丙烯酰胺對小鼠卵母細(xì)胞成熟及發(fā)育潛能的研究

陳曉麗，魏澤鋒，于春娜，牛煥付，王雪楠，楊愛軍

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，濟(jì)寧 272029)

丙烯酰胺(Acryl amide，AA)外觀呈片狀晶體，無色無味，有毒性，易溶于水、醇等極性溶劑，在采礦業(yè)、造紙業(yè)、污水處理、化妝品和廢物加工工業(yè)，丙烯酰胺聚合物常被用作篩選和凝集的輔助劑[1-2]。日常生活中，淀粉類食物如土豆、谷物在高溫(>120℃)烹飪時發(fā)生美拉德反應(yīng)即非酶褐變反應(yīng)，此時某類氨基酸如天冬酰胺酸與葡萄糖結(jié)合形成了丙烯酰胺[3-4]。

研究表明，丙烯酰胺通過職業(yè)性接觸、非職業(yè)性接觸(被其污染的飲用水和食物)等進(jìn)入生物體后引起運(yùn)動失調(diào)，平衡紊亂，嗜睡，幻覺，記憶喪失等神經(jīng)毒性作用[5-6]。在大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)丙烯酰胺最容易通過消化道、呼吸道和破損皮膚進(jìn)入體液循環(huán)，也可通過血液進(jìn)入胎盤使胚胎中毒[7-9]。丙烯酰胺在生物體內(nèi)的主要代謝途徑有兩條，其中一個主要途徑是與谷胱苷肽(GSH)結(jié)合，通過谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)催化，產(chǎn)生的代謝物 N-乙酰-S-半胱氨酸通過尿液大量排出；另一代謝途徑是丙烯酰胺通過細(xì)胞色素P450發(fā)生環(huán)氧化反應(yīng)形成環(huán)氧丙酰胺(GA)[10-11]。

有關(guān)于雄性SD大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，丙烯酰胺會影響大鼠睪丸正常的雄性激素分泌，降低血清中睪酮水平；丙烯酰胺還能減小大鼠精液濃度，增加精子畸形率，使得曲細(xì)精管表現(xiàn)出病理學(xué)損傷[12-13]。通過對大鼠、小鼠腹腔注射丙烯酰胺體內(nèi)染毒處理后發(fā)現(xiàn)，初級精母細(xì)胞中紡錘體組裝不正常，染色體非整倍體率增加，姐妹染色單體高頻交換和斷裂，在次級精母細(xì)胞中基因突變率增加，DNA容易發(fā)生斷裂[14-15]。丙烯酰胺的雄性生殖毒理作用已經(jīng)有很多報道，但是有關(guān)于其雌性生殖毒理的研究較少，丙烯酰胺既然影響雄性動物精子的發(fā)生和成熟，是否會影響小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中，紡錘體的形成，染色體的排布等生理活動，是否會影響卵母細(xì)胞的成熟，受精和早期胚胎的發(fā)育。我們以暴露于丙烯酰胺的ICR雌性小鼠為研究對象，統(tǒng)計其卵母細(xì)胞的成熟率、孤雌激活率、觀察卵母細(xì)胞成熟后紡錘體、染色體形態(tài)和丙烯酰胺對小鼠卵丘顆粒細(xì)胞凋亡的影響，初步探討丙烯酰胺對小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的影響。

材料與方法

一、實驗動物與分組

1.實驗動物：購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司的6～8周健康SPF級雌性ICR小鼠(動物許可證號：SCXK(京)2012-001)，體重24～28 g，購買后在本重點(diǎn)實驗室鼠房內(nèi)飼養(yǎng)一周，使之適應(yīng)新環(huán)境。飼養(yǎng)條件為：22～26℃，控光(12 h光照，12 h黑暗)，給予生長、繁殖飼料，自由取食飲水，隨機(jī)分組。

2.分組：將實驗小鼠隨機(jī)分為4組：對照組、丙烯酰胺低、中、高劑量組，每組6只。低、中、高劑量組腹腔注射給藥量分別為：5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg。對照組腹腔注射生理鹽水，每天1次，連續(xù)藥物處理7 d，給藥后第3天對小鼠腹腔注射10 U PMSG(孕馬血清促性腺激素，寧波三生藥業(yè))，46 h后腹腔注射10 U HCG(寧波三生藥業(yè))，16 h后引頸處死小鼠，取其輸卵管壺腹部。

二、主要試劑和儀器

丙烯酰胺(Acryl amide)、多聚甲醛購自美國Sigma公司；生物體式顯微鏡購自Motic公司；二氧化碳培養(yǎng)箱購自日本三洋電器公司；激光掃描共聚焦顯微鏡購自德國Zeisis公司。

三、研究方法

1. 統(tǒng)計成熟卵母細(xì)胞數(shù)量：用一次性無菌注射器針尖劃破輸卵管壺腹部，取卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體，用透明質(zhì)酸酶消化掉外面的卵丘顆粒細(xì)胞，統(tǒng)計成熟卵母細(xì)胞的數(shù)量。

2. 統(tǒng)計孤雌激活率：將各組獲得的成熟卵母細(xì)胞置于10 mmol/L SrCl2培養(yǎng)液中，孤雌激活處理2.5 h，隨后將卵母細(xì)胞移入不含有SrCl2的培養(yǎng)液中培養(yǎng)3.5 h，隨后觀察到卵母細(xì)胞有1個或者2個原核或者分裂為2個具有原核的細(xì)胞則被視為孤雌激活成功，統(tǒng)計孤雌激活率。

3. 觀察分析丙烯酰胺對小鼠卵母細(xì)胞紡錘體組裝和染色體排列的影響：各組卵母細(xì)胞先于4%多聚甲醛中固定30 min，再移到透膜液孵育30 min，隨后將卵母細(xì)胞用封閉液處理60 min，接著用稀釋的FITC標(biāo)記的α-微管蛋白抗體孵育60 min，PI避光孵育5 min，清洗卵母細(xì)胞3次，將卵母細(xì)胞移到載玻片上的DABCO微滴中，用蓋玻片輕輕蓋上用激光共聚焦顯微鏡觀察，拍照。

4. 利用TUNEL技術(shù)檢測丙烯酰胺對卵丘-卵母細(xì)胞凋亡的影響：各組卵丘-卵母細(xì)胞在4%多聚甲醛中固定30 min后移到新鮮透膜液孵育30 min，隨后將卵母細(xì)胞用封閉液處理60 min，接著用稀釋的TUNEL試劑孵育60 min，用DAPI避光孵育5 min，清洗卵母細(xì)胞3次，將卵丘-卵母細(xì)胞移到載玻片上的DABCO微滴中，用蓋玻片輕輕蓋上用激光共聚焦顯微鏡觀察，拍照。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 18.0進(jìn)行t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、丙烯酰胺對小鼠卵母細(xì)胞成熟率和孤雌激活的影響

統(tǒng)計各組獲得的小鼠成熟卵母細(xì)胞數(shù)(圖1)。低劑量組卵母細(xì)胞成熟率為(88.5±1.5)%，與對照組[(92.5±1.2)%]相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；而中、高劑量組卵母細(xì)胞成熟率分別為(79.5±1.7)%和(76.5±1.8)%，顯著低于對照組(P<0.05)。

將各實驗組別卵母細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活實驗，孤雌激活率如圖1所示。其中低劑量組孤雌激活率[(78.5±2.6)%]與對照組[(81.5±1.2)%]相仿(P>0.05)，而中、高劑量組孤雌激活率[分別為(61.6±3.2)%和(40.3±5.6)%]顯著降低(P<0.05)。

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01圖1 不同劑量丙烯酰胺對小鼠卵母細(xì)胞成熟率和孤雌激活率的影響

二、丙烯酰胺對小鼠卵母細(xì)胞紡錘體形態(tài)和染色體排列的影響

丙烯酰胺染毒處理后獲得的各組小鼠卵母細(xì)胞經(jīng)處理后，觀察其紡錘體形態(tài)(圖2)。對照組(圖2A)卵母細(xì)胞紡錘體呈梭型，染色體整齊的排列在赤道板上；低劑量組(圖2B)中，紡錘體表現(xiàn)多極化、明顯呈桶狀；中劑量組和高劑量組缺少兩極，沒有聚集成紡錘形(圖2C、D)，并且有染色體丟失沒有排列到赤道板上，赤道板上的染色體排布散亂，甚至呈現(xiàn)彌散狀態(tài)，表現(xiàn)出紡錘體組裝過程受到明顯的干擾，從而影響了染色體的正常排列。

三、丙烯酰胺對小鼠卵丘顆粒細(xì)胞凋亡的影響

丙烯酰胺染毒處理后獲得的卵丘-卵母細(xì)胞經(jīng)處理后，觀察其對卵丘顆粒細(xì)胞凋亡的影響(圖3)。與對照組(圖3A)比較，實驗組(圖3B、C、D)卵丘顆粒細(xì)胞的凋亡數(shù)量有增加趨勢，而且隨著丙烯酰胺濃度的升高，凋亡趨勢愈加明顯。

A：對照組；B～D：低、中、高劑量組；綠色熒光：α-tubulin；紅色熒光：染色體；Bar=25 μm圖2 丙烯酰胺對小鼠卵母細(xì)胞紡錘體形態(tài)和染色體排列的影響(×400)

A:對照組；B～D：低、中、高劑量組；藍(lán)色熒光：未凋亡的顆粒細(xì)胞；紅色熒光：凋亡的顆粒細(xì)胞；Bar=25 μm圖3 丙烯酰胺對小鼠卵丘顆粒細(xì)胞凋亡的影響(×400)

討 論

瑞典國家食品管理局和斯德哥爾摩大學(xué)的科學(xué)家于2002年4月發(fā)表學(xué)術(shù)論文，指出高溫加熱的多種食品中含有高濃度的丙烯酰胺，含量比世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定的飲水中丙烯酰胺含量高出500倍以上[16-17]，這引起了國際社會的強(qiáng)烈反響，人們開始了大量關(guān)于丙烯酰胺的生物毒性效應(yīng)的實驗。

有充分的證據(jù)表明，丙烯酰胺不僅對動物有神經(jīng)毒性，還有生殖毒性和致癌性，雖然目前關(guān)于丙烯酰胺的生殖毒性尚無人群資料可查，但是在一些動物實驗中丙烯酰胺誘發(fā)雌性小鼠早期卵泡閉鎖，黃體生成數(shù)量減少[18]。丙烯酰胺染毒的雄性大鼠曲細(xì)生精小管萎縮發(fā)生病變，精子數(shù)量減少，畸形率增加，精子活力減弱[19]。本實驗通過對雌性小鼠促排卵處理后，比較對照組和各實驗組之間成熟卵母細(xì)胞的數(shù)目、卵母細(xì)胞的孤雌激活率，以及觀察卵母細(xì)胞的紡錘體形態(tài)和染色體排列，分析卵母細(xì)胞外卵丘顆粒細(xì)胞的凋亡，初步評估丙烯酰胺對小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過丙烯酰胺處理后，卵母細(xì)胞外圍的卵丘顆粒細(xì)胞的凋亡有增加趨勢。卵丘顆粒細(xì)胞是卵母細(xì)胞與卵泡液之間進(jìn)行物質(zhì)交換的橋梁[20]，卵丘顆粒細(xì)胞的LHR(luteinizing hormone receptor)是卵母細(xì)胞發(fā)育過程中所必需的[21]，卵丘顆粒細(xì)胞通過細(xì)胞間的胞間連接支持卵母細(xì)胞發(fā)育成熟過程中物質(zhì)需要，卵丘顆粒細(xì)胞的凋亡勢必會降低卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量，影響其發(fā)育潛能。另外，紡錘體的正確組裝是卵母細(xì)胞成熟過程中細(xì)胞核成熟的關(guān)鍵，正常的紡錘體才能牽引著染色體在細(xì)胞周期中正確排列[22]，卵母細(xì)胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)在不同時間和空間上的有序的分子生物學(xué)變化，是卵母細(xì)胞成熟的關(guān)鍵。各個時期沒有差錯的生物學(xué)變化才能使得卵母細(xì)胞成熟并獲得繼續(xù)發(fā)育的潛能。本實驗結(jié)果顯示經(jīng)丙烯酰胺體內(nèi)染毒后，小鼠卵母細(xì)胞會呈現(xiàn)出異常形態(tài)的紡錘體，例如筒形、多極、形態(tài)散亂等；丙烯酰胺干擾了小鼠卵母細(xì)胞成熟發(fā)育過程中紡錘體的正常組裝，影響了細(xì)胞周期中染色體的正常排列，降低了其成熟質(zhì)量。孤雌激活是指通過外界刺激模仿受精過程，使卵母細(xì)胞在沒有精子的條件下被激活，使卵母細(xì)胞繼續(xù)分裂、發(fā)育的過程。早期卵母細(xì)胞的孤雌激活率能夠整體反映卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量，評估卵母細(xì)胞的后續(xù)發(fā)育潛能[21]。在正常的受精過程中，Ca2+發(fā)揮著決定性的作用，介導(dǎo)卵母細(xì)胞的皮質(zhì)反應(yīng)，孤雌激活后卵母細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，啟動皮質(zhì)反應(yīng)[23]。本實驗中丙烯酰胺可能改變了卵母細(xì)胞與外界培養(yǎng)液中Ca2+的正常代謝，干擾了卵母細(xì)胞內(nèi)的鈣離子釋放，降低了卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量，阻礙了皮質(zhì)反應(yīng)正常發(fā)生，從而使得卵母細(xì)胞的孤雌激活率降低。

卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟是一個連續(xù)、復(fù)雜的過程，是隨后卵母細(xì)胞受精、卵裂發(fā)育的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，在這個過程中如若發(fā)生差錯可能會導(dǎo)致卵母細(xì)胞發(fā)育成熟異常從而不能正常受精或受精后發(fā)育形成畸形胚胎。在卵母細(xì)胞發(fā)育成熟過程中，mRNA是必不可少的生物分子，轉(zhuǎn)錄子3＇端poly(A)尾巴對早期胚胎的發(fā)育調(diào)控起著關(guān)鍵作用[24]。丙烯酰胺進(jìn)入小鼠體內(nèi)經(jīng)過代謝形成環(huán)氧丙酰胺，環(huán)氧丙酰胺會使得mRNA的生物穩(wěn)定性降低，擾亂了卵母細(xì)胞發(fā)育過程中聚腺苷酸化的調(diào)控，影響其正常發(fā)育成熟[25]。

本實驗通過對小鼠卵母細(xì)胞孤雌激活、卵母細(xì)胞細(xì)胞骨架的組裝、卵母細(xì)胞外卵丘顆粒細(xì)胞凋亡的研究發(fā)現(xiàn)，丙烯酰胺加劇了小鼠卵丘顆粒細(xì)胞的凋亡，影響了小鼠卵母細(xì)胞成熟。經(jīng)丙烯酰胺體內(nèi)染毒后小鼠卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟受到損害，降低了其發(fā)育潛能。雖然丙烯酰胺的毒性作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步的探討，但是丙烯酰胺的毒性作用已經(jīng)證實，其使用必須要嚴(yán)格遵守國家標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)，以免危害大眾的健康。

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