花生莖腐病病原菌的鑒定及生物學特性研究

張建航，張幸果，劉 婷，和小燕，王 允，馬興立，殷冬梅

(河南農業(yè)大學農學院，河南 鄭州 450002)

花生莖腐病病原菌的鑒定及生物學特性研究

張建航，張幸果，劉 婷，和小燕，王 允，馬興立，殷冬梅

(河南農業(yè)大學農學院，河南 鄭州 450002)

為減少花生莖腐病在花生生產上造成的損失，以河南省不同花生產區(qū)采集的花生莖腐病病株為材料分離病原菌，并進行病原菌的生物學特性研究及不同藥劑對該菌的室內抑菌試驗。結果表明：河南省花生莖腐病的病原菌為可可毛色二孢(Lasiodiplodiatheobromae),該菌在 pH=8的PDA培養(yǎng)基上生長最快，菌絲的致死溫度為56 ℃(10 min)。經不同的藥劑處理，25%戊唑醇可濕性粉劑處理抑制效果最好；60%唑醚代森聯(lián)水分散粒劑次之；70%甲基托布津可濕性粉劑、80%多菌靈進口原藥及50%醚菌酯水分散粒劑與對照無顯著差異。

花生莖腐??；可可毛色二孢；抑菌作用

花生(ArachishypogaeaL.)為豆科落花生屬一年生草本植物，內含大量的蛋白質及脂肪等多種營養(yǎng)成分，具有很高的營養(yǎng)價值，有助于延緩人體衰老，故又稱為“長生果”。近年來，花生在農業(yè)和社會生產中占有越來越重要的地位，其需求量呈現(xiàn)逐年快速增長的趨勢。花生作為重要的油料作物和經濟作物，其種植面積僅次于油菜[1]。近年來，河南的花生產量一直保持著穩(wěn)定的增長。隨著花生種植面積逐漸擴大，更多農業(yè)生產者為減少麻煩而選擇連作，病害也逐漸增多?；ㄉo腐病是危害較為嚴重的一種病害，駐馬店、新鄉(xiāng)、信陽等地均有發(fā)生?；ㄉo腐病是中國各花生產區(qū)的主要病害之一，一般發(fā)生在花生生育期的中后期，在花生莖基部出現(xiàn)水漬狀病斑，發(fā)病后約15 d全株枯死。該病原菌寄主范圍廣泛，可以侵染多種植物并導致作物發(fā)生病害[2]。對可可毛色二孢報道較多的是該菌在熱帶、亞熱帶地區(qū)水果上引起的病害。多數研究是針對由可可毛色二孢引起的肉桂枯枝病[3-6]、芒果蒂腐病[7-8]、龍眼焦腐病[9-10]等。

近年來，在中國北方地區(qū)有關于可可毛色二孢的報道，如北京的板栗黑斑病[11]，山東的花生莖腐病[12]，黑龍江的黑木耳“黑皮病”[13]等，說明此病菌可適應溫帶氣候，對中國北方作物也存在著威脅。而國外也多次報道了由Lasiodiplodiatheobromae引起的花生莖腐病，MILLER等[14]首次報道了花生莖腐病，1998年，PHIPPS等[15]對花生莖腐病進行了詳細研究，認為該病是由可可毛色二孢(Lasiodiplodiatheobromae)引起的。該病原菌影響范圍廣泛，作者從河南省不同花生產區(qū)采集花生莖腐病病株，分離病原菌并進一步研究，經過形態(tài)學及ITS鑒定，認為該病害病原菌為可可毛色二孢(Lasiodiplodiatheobromae)。目前，常用的殺菌劑多為甲基托布津、戊唑醇、唑醚代森聯(lián)、多菌靈等藥劑，為更有效地防治花生莖腐病，本研究選取5種不同的藥劑進行室內抑菌試驗，比較這5種藥劑對病原菌的抑制效果。

1 材料與方法

1.1 材料

2015—2016年花生生育期間，從河南省不同花生產區(qū)采集的花生莖腐病病株上分離病原菌。

1.1.1 燕麥培養(yǎng)基 燕麥片30 g加水煮1 h，用雙層紗布過濾后加入17 g瓊脂，補足至1 000 mL，121 ℃下高壓滅菌20 min。

1.1.2 大豆培養(yǎng)基 大豆汁10 mL，瓊脂2 g，去離子水90 mL。大豆汁的制備方法是先將60 g干的大豆種子用水清洗，浸泡過夜，浸泡過的大豆與330 mL去離子水混合，用組織搗碎機破碎2 min，經單層紗布過濾去渣，濾液為大豆汁。

1.1.3 麥粒培養(yǎng)基 先將30 g麥粒浸泡過夜，第2天加水煮沸，沸騰后20 min麥粒變得透亮，壓碎再煮10 min，雙層紗布過濾，加瓊脂3 g，加水補足至200 mL。

1.1.4 花生稈培養(yǎng)基 取30 g干的花生桿剪成小段，加水煮沸1 h，濾液補足至200 mL，再加入4 g葡萄糖和4 g瓊脂，高壓滅菌20 min 。

1.1.5 PDA培養(yǎng)基 取200 g馬鈴薯加水煮沸20 min，雙層紗布過濾除渣，加入葡萄糖和瓊脂各20 g，加水補足至1 000 mL，高壓滅菌后備用。

1.1.6 MEA培養(yǎng)基 麥芽浸膏30 g，大豆蛋白胨3 g，瓊脂15 g，加蒸餾水配制1 000 mL，高壓滅菌后備用。

1.1.7 化學藥劑 選用5種藥劑，均按照藥劑田間噴施要求稀釋：50%醚菌酯水分散粒劑(巴斯夫(中國)有限公司)稀釋為0.35 g·L-1的藥劑；60%唑醚代森聯(lián)水分散粒劑(巴斯夫(中國)有限公司)稀釋成1.70 g·L-1；25%戊唑醇可濕性粉劑(江蘇劍牌農化股份有限公司)稀釋成0.50 g·L-1；70%甲基托布津可濕性粉劑(江西龍燈化學有限公司)稀釋成2.00 g·L-1；80%多菌靈進口原藥(美國廣豐生物科技有限公司)稀釋成1.70 g·L-1。

1.2 病原菌的分離純化

將帶病斑的花生莖腐病根莖切成大小約0.2 cm×0.2 cm組織塊進行消毒：75%的乙醇約40 s，無菌水清洗1次，0.1%的升汞4 min，無菌水洗5次，最后將組織塊放于無菌濾紙上吸干表面水分，接種于含硫酸鏈霉素質量濃度為1 mg·mL-1的PDA培養(yǎng)基上(硫酸鏈霉素可抑制細菌生長)[16]。25 ℃ 培養(yǎng) 48～72 h，挑取在組織小塊周圍生長的菌絲，接種于新的PDA平板上純化3～5次； 根據菌落形態(tài)和顏色，挑取單菌落在新的PDA平板上轉接純化3～5次。將純化好的真菌分離物接種于PDA斜面試管內，28 ℃培養(yǎng)3 d后，放于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌的鑒定

1.3.1 病原菌的形態(tài)觀察 將直徑7 mm的菌絲塊接種于PDA平板中央25 ℃倒置培養(yǎng)，每天觀察并記錄菌落大小和特征。

1.3.2 ITS鑒定 在菌落邊緣打取直徑7 mm的菌塊接種于新的PDA培養(yǎng)基上，待菌絲長滿培養(yǎng)基后刮取菌絲，利用Fungal DNA Min Kit(購自寶生物工程(大連)有限公司)提取真菌基因組DNA。

使用真菌通用引物ITS4：5′-TAATCCGCTTATTGATATGC-3′和ITS5：5′-GGAAGTAAGTGCTAACAAGG-3′對所提取的真菌DNA進行PCR擴增，擴增條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃保溫10 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察后將PCR產物送至北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.4 病原菌的致病性測定

供試花生品種為8789、花416、9102，將麥粒煮至透亮后高壓滅菌，接種菌絲28 ℃培養(yǎng)2 d，在花生團棵期后將接過菌絲的麥粒均勻撒到花生周圍，觀察花生植株的發(fā)病情況。植株發(fā)病后，從感病植株上分離菌株與接種菌株進行對比。

1.5 病原菌的生物學特性研究

1.5.1 不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響 將菌絲接種于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基PDA、燕麥培養(yǎng)基、花生桿培養(yǎng)基、大豆培養(yǎng)基、MEA、LB、麥粒培養(yǎng)基7種不同的培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基重復3次，用十字交叉法記錄菌落擴展直徑。

1.5.2 不同pH值對菌絲生長的影響 配制好的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基分裝，分別調酸堿度至pH值為3～12，高壓滅菌后分別倒入無菌培養(yǎng)皿中制成平板，待培養(yǎng)基凝固后接種直徑7 mm的菌塊，共9個處理(pH=3時培養(yǎng)基不凝固)，每處理重復3次。

1.5.3 菌絲的致死溫度 設50～66 ℃共17個處理，在菌落邊緣打取直徑7 mm的菌絲塊放入加過滅菌水的無菌試管中，恒溫水浴10 min后接種于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃暗培養(yǎng)，記錄菌落的擴展直徑。

1.6 不同藥劑對病原菌的抑制作用

藥品的配制：(取50% 醚菌酯水分散粒劑0.1 g用300 mL無菌水溶解；60%唑醚代森聯(lián)水分散粒劑0.1 g用60 mL無菌水溶解；25%戊唑醇可濕性粉劑0.1 g用200 mL無菌水溶解；70%甲基托布津可濕性粉劑0.1 g用60 mL無菌水溶解；80%多菌靈進口原藥0.12 g用60 mL無菌水溶解，均配制于滅菌錐形瓶中。)在超凈工作臺上取藥劑200 μL均勻涂布于PDA培養(yǎng)基上，涂好后將菌絲塊接種于培養(yǎng)基中央，無菌水作對照，每處理重復5次，25 ℃培養(yǎng)48 h后采用十字交叉法量取菌落擴展直徑。

2 結果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)鑒定

菌落在PDA培養(yǎng)基上呈圓形或近圓形，質地疏松，菌絲絮狀，初淺白色，3 d長滿直徑9 cm的培養(yǎng)皿，氣生菌絲發(fā)達，后期菌落變?yōu)榛液谏?。發(fā)病植株病部小黑點即病原菌的分生孢子器，常突出于體表，黑色，近球形，直徑220～230 μm，頂端孔口呈乳頭狀突起。挑取發(fā)病植株病斑部位黑色凸起制成臨時玻片，在顯微鏡鏡下觀察，分生孢子橢圓形、長圓形或卵圓形，基部平截，端部鈍圓，單胞，初無色，雙層壁，大小(22.75～30.25)μm×(12.5～15.1)μm。

注：A:病原真菌在PDA平板上的正面菌落形態(tài)；B:菌株反面形態(tài)；C:菌絲體(標尺為100 μm)，D：孢子體(標尺為100 μm)。

Note：A: The face colony characteristic of fungal pathogens on PDA; B:The reverse side of colony of strain; C: Mycelium(The scale is 100 μm)； D: Sporophore(The scale is 100 μm) .

圖1病原菌的形態(tài)特征
Fig.1Morphologicalcharacteristicsofpathogenicfungus

2.2 病原菌的分子鑒定

分離得到的菌株DNA進行PCR擴增，用凝膠成像系統(tǒng)觀察可知，產物序列大小在600 bp左右(圖2)。隨機選取其中5條序列，分別為XY.7、ZMD.6、XX.2、ZZ.3、AY.4，測序后的結果用DNAMAN進行比對，結果顯示5條序列相似性極高為99.89%。將5條序列與NCBI中已有的可可毛色二孢屬(Lasiodiplodia)DNA序列進行比對，相似度高達99.73%。

注：Marker:DL2000；1～7：不同菌落的PCR結果。 Note: Marker:DL2000； 1～7: Amplification with individual bacterial as template.

2.3 病原菌的致病性

花生植株接種病菌4 d后出現(xiàn)病癥，葉片萎蔫，15 d后病株枯死(圖3)。從病株上分離獲得的菌株與接種菌株相同，可知該菌株為花生莖腐病病原菌。

圖3 病原菌菌株的致病性測定 Fig.3 Pathogenicity of pathogenic strains

2.4 病原菌的生物學特性

2.4.1 不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響 病原菌生長初期菌落形態(tài)為白色絮狀，在MEA和花生桿培養(yǎng)基上菌落擴展速度較快，菌絲致密，麥粒和大豆培養(yǎng)基次之，PDA和燕麥上菌落生長較慢，且燕麥培養(yǎng)基上菌絲稀薄(圖4)。從培養(yǎng)第1天來看，麥粒培養(yǎng)基、花生桿培養(yǎng)基與MEA菌落擴展速度無差異，與大豆培養(yǎng)基、PDA存在差異性，與燕麥培養(yǎng)基有顯著差異。但第2天生長速度發(fā)生了變化，麥粒、大豆培養(yǎng)基和MEA、PDA的菌落擴展速度無差異，與燕麥、花生桿培養(yǎng)基存在差異。

圖4 不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響 Fig.4 Effects of different media on mycelium growth

2.4.2 不同pH值對菌絲生長的影響 PDA培養(yǎng)基在pH值為3時不凝固，菌落正常生長，pH值為8時，菌落在PDA培養(yǎng)基上擴展速度最快，4 d長滿整個培養(yǎng)基， pH值為6時次之，pH值為11時菌落生長最慢，pH值為12時菌落不生長(圖5)。菌絲的擴展速度每天都存在差異，從第4天菌絲的擴展速度來看，pH8與pH9、pH11存在顯著差異；pH4、pH5、pH7、pH10之間無差異，與pH6、pH11無顯著差異。

圖5 不同pH值對菌絲生長的影響 Fig.5 Effects of different PH on mycelial growth

2.4.3 菌絲的致死溫度 菌絲塊經不同溫度水浴加熱10 min后接種到PDA培養(yǎng)基上， 50 ℃處理的菌絲生長最快，55 ℃處理的菌絲生長最慢(圖6)，當處理溫度≥56 ℃時菌絲停止生長，說明該菌的致死溫度為56 ℃(10 min)。菌絲生長第1天，50 ℃處理與51、52、53、55 ℃菌絲生長速度均存在差異，與54 ℃處理存在顯著差異，之后的2 d菌絲的生長速度無顯著差異。

2.5 不同藥劑對病原菌的抑制作用

由圖7可知，50%醚菌酯水分散粒劑等5種不同的藥劑處理后，25%戊唑醇可濕性粉劑處理后病原菌菌落生長最慢，與對照存在顯著差異，抑制效果最好；60%唑醚代森聯(lián)水分散粒劑次之；70%甲基托布津可濕性粉劑、80%多菌靈進口原藥及50%醚菌酯水分散粒劑與對照無顯著差異。

圖6 菌絲經不同溫度水浴加熱后的生長速度 Fig.6 The growth rate of hyphae after heating in different temperature water baths

圖7 不同藥劑對病原菌的抑制作用 Fig.7 Inhbitory effect of different medicaments

3 結論與討論

可可毛色二孢廣泛分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，可以導致寄主的發(fā)病癥狀包括：梢枯、根腐、果腐、枯萎、葉斑、叢枝等，寄主范圍目前已知達500種之多[17]?；ㄉo腐病病原菌可分為2種：在報道花生莖腐病病原菌時，多數國內學者認為花生莖腐病是由棉色二孢(Diplodiagossypina)引起的[18-20]，李君彥等[16]通過研究陜西省花生莖腐病，分離出可可毛色二孢(Lasiodiplodiatheobromae)等多種色二孢，但認為病原菌為棉色二孢(Diplodiagossypina)。侯緒友等[21]通過對花生莖腐病的研究，認為該病害病原菌為DiplodiaFr，其種名尚待今后研究。

國外也有報道由可可毛色二孢引起的花生莖腐病、藤回枯病等[22]。NGUYEN等[23]報道了花生莖腐病，病原菌為可可毛色二孢(Lasiodiplodiatheobromae)，并且認為棉色二孢(Diplodiagossypina)、蒂腐色二孢(D.natalensis)、可可球二孢(B.theobromae)是可可毛色二孢(L.theobromae)的同物異名。 本研究通過對花生病原菌的形態(tài)學觀察及分子鑒定認為，可可毛色二孢與棉色二孢是同物異名[15]。

目前，對花生病害的防治多為化學防治，農藥的使用較為頻繁。本研究選取的5種農藥均為常用殺菌劑，僅測定了不同藥劑對病原菌菌絲生長的影響，5種藥劑對病原菌菌絲的生長有不同程度的抑制作用。為更徹底地防治花生莖腐病，后續(xù)研究將進行田間藥劑防治試驗，將花生生產中因莖腐病的危害導致的損失降到最低。

[1] 陳明娜,遲曉元,潘麗娟,等.中國花生育種的發(fā)展歷程與展望[J].中國農學通報,2014,30(9):1-6.

[2] LO J Y，CLARK C A.Sources of inoculum and infection courts ofDiplodiagossypinaon sweet potato [J].Phytopathology，1988,78(11):1442-1446.

[3] 文新，張毓如，吳澤文，等.肉桂枯枝病病原研究[J].微生物學報，1995，35(3)：181-185.

[4] 王軍，蘇海，李若英，等.致傷類型與樹皮含水量對肉桂枯枝病發(fā)病程度的影響[J].中國森林病蟲，2001，20(1)：5-7.

[5] 王軍，李若英.肉桂枯枝病菌毒素的研究[J].林業(yè)科學研究，2002，15(4)：387-393.

[6] 薛振楠，黃式玲，李孝忠.肉桂枯枝病菌及其生物學特性研究[J].廣西農業(yè)生物科學，2003，22(4)：275-279.

[7] 羅遠嬋,黃思良,黎起秦.芒果蒂腐病菌Diplodinasp.生物學特性的研究[J].石河子大學學報(自然科學版),2004,22(Z1):164-168.

[8] 師超，胡美姣，李敏，等.多種殺菌劑對抗多菌靈的芒果蒂腐病病菌菌株的毒力測定[J].農藥研究與應用，2010，14(3)：30-34.

[9] 張居念，林河通，謝聯(lián)輝，等.龍眼焦腐病菌及其生物學特性[J].福建農林大學學報(自然科學版)，2005，34(4)：425-429.

[10] 董小梅.龍眼焦腐病菌細胞壁降解酶及其致病機理的研究[D].福州：福建農林大學，2010.

[11] 李文生，馮曉元，閆國華，等.板栗貯藏中的主要病害及其防治[J].中國農學通報，2006，22(11)：327-329.

[12] 郭洪參，張悅麗，齊軍山，等.山東花生莖腐病病原菌研究[J].中國油料作物學報，2014，36(4)：524-528.

[13] 劉佳寧，馬銀鵬，王玉文，等.黑木耳“黑皮病”病原菌鑒定[J].黑龍江科學，2015,6(1):4-6.

[14] MILLER J H，HARVEY H W.Peanut wilt in Georgia[J].Phytopathology ,1932，22:371-383.

[15] PHIPPS P M,PORTER D M.Collar rot of peanut caused byLasiodiplodiateobromae[J].Plant Dis，1998，82:1205-1209.

[16] 李君彥，王千紅，楊兆森．花生莖腐病的病原鑒定[J].花生科技，1990(3)：5-8．

[17] ALVES A ,CROUS P W,CORREIA A,et al.Morphological and molecular data reveal cryptic speciation inLasiodiplodiatheobromae[J].Fungal Diversity,2008,28(2):1-13.

[18] 董金皋，李洪連，王建明，等．農業(yè)植物病理學[M]．北京：中國農業(yè)出版社，2000．

[19] 張明厚．油料作物病害[M]．北京：中國農業(yè)出版社， 1995．

[20] 張廣民．山東省花生病害的發(fā)生及防治技術[J]．農藥，1997,36(4):6-8．

[21] 侯緒友,王家紹.花生莖腐病的研究[J].植物保護,1979,5(2):7-11.

[22] WOOD P M,WOOD C E.Cane dieback of dawn seedless table grapevines (Vitis vinifera) in Western Australia caused byBotryosphaeriarhodina[J].Australasian Plant Pathology,2005,34(3):393-395.

[23] NGUYEN C M T,DANG T T V,NGUYEN H X,et al.Collar rot of groundnut caused byLasiodiplodiatheobromaein North Vietnam [J].International Arachis Newsletter,2006,26: 20-25.

Identificationofpathogenofpeanutstemrotanditsbiologicalcharacteristicsresearch

ZHANG Jianhang,ZHANG Xingguo,LIU Ting,HE Xiaoyan,WANG Yun,MA Xingli,YIN Dongmei

(College of Agronomy,Henan Agricultural University,Zhengzhou 45002,China)

In order to reduce the loss of peanut stem rot in peanut production,the pathogen was isolated from the peanut stem rot disease plants collected from different peanut growing areas in Henan Province.The biological characteristics of pathogens and different agents on the bacteria indoor were studied.The results showed that the pathogen of peanut stem rot in Henan Province wasLasiodiplodiatheobromae,which was the fastest growing in the medium of pH=8,and the lethal temperature was 56 ℃(10 min).After treatment with different agents,25% tebuconazole WP had the best inhibitory effect; 60% pyraclostrobin metiram water dispersible granules followed; 70% wettable powder,80% carbendazim imported products and 50% kresoxim methyl WDG had no significant difference from the CK.

stem rot of peanut;Lasiodiplodiatheobromae; fungistatic action

2017-03-03

河南省重大科技專項(161100111000)；河南省現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系(S2012-05-03)。

張建航(1991-)，女，河南安陽人，碩士研究生，主要從事花生的遺傳育種研究。

殷冬梅(1972-)，女，河南方城人，教授，博士。

1000-2340(2017)06-0822-06

S435.6

A

蔣國良)