丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對(duì)病毒性心肌炎模型小鼠冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用*

許麗琴 曹 覓 余 莉 潘 軍 齊旭升

（湖北省十堰市太和醫(yī)院，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000）

病毒性心肌炎（VMC）是兒科心血管系統(tǒng)的感染性疾病，多由水痘病毒、腺病毒、風(fēng)疹病毒、流感病毒、柯薩基B族病毒等腸道病毒感染有關(guān)，其中尤以柯薩奇病毒B為多見［1］。由于學(xué)齡前及學(xué)齡期兒童免疫力較成年人低，易受上述疾病感染導(dǎo)致心肌炎癥性病變，多數(shù)患兒預(yù)后良好，但亦有少數(shù)患兒感染后遷延不愈，嚴(yán)重者可發(fā)展為擴(kuò)張型心肌病或致殘性心律失常，少數(shù)患兒或因并發(fā)急性心力衰竭和心源性休克而導(dǎo)致死亡［2］。研究表明，病毒性心肌炎患兒心肌細(xì)胞往往因病毒侵蝕、缺血及氧自由基等多重因素影響而導(dǎo)致嚴(yán)重的心肌損傷，因此在治療病毒性心肌炎時(shí)，多以抗病毒、清除氧自由基、營養(yǎng)心肌、免疫調(diào)節(jié)等綜合治療為主。因病毒性心肌炎患兒存在較嚴(yán)重的心肌損害，且目前尚缺乏特異、有效的治療手段，故中西醫(yī)結(jié)合治療逐漸受到重視，丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液具有特異性阻滯Ca2+內(nèi)流、抑制“鈣超載”的藥理特性，可抑制心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)、擴(kuò)張心衰和心源性休克患者冠狀動(dòng)脈、增加組織灌流量、增強(qiáng)心臟泵血功能等作用，臨床用于急性心肌梗死、病毒性心肌炎等心血管疾病的輔助治療［3-4］。因其對(duì)病毒性心肌炎的治療缺乏相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究，故本課題組采用柯薩奇病毒B3（CVB3 Nancy株）腹腔接種于Balb/c小鼠的方法建立小鼠病毒性心肌炎模型，并在此基礎(chǔ)上靜脈注射丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液，觀察其對(duì)病毒性心肌炎模型小鼠冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮損傷的影響，探討其干預(yù)作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性純種同源近交系Balb/c小鼠 60 只，4 周齡，體質(zhì)量（18.5±1.5） g，購自湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥物及試劑 實(shí)驗(yàn)用病毒CVB3 Nancy病毒株由太和醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)研究所提供，使用前將CVB3病毒液終濃度調(diào)至100TCID 50/0.1 mL；丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液（上海第一生化藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)1606105，規(guī)格 2 mL∶10 mg）； 小鼠血管內(nèi)皮因子（VEGF）ELISA試劑盒、VEGFmRN反轉(zhuǎn)錄試劑及血管內(nèi)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）ELISA試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3 造模及分組 挑選體質(zhì)量接近的Balb/c小鼠40只，每只按0.1 mL腹腔注射接種CVB3 Nancy病毒液，連續(xù)注射3 d后可建立穩(wěn)定小鼠病毒性心肌炎模型。于接種10 d后隨機(jī)分為病毒性心肌炎模型組（VMC組）和丹參組（DST組），另外20只腹腔注射等體積0.9%氯化鈉注射液作空白對(duì)照組（BCG組）。

1.4 干預(yù)方法 丹參組和心肌炎模型組小鼠在注射CVB3 Nancy病毒液的第11日起，丹參組腹腔注射丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液0.2mL/只，心肌炎模型組和空白對(duì)照組每日腹腔內(nèi)注射等體積0.9%氯化鈉注射液0.2 mL/只，每日1次，連續(xù)注射治療10 d。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 于治療前后，每組取10只，抽取靜脈血，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢驗(yàn)小鼠血清肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶 MB（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）、氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）。 取血后處死實(shí)驗(yàn)小鼠，摘取心臟，迅速分離出冠狀動(dòng)脈血管，采用免疫組化染色檢測(cè)冠狀動(dòng)脈內(nèi)誘導(dǎo)型iNOS的表達(dá)，雙抗體夾心法測(cè)定冠狀動(dòng)脈VEGF表達(dá)，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)冠狀動(dòng)脈血管VEGF mRNA。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料以（±s）表示，各組指標(biāo)先采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組治療前后小鼠血清心肌酶譜水平比較 見表1。丹參組和心肌炎模型組小鼠在治療前心肌酶譜中CK、CK-MB和LDH均明顯升高，與空白對(duì)照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且丹參組和心肌炎模型組小鼠在治療前CK、CK-MB和LDH比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示腹腔注射接種CVB3 Nancy病毒液建立病毒性心肌炎模型成功。治療后，心肌炎模型組小鼠CK、CK-MB和LDH仍然保持在高水平，與空白對(duì)照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而丹參組則明顯降低并接近空白對(duì)照組水平，與治療前和心肌炎模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組治療前后小鼠血清心肌酶譜比較（IU/L，±s）

表1 各組治療前后小鼠血清心肌酶譜比較（IU/L，±s）

與本組治療前比較，*P＜0.05；與空白對(duì)照組同時(shí)期比較，△P＜0.05；與心肌炎模型組比較，▲P＜0.05。下同。

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2.2 各組治療前后小鼠血清脂質(zhì)過氧化反應(yīng)情況比較 見表2。丹參組和心肌炎模型組小鼠在治療前SOD明顯低于空白對(duì)照組，MDA明顯高于空白對(duì)照組，與空白對(duì)照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），丹參組和心肌炎模型組小鼠在治療前SOD和MDA比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示成模后脂質(zhì)過氧化反應(yīng)活躍，小鼠心肌受損嚴(yán)重。治療后，心肌炎模型組小鼠SOD和MDA無明顯變化，與空白對(duì)照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。而丹參組SOD明顯升高，MDA明顯降低并接近空白對(duì)照組水平，與治療前和心肌炎模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示治療有效。

表2 各組治療前后小鼠血清SOD及MDA、iNOS陽性細(xì)胞數(shù)比較（±s）

表2 各組治療前后小鼠血清SOD及MDA、iNOS陽性細(xì)胞數(shù)比較（±s）

組 別 時(shí) 間 SOD（IU/L） MDA（IU/L）iNOS陽性細(xì)胞數(shù)（個(gè)/100）空白對(duì)照組 治療前 304.98±42.75 1.43±0.184.59±0.53（n＝10） 治療后 308.25±37.82 1.39±0.114.42±0.45心肌炎模型組 治療前 142.73±17.24△ 11.07±1.24△35.24±2.86△（n＝10） 治療后 148.55±16.37△ 10.72±2.03△37.46±2.53△丹參組 治療前 149.52±15.80*△▲ 1.64±0.20*△▲ 34.85±3.07*△▲（n＝10） 治療后 301.49±37.52*△▲ 1.30±0.15*△▲ 5.01±0.39*△▲

2.3 各組小鼠冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮iNOS表達(dá)情況比較見表2。心肌炎模型組治療前后冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮iNOS陽性細(xì)胞數(shù)均明顯增多，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而丹參組治療前iNOS也明顯增多，與空白對(duì)照組比較（P＜0.05），治療后則顯著降低，與治療前和心肌炎模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 各組治療前后小鼠冠狀動(dòng)脈血管VEGF、VEGF mRNA表達(dá)情況比較 見表3。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到丹參組和心肌炎模型組小鼠在治療前后VEGF、VEGFmRNA均有一定程度升高，與空白對(duì)照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示小鼠心肌對(duì)CVB3 Nancy病毒造成心肌炎癥反應(yīng)會(huì)在一定程度上促進(jìn)冠狀動(dòng)脈血管VEGF及VEGFmRNA表達(dá)。丹參組和心肌炎模型組小鼠在治療前VEGF及VEGFmRNA比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療后，心肌炎模型組小鼠VEGF及VEGF mRNA無明顯變化，與空白對(duì)照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而丹參組則明顯升高并高于空白對(duì)照組水平，與治療前、空白對(duì)照組和心肌炎模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組治療前后小鼠冠狀動(dòng)脈血管VEGF、VEGFmRNA比較（±s）

表3 各組治療前后小鼠冠狀動(dòng)脈血管VEGF、VEGFmRNA比較（±s）

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3 討 論

病毒性心肌炎屬中醫(yī)學(xué)“心悸”“風(fēng)溫”“怔忡”等范疇，在發(fā)病初期，入侵的病毒對(duì)心肌細(xì)胞造成直接損傷，大量增殖的病毒會(huì)引起心肌細(xì)胞缺氧和缺血，持續(xù)生成氧自由基會(huì)造成心肌細(xì)胞膜、冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮及線粒體功能受損，心肌能量代謝發(fā)生障礙［5-6］。因此，如不及時(shí)、準(zhǔn)確地診治，患兒可能發(fā)生心力衰竭、心源性休克等并發(fā)癥導(dǎo)致死亡。臨床在救治病毒性心肌炎合并心力衰竭患兒時(shí)，應(yīng)用中藥制劑輔助治療可提高治療效果，如在本研究中應(yīng)用的丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液就具有抑制炎癥反應(yīng)、清除氧自由基，降低血液黏稠度、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，增加缺血心肌組織血液流量，增強(qiáng)心力衰竭心肌收縮力和心臟泵血功能作用［7-9］。另有研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA能通過多種信號(hào)通路和途經(jīng)抑制繁殖病毒或直接殺滅病毒，對(duì)病毒性心肌炎心肌細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用［10-11］。丹參還具有活血通經(jīng)、涼血消癰、理氣止痛及活血化瘀的中藥藥理特性，可增加血管通透性，臨床被廣泛用于心腦血管疾病的治療［12］。

本研究發(fā)現(xiàn)，治療后丹參組血清CK、CK-MB、LDH及MDA較治療前和心肌炎模型組明顯降低、SOD明顯提高，這提示丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液可提高SOD含量，增強(qiáng)機(jī)體清除氧自由基的能力，有效降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)對(duì)心肌及冠狀動(dòng)脈的損傷，心肌血清心肌酶譜CK、CK-MB、LDH及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物MDA明顯降低正是這一作用結(jié)果的有力證據(jù)。iNOS為一氧化氮（NO）誘導(dǎo)酶，iNOS必須經(jīng)炎性因子如細(xì)菌內(nèi)毒素或細(xì)胞因子等刺激才會(huì)在細(xì)胞上表達(dá)［13］。iNOS一旦誘生即會(huì)誘導(dǎo)催化產(chǎn)生大量NO，發(fā)揮非特異性免疫防御或免疫損傷作用，引起細(xì)胞線粒體呼吸抑制及DNA損傷，其直接結(jié)果會(huì)加重脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，而脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA又會(huì)造成血管內(nèi)皮細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷而加重心肌細(xì)胞及冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮損傷［14-15］。在對(duì)小鼠血管內(nèi)皮進(jìn)一步觀察，筆者發(fā)現(xiàn)心肌炎模型組治療前后冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮iNOS陽性細(xì)胞數(shù)均明顯增多，且高于空白對(duì)照組）。而丹參組治療前iNOS也明顯增多，且高于空白對(duì)照組，治療后則顯著降低，與治療前和心肌炎模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示CVB3 Nancy病毒感染會(huì)造成冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮損傷，而丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液可顯者降低iNOS的陽性表達(dá)，說明丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液可以降低CVB3 Nancy病毒感染造成的冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮損傷，故抑制iNOS的合成也是丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液保護(hù)冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮的重要機(jī)制之一。實(shí)驗(yàn)中，筆者還觀察到丹參組和心肌炎模型組小鼠在治療前后VEGF、VEGFmRNA均有一定程度升高，與空白對(duì)照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這提示小鼠心肌對(duì)CVB3 Nancy病毒造成心肌炎癥反應(yīng)會(huì)在一定程度上促進(jìn)冠狀動(dòng)脈血管VEGF及VEGFmRNA表達(dá)。治療后，心肌炎模型組小鼠VEGF及VEGFmRNA無明顯變化，與空白對(duì)照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而丹參組則明顯升高并高于空白對(duì)照組水平，與治療前、空白對(duì)照組和心肌炎模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液還具有促進(jìn)受損冠狀動(dòng)脈血管VEGF及VEGFmRNA表達(dá)的作用。VEGF是一類具有誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、促進(jìn)血管新生的一種高度特異性的促血管生長因子［16］。受損的冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮在高表達(dá)的VEGF作用下，大量血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移再生，側(cè)支循環(huán)迅速形成，缺血心肌灌流量增加，這也有利于受損心臟功能恢復(fù)［17］。

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