一種乳酸桿菌-玉竹多糖合生元的制備工藝研究

鄧麗娜*，袁 斐

（1．張家港市中醫(yī)院，江蘇 蘇州 215600；2．南京中醫(yī)藥大學翰林學院，江蘇 泰州 225300）

合生元是有益菌和益生元相結(jié)合的生物制劑，合生元具有調(diào)節(jié)人或動物腸道微生態(tài)環(huán)境，增強免疫力和消化能力的作用[1]。益生菌在腸道內(nèi)能夠抑制有害微生物的生長，增強非特異性免疫功能來預防疾病。益生元則可以選擇性地促進定值于腸道內(nèi)的微生物的生長，調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，改善宿主的消化能力，促進宿主健康[2-3]。通常合生元的有兩種類型：配伍型合生元與發(fā)酵型合生元。配伍型合生元是將益生菌和益生元按照一定比例配伍制備得到。這種合生元可以保證益生菌和益生元各自的穩(wěn)定性，但其活性無法得到保證；發(fā)酵型合生元是將益生元與益生菌進行體外混合發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物作為合生元飼喂動物。這種合生元可以充分發(fā)揮益生菌和益生元各自的特點與優(yōu)勢，兩者相互促進，協(xié)同發(fā)揮作用，其效果往往比配伍型合生元要好[4-5]。

近年來，中藥在合生元制備領(lǐng)域表現(xiàn)出較好的研究前景。很多研究者發(fā)現(xiàn)中藥中的活性物質(zhì)，如多糖類、皂苷類、三萜類等成分具有明顯的益生活性，不僅能促進益生菌的生長，同時也能發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的作用[6-7]。玉竹為百合科植物玉竹Polygonatum odoratum （Mill.）Druce的干燥根莖。性微寒，味甘平，歸肺、胃經(jīng)。具有養(yǎng)陰潤燥，生津止渴之功[8]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，玉竹中的多糖類成分是其發(fā)揮藥理作用的主要有效成分之一。玉竹多糖具有較好的抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、增強動物耐缺氧能力的作用[9-12]。近年來，以中藥多糖類成分作為益生元與乳酸桿菌共同發(fā)酵制備合生元的研究越來越多。有學者將黃芪多糖與乳桿菌共發(fā)酵制備黃芪多糖合生元，飼養(yǎng)小鼠結(jié)果表明，該合生元能顯著提升小鼠免疫能力。

本實驗旨在研究玉竹多糖-乳酸桿菌體外合生發(fā)酵的條件進而制備合生元，為玉竹多糖合生元飼料添加劑的開發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

玉竹購于江蘇海昌中藥集團。經(jīng)南京中醫(yī)藥大學陳建偉教授鑒定為百合科植物玉竹Polygonatum odoratum（Mill.）Druce的干燥根莖。樣品采集后進行分揀處理，保存于干燥陰涼處。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉竹多糖的制備

稱取玉竹干燥樣品2.0 kg，按照1:10（m/V）比例加入石油醚脫脂兩次，脫脂后樣品烘干，加入10倍量的80%乙醇，80 ℃水浴回流提取2 h，趁熱濾過，濾渣用熱的80%乙醇，洗滌2～3次，濾渣干燥后，加入10倍量的純水于150℃加熱回流，提取兩次，2 h/次，合并提取液。減壓濃縮水提液至適當體積，緩慢加入無水乙醇，使含醇量達到80%，4℃靜畳過夜，離心，得上清濾液和沉淀，沉淀即為玉竹粗多糖。

稱取粗多糖100 g，溶解于1.0 L純水中，得多糖水溶液。稱取三氯乙酸100 g，溶解于純水中，制成5%三氯乙酸溶液。將粗多糖和三氯乙酸溶液按體積比1:1混勻，4℃靜畳過夜，離心取上清，再加入和上清液同體積的三氯乙酸溶液，進行二次除蛋白。將除完蛋白后的多糖溶液減壓濃縮至一定體積，緩慢加入無水乙醇，使其含醇量達80%，于4℃靜置過夜后，用布氏漏斗抽濾，得到的沉淀即為除去蛋白后的多糖。將該沉淀溶于去離子超純水中，經(jīng)AB-8型大孔吸附樹脂吸附，進行脫色、除雜處理，冷凍干燥后即得玉竹水溶性多糖（YZP）。

1.2.2 乳桿菌生長曲線及種子液培養(yǎng)時間的確定

無菌操作臺中，用接種環(huán)將保存在固體培養(yǎng)基上的乳桿菌挑取出一環(huán)到含有100 ml MRS培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在30℃、180 r/min的恒溫振蕩器中培養(yǎng)，每隔2 h取樣一次，2 mL/次，菌液于6000 r/min離心后棄去上清液，沉淀加入等體積的蒸餾水混勻，在600 nm下測定其菌懸液的相對吸光度OD值，平行三次。以時間（h）為橫坐標，OD值為縱坐標繪制乳桿菌24 h生長曲線，確定種子液的培養(yǎng)時間。

1.2.3 乳桿菌培養(yǎng)初始pH值的確定

將MRS培養(yǎng)基在滅菌前用1 mol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH值分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，各培養(yǎng)基按照100 ml的裝液量分別裝入250 mL錐形瓶中，121℃滅菌20 min。無菌操作臺中，用接種環(huán)將保存在固體培養(yǎng)基上的乳桿菌接到含有100 mL MRS培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，按照2.3.3項下篩選出的最佳活化時間培養(yǎng)。然后按2%的接種量分別接種到不同pH值的MRS培養(yǎng)基中，放入30℃的恒溫振蕩器中培養(yǎng)，每隔4 h取樣一次，2 mL/次，菌液于6000 r/min離心后棄去上清液，沉淀加入等體積的蒸餾水混勻，在600 nm下測定其菌懸液的相對吸光度OD值，平行三次。以時間（h）為橫坐標，OD值為縱坐標繪制乳桿菌在不同初始PH值下的生長曲線，優(yōu)選出最佳培養(yǎng)PH值。

1.2.4 乳桿菌接種量的確定

無菌操作臺中，用接種環(huán)將保存在固體培養(yǎng)基上的乳桿菌接種到MRS培養(yǎng)基中活化，然后按照不同接種量（1%、2%、4%、6%）接種到最優(yōu)pH值的MRS培養(yǎng)基中，放入到30℃的恒溫振蕩器中培養(yǎng)，每隔2 h取樣一次，每次2 ml，菌液于6000 r/min離心后棄去上清液，沉淀加入等體積的蒸餾水混勻，在600 nm分光光度計下測定其菌懸液的相對吸光度OD值，平行三次。以時間（h）為橫坐標，OD值為縱坐標繪制乳桿菌在不同接種量下的生長曲線，優(yōu)選出最佳接種量。

1.2.5 乳桿菌培養(yǎng)溫度的確定

無菌操作臺中，用接種環(huán)將保存在固體培養(yǎng)基上的乳桿菌接到含有100 ml MRS培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，按照最佳活化時間培養(yǎng)活化，然后按最適的接種量接種到MRS培養(yǎng)基中，分別放入到恒溫振蕩器中，于30℃、34℃、37℃和40℃的條件下振蕩培養(yǎng)（180 r/min），每隔2 h取樣一次，2 mL/次，菌液于6000 r/min離心后棄去上清液，沉淀加入等體積的蒸餾水混勻，在600 nm下測定其菌懸液的相對吸光度OD值，平行三次。以時間（h）為橫坐標，OD值為縱坐標繪制乳桿菌在不同溫度下的生長曲線，篩選出最佳培養(yǎng)溫度。

1.2.6 玉竹多糖最適添加量和最適培養(yǎng)時間的確定

在基礎(chǔ)SDM培養(yǎng)基上分別加入不同比例的YZP，使其濃度分別為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g/L。各培養(yǎng)基按照100 mL的裝液量分別裝入250 mL錐形瓶中，121℃滅菌20 min。按照上述篩選的培養(yǎng)條件接種后放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔4 h取樣一次，2 mL/次，菌液于6000 r/min離心后棄去上清液，沉淀加入等體積的蒸餾水混勻，在600 nm下測定其菌懸液的相對吸光度OD值，平行三次。以時間（h）為橫坐標，OD值為縱坐標繪制乳桿菌的生長曲線，篩選出兩種多糖的最適添加量和最適培養(yǎng)時間。

2 結(jié) 果

2.1 乳桿菌生長曲線及種子液培養(yǎng)時間的確定

乳桿菌CICC20261的生長曲線可以看出，在0～8 h之間，乳桿菌生長緩慢，8～12 h之間生長迅速，而在12 h后，生長趨于平緩，此時乳桿菌處于生長的穩(wěn)定期，此時菌液活菌數(shù)高，菌液濃度大。因此，12 h可以作為乳桿菌CICC20261種子液的培養(yǎng)時間。

2.2 乳桿菌在不同PH中的生長曲線

不同pH值下乳桿菌的生長情況可以看出，培養(yǎng)基的初始pH值對乳桿菌的生長影響較大，在pH 3.5～4.5時，乳桿菌的生長受到抑制。同樣，偏堿性的環(huán)境對乳桿菌的生長也有抑制，在pH大于7.5時，乳桿菌的生長趨勢明顯小于在pH4.5～7.0之間。通過比較發(fā)現(xiàn)，在pH5.0時乳桿菌的生長趨勢最好，因此確定適宜的初始pH值為5.0。

2.3 乳桿菌在不同接種量下的生長趨勢

不同接種量下乳桿菌的生長曲線可以看出，隨著接種量的提高，乳桿菌的在12 h內(nèi)的OD值是不斷增大的。接種量為4%的OD值與接種量為6%的OD值差異并不明顯，從節(jié)省接種量的方面考慮，確定最適宜的接種量為4%。

2.4 乳桿菌在不同溫度下的生長曲線

不同培養(yǎng)溫度下乳桿菌的生長曲線可以看出，在34℃下乳桿菌的生長趨勢最好。因此，選擇34℃為乳桿菌的最適宜培養(yǎng)溫度。

2.5 乳桿菌在不同多糖濃度下的生長曲線

乳桿菌在不同濃度的YZP下的生長曲線可以看出，隨著YZP濃度的增加，在培養(yǎng)的前6 h期間，乳桿菌的生長隨著多糖濃度的增加而增加。培養(yǎng)6h后，乳桿菌的生長趨于平緩。從節(jié)省YZP的用量和縮短培養(yǎng)時間的角度考慮，確定YZP的最佳加入量為6.0 g/L，培養(yǎng)時間為10h。

2.6 合生元產(chǎn)品的制備及其活菌數(shù)的檢測

把培養(yǎng)好的菌液按1 L菌液：0.5 kg麩皮的比例用干燥細麩皮吸附，在45℃烘箱中烘干即得乳酸菌-玉竹多糖合生元。利用平板計數(shù)法對合生元活菌數(shù)進行檢測，結(jié)果為4×109cfu/g左右。

3 討 論

合生元的效果取決于是否選擇一個好菌種，取決于是否選對與益生菌具有協(xié)同作用的益生元。本實驗采用乳酸菌CICC20261及玉竹多糖分別作為益生菌和益生元進行共發(fā)酵制備合生元。實驗結(jié)果表明玉竹多糖對乳酸菌具有良好的促生長作用，可以用于合生元的發(fā)酵制備，是良好的益生元。

為了確定乳酸菌-玉竹多糖合生元的最佳發(fā)酵工藝，本實驗通過考察乳桿菌CICC20261的最適生長條件，確定了乳桿菌的最佳活化培養(yǎng)時間為12 h，初始培養(yǎng)基pH值為5.0，接種量為4%，培養(yǎng)溫度為34℃。在此基礎(chǔ)上考察了玉竹多糖的最佳加入量和培養(yǎng)時間，玉竹多糖加入量為6 g/L，培養(yǎng)時間為10 h。最終在優(yōu)選的培養(yǎng)條件下，制備了玉竹多糖合生元。本試驗將發(fā)酵好的菌液以細麩皮作為載體進行吸附后在45℃烘干制成干燥的細粉狀產(chǎn)品，并聞到類似乳酸菌發(fā)酵制品典型的味道，符合對益生菌制劑產(chǎn)品的性狀檢測方面的要求。本實驗通過考察玉竹多糖與乳酸菌的共發(fā)酵培養(yǎng)條件，確定了發(fā)酵培養(yǎng)的最佳工藝，為玉竹多糖合生元的開發(fā)提供了科學依據(jù)。