伊犁地區(qū)蝴蝶蘭軟腐病病原體的分離與鑒定

張相鋒等

摘要：以蝴蝶蘭栽培品種軟腐病感病植株葉片為材料，分離到6個(gè)單菌株。菌體在顯微鏡下呈短桿狀，表現(xiàn)為兼性厭氧，革蘭氏陰性，經(jīng)回接致病性檢測，均產(chǎn)生與田間相同癥狀，證明為蝴蝶蘭軟腐病病原體。同時(shí)還對所分離菌株進(jìn)行了形態(tài)觀察、染色反應(yīng)、形態(tài)培養(yǎng)、生理生化特性鑒定等研究，根據(jù)伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊（第八版）初步鑒定為歐文氏菌菊歐文氏軟腐致病型菌（Erwinia chrysanthemi Burkolder，Mc Fadden&Dimock）。

關(guān)鍵詞：蝴蝶蘭；軟腐病；分離鑒定；歐文氏菌菊歐文氏軟腐致病型茵

蝴蝶蘭（Phalaenopsis），是蘭科（Orehidaeeae）蝴蝶蘭屬（Phalaenopsis）是著名的鮮切花種類。其花形如蝴蝶，萼片長橢圓形，唇瓣先端三裂，花色繁多，花期特別長，深受人們喜愛，被譽(yù)為“洋蘭皇后”，是目前蘭科植物中栽培最廣泛，最普及的種類之一。

軟腐病是目前蝴蝶蘭栽培中最普遍且最致命的病害之一，在高溫潮濕的條件下，發(fā)病旺盛。該病主要危害葉片，病斑可發(fā)生于葉片任何部位，一般情況下葉柄基部較多，在發(fā)病初期，病斑一般近圓形，多從葉邊緣開始出現(xiàn)水漬狀斑，有明顯的輪紋界限，隨著病勢的迅速擴(kuò)散，不再出現(xiàn)輪紋，2～3d后，受害葉片雖完整，但表皮開始分離，內(nèi)部已經(jīng)腐爛分解成淺白色半透明狀液體，然后整個(gè)植株倒伏死亡，蔓延開來，會給蝴蝶蘭生產(chǎn)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。由于蝴蝶蘭適宜于在高溫高濕環(huán)境下栽培，該條件更有利于軟腐病病原體的生長和繁殖。蝴蝶蘭軟腐病病原菌菌株的分離與鑒定，有著重要的意義，逐漸得到廣大國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，通過對蝴蝶蘭軟腐病病原菌菌株的致病性，病菌形態(tài)和培養(yǎng)性狀觀察，生理生化特性鑒定等研究的初步結(jié)果，旨為今后蝴蝶蘭軟腐病的防治、抗病種質(zhì)篩選、抗病轉(zhuǎn)基因以及抗病育種等的研究提供理論依據(jù)和實(shí)際指導(dǎo)，為蝴蝶蘭這一世界名花的推廣和開發(fā)提供條件。

1材料與方法

1.1材料

蝴蝶蘭軟腐病葉片；蝴蝶蘭健康葉片；供試材料采自伊寧市平原林場。

1.2方法

1.2.1蝴蝶蘭軟腐病病原菌分離與純化。在蝴蝶蘭軟腐病發(fā)病時(shí)，采集新鮮病葉，選取2片，用清水洗凈。用75%的酒精做表面消毒后，用無菌水沖洗3次。在超凈工作臺條件下取病健交界部位葉片，用無菌刀片將葉片①切成1.5cm×1.5cm大小，在75%酒精中消毒后，用無菌水沖洗3次，然后接種在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上；將葉片②的病健交界部位用無菌刀片切下，在75%酒精中消毒后，搗碎，用接種環(huán)劃線接種在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上。將培養(yǎng)基放在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。挑取典型菌落，用劃線法分離，連續(xù)多次純化，直至出現(xiàn)純菌落，鏡檢下為純的單一菌體，接種在斜面牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，保存在4℃冰箱中備用。

1.2.2致病性觀察。致病性測定、培養(yǎng)性狀及菌體形態(tài)觀察主要參照方中達(dá)和任欣正方法。本試驗(yàn)采用針刺法進(jìn)行菌體的致病性檢測。即選取健康的蝴蝶蘭葉片用75%酒精表面滅菌后，用沾有菌苔的無菌針在蝴蝶蘭葉片上進(jìn)行針刺接種，對照組用無菌針沾無菌水扎孔。于28%恒溫箱中培養(yǎng)，保持相對濕度60%～80%，接種后每天觀察記錄有無發(fā)病癥狀表現(xiàn)。

1.2.3病原菌菌體的培養(yǎng)特征及菌體形態(tài)觀察。接種純化的菌種于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)48h后，按參照文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)觀察、記錄菌苔的豐厚度、大小、邊緣、表面形狀、顏色、粘度、透明度。采用革蘭氏染色法，在油鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.2.4生理生化性狀鑒定。生理生化的測定主要參考文獻(xiàn)任欣正、周德慶的常規(guī)方法進(jìn)行。材料為牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上生長的備用病原細(xì)菌。生理生化的測定包括5%NaCl生長、37%下生長、淀粉水解、油脂水解、卵磷脂酶、明膠液化、糖發(fā)酵、苯丙氨酸脫氨酶、V.P.試驗(yàn)、檸檬酸鹽還原、過氧化氫酶分解、產(chǎn)H₂S、產(chǎn)氨、吲哚試驗(yàn)、硝酸鹽還原、甲基紅，共16個(gè)項(xiàng)目。

2結(jié)果與分析

2.1病原菌的分離和純化

在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，28%培養(yǎng)24h。

病葉①：病原菌在病組織周圍生長，形成多個(gè)圓形菌落，連成一片，如圖1、圖2。病葉②：病葉接種的菌落連成一片，如圖3、圖4。

分別對病葉①和病葉②的菌種進(jìn)行多次分離純化，直至出現(xiàn)單菌落。分別選出3株菌株進(jìn)行標(biāo)號，病葉①：R₁、R₂、R₃；病葉②：M₁、M₂、M₃。

2.2病原菌致病性測定結(jié)果

分離純化的軟腐細(xì)菌菌株接種于健康的蝴蝶蘭葉片后，24h時(shí)在針刺孔周圍出現(xiàn)腐爛狀小點(diǎn)，顏色較正常組織稍深；然后腐爛的面積逐漸增大，向四周延伸；30h時(shí)每個(gè)針刺孔周圍的腐爛面積都達(dá)到直徑1～2cm；42h后蝴蝶蘭葉片幾乎全部腐爛，如圖5。對照蝴蝶蘭葉片正常。

2.3病原菌的鑒定

2.3.1菌體形態(tài)與染色反應(yīng)。將分離純化的菌株R₂、R₂、R₃、M₁、M₂、M₃，接種在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h，挑取純化的單菌落（如圖6），鏡檢，菌體均為短小桿狀，散生排列（如圖7）。革蘭氏染色為陰性。

2.3.2病原菌的培養(yǎng)性狀。將分離純化的6株菌株接種到牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，記錄其菌落形態(tài)（如表1）。由表1可以得出，待測菌株的培養(yǎng)性狀與伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊上Erwinia chrysanthemi的培養(yǎng)性狀基本一致，如圖8、9，Erwinia chrysantbemi菌落培養(yǎng)性狀為特征性凸起，菌落較小，菌落邊緣呈波浪狀或翻卷的“煎雞蛋狀”，而待測菌株則僅在菌落大小、邊緣、顏色方面與Erwinia chrysanthemi有一些差異。endprint