的交流和發(fā)展。

在藏骨寶膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定中,TLC法對區(qū)分藥材的真?zhèn)翁峁┝硕ㄐ缘囊罁?jù)。其中土木香內(nèi)酯的TLC中,考察了樣品在甲醇中超聲和靜置后的斑點(diǎn)情況,得出超聲提取的效率更高,斑點(diǎn)顯色更清晰；在土木香內(nèi)酯的TLC中,將原有的展開劑環(huán)己烷-丙酮-乙酸乙酯(5∶2∶1)改為現(xiàn)在的甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(14∶4∶0.5),斑點(diǎn)顯色清晰,分離度好,專屬性強(qiáng)。

在處方中,秦皮的配比占最大,秦皮的有效成分為秦皮甲素和秦皮乙素,故實(shí)驗(yàn)中考察了秦皮甲素和秦皮乙素的含量測定方法[15-18]。HPLC法在對秦皮中的秦皮甲素和秦皮乙素進(jìn)行定量測定時,對流動相配比進(jìn)行了考察,結(jié)果以乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液(12∶88)為流動相,此流動相中秦皮甲素和秦皮乙素對雜質(zhì)峰的分離度較好,保留時間適宜,故選其為流動相。故將此含量測定方法納入本質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

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