p53、KRAS、APC蛋白及Ki-67在潰瘍性結(jié)腸炎2種中醫(yī)證型患者中的表達(dá)特點(diǎn)

汪 蕓，張 玲，曾 艷

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院，北京 100053)

論著

p53、KRAS、APC蛋白及Ki-67在潰瘍性結(jié)腸炎2種中醫(yī)證型患者中的表達(dá)特點(diǎn)

汪 蕓，張 玲，曾 艷

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院，北京 100053)

目的探討脾胃氣虛證和濕熱內(nèi)蘊(yùn)證潰瘍性結(jié)腸炎(UC)患者腸黏膜活檢組織中p53、KRAS、APC蛋白及增殖指數(shù)Ki-67的表達(dá)特點(diǎn)和意義。方法根據(jù)中醫(yī)辨證分型及有無(wú)異型增生將64例UC患者分為脾胃氣虛證組23例，濕熱內(nèi)蘊(yùn)證組22例，脾胃氣虛證伴低級(jí)別異型增生組9例，濕熱內(nèi)蘊(yùn)證伴低級(jí)別異型增生組10例。選取同期腸鏡活檢組織呈輕度慢性炎者10例作為正常組，大腸癌患者11例作為大腸癌組。采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各組患者腸黏膜組織內(nèi)p53、KRAS、APC蛋白及Ki-67表達(dá)情況。結(jié)果UC各組患者腸黏膜組織內(nèi)p53蛋白表達(dá)陽(yáng)性和Ki-67位于隱窩上1/2者的比例均明顯低于大腸癌組(P均<0.05)；脾胃氣虛證組和濕熱內(nèi)蘊(yùn)證組p53蛋白表達(dá)陽(yáng)性和Ki-67位于隱窩上1/2者的比例基本相同；脾胃氣虛證伴低級(jí)別異型增生組p53蛋白表達(dá)陽(yáng)性和Ki-67位于隱窩上1/2者的比例高于濕熱內(nèi)蘊(yùn)證伴低級(jí)別異型增生組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；UC各組患者腸黏膜組織內(nèi)均未見(jiàn)KRAS蛋白和APC蛋白表達(dá)。結(jié)論脾胃氣虛證伴低級(jí)別異型增生患者存在更高比例的腸黏膜上皮p53蛋白過(guò)表達(dá)及黏膜上皮增生活躍、缺乏成熟現(xiàn)象等癌變危險(xiǎn)因素，對(duì)于脾胃氣虛證伴低級(jí)別異型增生患者應(yīng)加強(qiáng)隨訪和腸鏡監(jiān)測(cè)。

潰瘍性結(jié)腸炎；異型增生；p53蛋白；KRAS蛋白；APC蛋白；Ki-67

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種結(jié)直腸的慢性非特異性炎癥性疾病，病因尚不明確，復(fù)發(fā)率高[1]。病變范圍廣泛、病程長(zhǎng)的UC患者發(fā)生UC相關(guān)性大腸癌(CAC)的風(fēng)險(xiǎn)增加，CAC也是UC最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，且預(yù)后不良[2]。因此，全面評(píng)估UC患者癌變風(fēng)險(xiǎn)，加強(qiáng)對(duì)高?；颊叩碾S訪和監(jiān)測(cè)是提高CAC早期診斷率，改善患者生活質(zhì)量和預(yù)后的重要策略。CAC的發(fā)生經(jīng)歷了炎癥—異型增生—癌的過(guò)程，對(duì)于首次隨訪的患者，明確腸黏膜有無(wú)異型增生及其類(lèi)型和程度對(duì)進(jìn)一步確定治療和隨訪方案具有指導(dǎo)作用，但是單純從形態(tài)學(xué)的改變對(duì)異型增生與慢性炎癥刺激引起的黏膜再生進(jìn)行鑒別有一定困難，主要依靠觀察者的主觀判斷，缺乏客觀依據(jù)，因此常規(guī)病理觀察的同時(shí)檢測(cè)CAC相關(guān)標(biāo)志物就顯得非常必要[3]。中醫(yī)辨證論治的臨床思維方法在UC治療中取得了很好的療效，積累了很多有益的臨床經(jīng)驗(yàn)。本研究從UC 2種常見(jiàn)中醫(yī)證型脾胃氣虛證和濕熱內(nèi)蘊(yùn)證入手，分析了1998年1月—2012年6月在我院住院且辨證為脾胃氣虛證和濕熱內(nèi)蘊(yùn)證UC患者的腸黏膜活檢組織中癌變相關(guān)蛋白p53、KRAS、APC及增殖指數(shù)Ki-67的表達(dá)特點(diǎn)，旨在為研究中醫(yī)證型與UC癌變關(guān)系，臨床中應(yīng)用生物標(biāo)志物對(duì)UC患者進(jìn)行隨訪監(jiān)測(cè)提供一定的依據(jù)。

1 臨床資料

1.1一般資料 依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)炎癥性腸病協(xié)作組2007年制定的《對(duì)我國(guó)炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的共識(shí)意見(jiàn)》[4]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，選取上述時(shí)期我院收治的UC患者64例，脾胃氣虛證和濕熱內(nèi)蘊(yùn)證診斷參照文獻(xiàn)[5]有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)?；颊呔?jīng)過(guò)電子腸鏡檢查并取腸黏膜活檢。調(diào)取患者既往腸鏡活檢組織HE切片，由2位臨床病理主治醫(yī)師分別在光鏡下觀察，按照Riddell標(biāo)準(zhǔn)分類(lèi)方法[6]確定有無(wú)異型增生并評(píng)價(jià)其程度，將患者進(jìn)一步分為脾胃氣虛證組23例，濕熱內(nèi)蘊(yùn)證組22例，脾胃氣虛證伴低級(jí)別異型增生組9例，濕熱內(nèi)蘊(yùn)證伴低級(jí)別異型增生組10例。選取同期腸鏡活檢組織呈輕度慢性炎者10例作為正常組，大腸癌患者11例作為大腸癌組。

1.2免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法 調(diào)取各組患者結(jié)腸鏡黏膜活檢石蠟包埋組織塊，切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，EDTA(pH9.0)熱修復(fù)，5% BSA封閉液封閉沒(méi)有被抗原占據(jù)的空白點(diǎn)，滴加一抗標(biāo)記，稀釋比例分別是：p53 1∶400，KRAS 1∶20，APC 1∶50，Ki-67 1∶100，4 ℃孵育過(guò)夜，滴加二抗標(biāo)記，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片，光鏡觀察。免疫組化結(jié)果的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：>5%的腸黏膜上皮細(xì)胞核呈中等或強(qiáng)棕黃色為p53蛋白表達(dá)陽(yáng)性[7]；KRAS蛋白陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞膜，細(xì)胞膜呈中等或強(qiáng)棕黃色為KRAS蛋白表達(dá)陽(yáng)性；APC蛋白陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈中等或強(qiáng)棕黃色為APC蛋白表達(dá)陽(yáng)性；Ki-67陽(yáng)性信號(hào)標(biāo)記細(xì)胞核，細(xì)胞核呈中等或強(qiáng)棕黃色為Ki-67表達(dá)陽(yáng)性，根據(jù)Ki-67陽(yáng)性信號(hào)的主要分布位置分別記為隱窩下1/2(隱窩基底部，干細(xì)胞所在區(qū)域)和隱窩上1/2(黏膜表面上皮，提示癌組織增生活躍，上皮細(xì)胞缺乏成熟現(xiàn)象)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)應(yīng)用SAS 6.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法進(jìn)行組間各指標(biāo)陽(yáng)性表達(dá)率比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組患者腸黏膜組織p53蛋白表達(dá)情況 正常組未見(jiàn)p53蛋白表達(dá)，大腸癌組、脾胃氣虛證組、濕熱內(nèi)蘊(yùn)證組、脾胃氣虛證伴低級(jí)別異型增生組、濕熱內(nèi)蘊(yùn)證伴低級(jí)別異型增生組p53蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為63.6%(7/11)，4.3%(1/23)，4.5%(1/22)，44.4%(4/9)，20.0%(2/10)，脾胃氣虛證組和濕熱內(nèi)蘊(yùn)證組陽(yáng)性表達(dá)率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；脾胃氣虛證伴低級(jí)別異型增生組陽(yáng)性表達(dá)率有高于濕熱內(nèi)蘊(yùn)證伴低級(jí)別異型增生組的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。脾胃氣虛證組、脾胃氣虛證伴低級(jí)別異型增生組和大腸癌組免疫組化顯色表現(xiàn)見(jiàn)圖1～3。

2.2各組患者腸黏膜組織KRAS蛋白表達(dá)情況大腸癌組KRAS蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為36.4%(4/11)，其余組均未見(jiàn)KRAS蛋白表達(dá)。脾胃氣虛證組和大腸癌組腸黏膜組織KRAS蛋白表達(dá)染色表現(xiàn)見(jiàn)圖4及圖5。

2.3各組患者腸黏膜組織APC蛋白表達(dá)情況 大腸癌組APC蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為36.4%(4/11)，其余組均未見(jiàn)APC蛋白表達(dá)。脾胃氣虛證組和大腸癌組腸黏膜組織APC蛋白表達(dá)顯色表現(xiàn)見(jiàn)圖6及圖7。

圖1 脾胃氣虛證組腸黏膜組織p53蛋白表達(dá)顯色表現(xiàn)(×200)

圖2 脾胃氣虛證伴低級(jí)別異型增生組腸黏膜組織p53蛋白表達(dá)顯色表現(xiàn)(×200)

圖3 大腸癌組(中分化腺癌)腸黏膜組織p53蛋白表達(dá)顯色表現(xiàn)(×200)

圖4 脾胃氣虛證腸黏膜組織KRAS蛋白表達(dá)顯色表現(xiàn)(×200)

2.4各組患者腸黏膜組織Ki-67陽(yáng)性信號(hào)分布情況 正常組、脾胃氣虛證組、濕熱內(nèi)蘊(yùn)證組Ki-67陽(yáng)性信號(hào)均分布于隱窩下1/2；大腸癌組Ki-67陽(yáng)性信號(hào)位于隱窩上1/2。脾胃氣虛證伴低級(jí)別異型增生組和濕熱內(nèi)蘊(yùn)證伴低級(jí)別異型增生組Ki-67陽(yáng)性信號(hào)位于隱窩上1/2者(表現(xiàn)為接近表面上皮的細(xì)胞核呈連續(xù)彌漫分布的陽(yáng)性)分別有2例(22.2%)和1例(10.0%)，但2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖8及圖9。

圖5 大腸癌組(中分化腺癌)腸黏膜組織KRAS蛋白表達(dá)顯色表現(xiàn)(×200)

圖6 脾胃氣虛證組腸黏膜組織APC蛋白表達(dá)顯色表現(xiàn)(×200)

圖7 大腸癌組(中分化腺癌)腸黏膜組織APC蛋白表達(dá)顯色表現(xiàn)(×200)

3 討 論

目前研究顯示，具有低級(jí)別異型增生或不能確定的異型增生并在此后進(jìn)展為高級(jí)別異型增生和/或CAC的UC患者，其p53蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于同期隨訪中沒(méi)有進(jìn)展的患者；此外沒(méi)有發(fā)生異型增生的UC患者腸黏膜中也存在p53蛋白過(guò)表達(dá)，而且這些患者在隨訪中出現(xiàn)了低級(jí)別異型增生或不能確定的異型增生，甚至有些進(jìn)展為高級(jí)別異型增生[7]。這些現(xiàn)象提示p53蛋白可以作為預(yù)測(cè)CAC相關(guān)異型增生是否發(fā)生和進(jìn)展的生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，脾胃氣虛證伴低級(jí)別異型增生組患者腸黏膜上皮內(nèi)p53蛋白陽(yáng)性表達(dá)率有高于濕熱內(nèi)蘊(yùn)證伴低級(jí)別異型增生組的趨勢(shì)，雖然差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但也提示出現(xiàn)低級(jí)別異型增生的脾胃氣虛證患者今后發(fā)生高級(jí)別異型增生和/或CAC的機(jī)會(huì)可能較濕熱內(nèi)蘊(yùn)證患者更高，脾胃氣虛證患者較濕熱內(nèi)蘊(yùn)證患者可能具有進(jìn)展和/或癌變的更高風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)那些腸黏膜上皮具有低級(jí)別異型增生且同時(shí)伴有p53蛋白過(guò)表達(dá)的患者應(yīng)加強(qiáng)隨訪。另外，本研究發(fā)現(xiàn)脾胃氣虛證組和濕熱內(nèi)蘊(yùn)證組各有1例p53蛋白表達(dá)陽(yáng)性，患者目前雖然還沒(méi)有出現(xiàn)異型增生，但也應(yīng)注意腸鏡動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。

圖8 脾胃氣虛證伴低級(jí)別異型增生組腸黏膜組織Ki-67陽(yáng)性顯色表現(xiàn)(×200)

圖9 大腸癌組(中分化腺癌)腸黏膜組織Ki-67陽(yáng)性顯色表現(xiàn)(×200)

CAC病變過(guò)程中癌基因KRAS的激活發(fā)生在低級(jí)別異型增生向高級(jí)別異型增生發(fā)展的過(guò)程中[8]。另外CAC與散發(fā)性大腸癌發(fā)展過(guò)程中，各種分子事件的發(fā)生頻率和順序并不相同，由雜合性缺失或基因突變引起的APC基因滅活發(fā)生在UC癌變過(guò)程的晚期階段，而且出現(xiàn)頻率較低[9]。本研究結(jié)果顯示，除大腸癌組外，其余組患者腸黏膜活檢組織內(nèi)均未見(jiàn)KRAS蛋白和APC蛋白表達(dá)，這與研究對(duì)象所處疾病階段有關(guān)。今后的研究中筆者將收集UC伴高級(jí)別異型增生的病例并對(duì)現(xiàn)有UC和UC伴低級(jí)別異型增生的患者進(jìn)行隨訪，動(dòng)態(tài)觀察KRAS蛋白和APC蛋白的表達(dá)情況，以此評(píng)估患者的病情和預(yù)后。正常大腸黏膜從基底至開(kāi)口處可以分為增殖區(qū)、移行區(qū)和功能區(qū)，其中增殖區(qū)位于隱窩中下部，此處的干細(xì)胞不斷產(chǎn)生新細(xì)胞，并向黏膜表面移行、分化和成熟。Ki-67是一種核蛋白，是反映細(xì)胞增殖情況的標(biāo)記物。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，隨著UC患者腸黏膜異型增生程度的加重，Ki-67陽(yáng)性分布位置也逐步向隱窩上部和表面移動(dòng)，低級(jí)別異型增生患者腸黏膜上皮Ki-67陽(yáng)性分布于隱窩的中上部分，而高級(jí)別異型增生患者分布于隱窩上部和表面上皮[10]。本研究中脾胃氣虛證伴低級(jí)別異型增生組和濕熱內(nèi)蘊(yùn)證伴低級(jí)別異型增生組共3例Ki-67陽(yáng)性信號(hào)位于隱窩上1/2，且這3例p53蛋白表達(dá)陽(yáng)性，提示聯(lián)合p53和Ki-67免疫組化檢測(cè)對(duì)判斷UC患者腸黏膜活檢組織內(nèi)有無(wú)異型增生及程度具有臨床參考價(jià)值。

筆者之前的研究表明，從病程、病變范圍、炎癥程度及異型增生的角度分析，脾胃氣虛證UC具有癌變危險(xiǎn)因素的患者比例明顯高于濕熱內(nèi)蘊(yùn)證，推測(cè)脾胃氣虛證UC患者的癌變風(fēng)險(xiǎn)較濕熱內(nèi)蘊(yùn)證UC患者更高[11]。本研究結(jié)果顯示，不伴低級(jí)別異型增生的2種證型之間p53、KRAS、APC及Ki-67的陽(yáng)性表達(dá)率基本相同；而脾胃氣虛證伴低級(jí)別異型增生組p53蛋白表達(dá)陽(yáng)性率和Ki-67表達(dá)陽(yáng)性率均有高于濕熱內(nèi)蘊(yùn)證伴低級(jí)別異型增生組的趨勢(shì)，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的原因可能由于本項(xiàng)目是基于中醫(yī)證型的臨床基礎(chǔ)研究，病例資料來(lái)源于中醫(yī)院住院患者，限定條件較多，造成伴有低級(jí)別異型增生的病例數(shù)量較少。今后筆者還要收集更多的相關(guān)病例，特別是伴有低級(jí)別異型增生和高級(jí)別異型增生的UC患者，深入進(jìn)行UC脾胃氣虛證與以上CAC癌變標(biāo)志物的相關(guān)性研究。

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Immunohistochemicalfeaturesofp53,KRAS,APCandKi-67inulcerativecolitispatientswithtwodifferenttypesofChinesetraditionalmedicalsyndromes

WANG Yun, ZHANG Ling, ZENG Yan

(Guang’anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100053, China)

ObjectiveIt is to explore the immunohistochemical features and its significance of p53, KRAS, APC and Ki-67 in the ulcerative colitis (UC) patients with two different types of Chinese traditional medical syndromes.Methods64 inpatients with UC were divided into four groups according to Chinese medical syndrome differentiation and classification with or without dysplasia: 23 cases of syndrome of spleen-stomach Qi deficiency (group A), 22 cases of syndrome of dampness-heat accumulation (group B), 9 cases of syndrome of spleen-stomach Qi deficiency with lower level dysplasia (group C), 10 cases of syndrome of spleen-stomach Qi deficiency with lower level dysplasia (group D). 10 cases with mild chronic inflammation in intestinal tissue were selected as normal group, 11 cases with colorectal cancer as colorectal cancer group. The expression of p53, KRAS, APC and Ki-67 was detected in every group by immunohistochemistry methods.ResultsThe proportion of p53 over expression in intestinal mucosa and Ki-67 in the upper half of crypt in the patients in UC groups were significantly lower than that in colorectal cancer group (P<0.05). The proportion of p53 over expression in intestinal mucosa and Ki-67 in the upper half of crypt in group A was the same as those in group B. The proportion of p53 over expression in intestinal mucosa and Ki-67 in the upper half of crypt in the patients in group C was higher than those in group D, but the difference was not significant. A negative KRAS and APC staining pattern were detected in all patients in UC groups.ConclusionThe UC patients with syndrome of spleen-stomach Qi deficiency with lower level dysplasia have a higher proportion of intestinal epithelial p53 over expression and high risk factors of cancer such as epithelial hyperplasia and lack of maturation, these patients should be given regular follow-up and colonoscopy screening.

ulcerative colitis； dysplasia； p53； Kras； APC； Ki-67

10.3969/j.issn.1008-8849.2018.01.001

R574.6

A

1008-8849(2018)01-0001-05

汪蕓，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事消化道腫瘤的中西醫(yī)結(jié)合臨床基礎(chǔ)研究。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81202804)

2016-08-10