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    燈盞花素對腦外傷大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元自噬、炎癥損傷及TLR4/NF-κB信號通路的影響*

    2018-01-10 07:34:34童軍衛(wèi)劉補興胡小銘劉正敏蔡清風
    中國中醫(yī)急癥 2017年12期
    關鍵詞:花素米諾燈盞

    童軍衛(wèi) 劉補興 胡小銘 李 燁 劉正敏 蔡清風△

    [1.浙江省臺州恩澤醫(yī)療中心(集團)恩澤醫(yī)院,浙江 臺州 318050;2.浙江省臺州醫(yī)院,浙江臺州 317000]

    腦外傷(TBI)屬于神經(jīng)外科疾病,其致死致殘率占全身創(chuàng)傷的首位[1]。TBI常見的治療方法是開顱手術治療,術后的會引發(fā)顱內(nèi)感染,因此探尋降低顱內(nèi)感染的藥物成為研究的重點[2]。燈盞花素具有擴張腦血管、降低腦血管阻力、增加腦血流量、改善微循環(huán)、抗血小板聚集等作用[3]。近年來,不少學者將燈盞花素應用于TBI的治療中,研究表明,燈盞花素可以提高重度腦損傷患者生活質(zhì)量,減少并發(fā)癥和后遺癥的發(fā)生[4]。然而燈盞花素對TBI大鼠神經(jīng)元自噬和炎癥損傷的影響及其分子機制尚未見報道。本研究通過建立TBI大鼠模型,探究燈盞花素對神經(jīng)元自噬和炎癥損傷的影響及其作用機制?,F(xiàn)報告如下。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 SD雄性大鼠70只,SPF級,8~10周齡,體質(zhì)量(150±20)g,購自中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所,許可證號:SYXK(京)2015-0037。

    1.2 試藥與儀器 燈盞花素(國藥準字Z20053907,昆明龍津藥業(yè)股份有限公司,批號20160604,規(guī)格20 mg/支);米諾環(huán)素(批號0209833,日本昭和發(fā)酵工業(yè)株式會社);RNA提取和反轉錄試劑盒購自天根生化科技有限公司;TaqDNA聚合酶購自NEB公司;兔抗大鼠Beclin1多克隆抗、白細胞介素-6(IL-6)和TNF-αELISA試劑盒購自上海賽默科技生物發(fā)展有限公司;引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

    1.3 分組與造模 將造模成功的大鼠隨機分成5組,每組10只,分別命名為為模型組、米諾環(huán)素組(45mg/kg)、燈盞花素低劑量組 (0.1 mg/kg)、燈盞花素中劑量組(0.5 mg/kg)、燈盞花素高劑量組(1 mg/kg),假手術組及模型組注射等量容積0.9%氯化鈉注射液,持續(xù)治療2周。腦外傷動物模型建立:依據(jù)文獻[5],將大鼠腹腔注射4%水合氯醛進行麻醉,剪毛消毒后將大鼠固定,于頭皮正中切開,剝離右側顱頂骨膜,用顱骨鉆刺1個4mm的骨窗,剝開硬腦膜,在腦表面放置1枚墊片,從20 cm高度落下40 g的祛碼撞擊墊片,建立腦外傷模型;假手術組僅切開頭皮、左頂部開骨窗,不致腦外傷,模型組和假手術組均用牙科水泥固定骨孔處,縫合頭皮,然后將大鼠收回飼養(yǎng)。

    1.4 標本采集與檢測 大腦皮層組織分離:持續(xù)治療2周后,將大鼠麻醉,消毒后用剪刀剪開頭皮及顱骨,取出全腦,用10%甲醛溶液室溫下固定24 h,然后去除腦膜及血管,從中分離大腦皮層組織,置于-80℃冰箱,備用。1)甲苯胺藍染色檢測皮質(zhì)神經(jīng)元存活率:在冰凍切片機將大腦皮層組織切成8μm的薄片,室溫干燥后,用PBS漂洗,干燥后用1%甲苯胺藍染色20 min,水洗后放入0.5%鹽酸乙醇溶液中分化,經(jīng)梯度乙醇溶液脫水,二甲苯透明(25min),以中性樹膠封片。計錄存活神經(jīng)元數(shù)量,計算皮質(zhì)神經(jīng)元存活率。2)qRT-PCR檢測Beclin1 mRNA表達情況:提取大腦皮層組織總RNA,并將其反轉成cDNA,引物序列:F:5′-TGGATCTGGACCAGG-3′。R:5′-CAAATAATTAAATC CTTCCACATCT-3′,以GAPDH為內(nèi)參,進行qRTPCR。 反應體系:5×緩沖液 10μL,TaqDNA聚合酶1 μL,F(xiàn) 2 μL,R 2 μL,10 mM dNTPmix 1 μL,cDNA 1μL,ddH2O 33μL。 反應條件:95℃ 預變性 5 min,95℃變性30 s,59℃延伸15 s,40個循環(huán),延伸時讀取光密度(D)值,計算Beclin1 mRNA的相對表達量。3)免疫組化檢測Beclin1蛋白的表達:制作大腦皮層石蠟切片(不超過5 mm),將組織切片在92~98℃條件下存放20 min,滴加正常山羊血清后,在組織玻片上分別滴加Beclin1一抗,于4℃過夜放置,復溫后在組織玻片上滴加二抗,顯色后,用蘇木素復染,觀察Beclin1在大腦皮層組織中的表達情況。4)ELSA檢測血清中炎癥因子IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達情況:采集各組大鼠眼眶靜脈血,離心分離血清。采用IL-6和TNF-αELISA試劑盒檢測血清中IL-6和TNF-α的表達情況。5)Western blot檢測TLR4和核因子-κB(NF-κB)表達情況:取大腦皮層組織,加入細胞裂解液提取細胞總蛋白,以GAPDH為內(nèi)參,進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,每孔上樣體積20μL,電泳結束后,半干轉膜儀轉膜50 min,分別滴加兔抗鼠TLR4和NF-κB多克隆抗體,置于4℃下過夜,滴加二抗37℃放置1 h。加入ECL發(fā)光劑進行顯影,利用自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。采用Gel-Pro analyzer4軟件對SDSPAGE電泳圖目的條帶進行掃描,分析TLR4和NF-κB表達水平。

    1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以(±s)表示,多組采用單因素方差分析,兩組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結 果

    2.1 各組甲苯胺藍染色檢測皮質(zhì)神經(jīng)元存活率比較見表1。模型組皮質(zhì)神經(jīng)元存活率顯著低于假手術組(P<0.05);米諾環(huán)素組和燈盞花素組皮質(zhì)神經(jīng)元存活率顯著高于模型組(P<0.05);隨燈盞花素劑量增加,皮質(zhì)神經(jīng)元存活率提高,呈劑量依賴性。

    表1 各組甲苯胺藍染色檢測皮質(zhì)神經(jīng)元存活率比較(±s)

    表1 各組甲苯胺藍染色檢測皮質(zhì)神經(jīng)元存活率比較(±s)

    與假手術組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05;與米諾環(huán)素組比較,#P<0.05;與燈盞花素低劑量組比較,$P<0.05;與燈盞花素中劑量組比較,&P<0.05。

    組 別 n假手術組 10模型組 10米諾環(huán)素組 10皮質(zhì)神經(jīng)元存活率(%)85.62±6.56 24.36±4.32*42.12±4.78△燈盞花素低劑量組 10 45.38±4.23△燈盞花素中劑量組 10 62.72±5.17△#$燈盞花素高劑量組 10 78.36±5.36△#$&

    2.2 各組qRT-PCR檢測Beclin1 mRNA表達情況比較 見表2。模型組Beclin1mRNA表達水平顯著高于假手術組(P<0.05);米諾環(huán)素組和燈盞花素組Beclin1 mRNA表達水平顯著低于模型組(P<0.05);隨燈盞花素劑量增加,Beclin1mRNA表達水平降低,呈劑量依賴性。

    表2 各組qRT-PCR檢測大腦皮層Beclin1mRNA表達情況比較(±s)

    表2 各組qRT-PCR檢測大腦皮層Beclin1mRNA表達情況比較(±s)

    組 別 n假手術組 10模型組 10米諾環(huán)素組 10 Beclin1mRNA/GAPDH 0.21±0.02 0.96±0.12*0.78±0.08△燈盞花素低劑量組 10 0.74±0.07△燈盞花素中劑量組 10 0.56±0.05△#$燈盞花素高劑量組 10 0.38±0.04△#$&

    2.3 各組免疫組化檢測Beclin1蛋白表達情況比較見圖1。模型組Beclin1的表達水平高于假手術組;米諾環(huán)素組和燈盞花素組Beclin1的表達水平低于模型組;隨燈盞花素劑量的增加,Beclin1的表達水平降低,呈劑量依賴性。

    圖1 免疫組化檢測大腦皮層Beclin1蛋白的表達水平(200倍)

    2.4 各組ELSA檢測血清中炎癥因子IL-6、TNF-α表達情況比較 見表3。模型組IL-6、TNF-α表達水平顯著高于假手術組(P<0.05);米諾環(huán)素組和燈盞花素組IL-6和TNF-α表達水平顯著低于模型組 (P<0.05);隨燈盞花素劑量的增加,IL-6和TNF-α表達水平顯著降低,呈劑量依賴性。

    2.5 各組 Western blot檢測大腦皮層 TLR4、NF-κB表達情況比較 見表4。模型組TLR4和NF-κB表達水平顯著高于假手術組(P<0.05);米諾環(huán)素組和燈盞花素組TLR4、NF-κB表達水平顯著低于模型組 (P<0.05); 隨燈盞花素劑量增加,TLR4、NF-κB表達水平降低,呈劑量依賴性。

    表3 各組ELSA檢測血清中炎癥因子IL-6和TNF-α表達情況比較(μg/L,±s)

    表3 各組ELSA檢測血清中炎癥因子IL-6和TNF-α表達情況比較(μg/L,±s)

    組 別 n假手術組 10模型組 10米諾環(huán)素組 10燈盞花素低劑量組 10燈盞花素中劑量組 10燈盞花素高劑量組 10 IL-6 TNF-α 0.67±0.14 0.56±0.11 3.18±0.24* 2.98±0.24*2.78±0.17△ 2.72±0.19△2.76±0.17△ 2.71±0.17△1.75±0.14△#$ 1.58±0.14△#$0.97±0.12△#$& 0.83±0.13△#$&

    表4 各組Western blot檢測TLR4和NF-κB表達情況比較(±s)

    表4 各組Western blot檢測TLR4和NF-κB表達情況比較(±s)

    組 別 n假手術組 10模型組 10米諾環(huán)素組 10燈盞花素低劑量組 10燈盞花素中劑量組 10燈盞花素高劑量組 10 IL-6/GAPDH TNF-α/GAPDH 0.62±0.06 0.53±0.04 2.56±0.23* 2.44±0.20*2.16±0.17△ 2.03±0.15△2.14±0.15△ 2.00±0.12△1.62±0.10△#$ 1.48±0.08△#$0.86±0.06△#$& 0.73±0.04△#$&

    3 討 論

    腦外傷是指腦部因暴力所傷,導致血絡受損[6]?;诖死碚?,本研究采用祛碼撞擊的方法建立腦外傷大鼠模型,并以此為研究對象探究燈盞花素對腦外傷大鼠神經(jīng)元自的噬影響。研究表明,燈盞花素注射液能夠降低腦外傷患者血液黏度,疏通微循環(huán)[7]。然而燈盞花素對腦外傷大鼠神經(jīng)元自的噬影響尚未見報道。Beclin1是判斷自噬活性的重要指標。Ng G研究表明,Beclin1和Bcl-2共同參與組成Ⅲ型PI3復合物調(diào)控自噬[8]。張志雄研究表明,下調(diào) Beclin1基因的表達可以抑制大鼠海馬神經(jīng)元自噬[9]。本研究表明,燈盞花素能夠提高腦外傷大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的存活率,且隨燈盞花素劑量增加,皮質(zhì)神經(jīng)元的存活效率增加;同時,燈盞花素能夠降低大腦皮層中Beclin1表達水平,且隨燈盞花素劑量增加,Beclin1的表達水平顯著降低。

    腦外傷出血部位和周圍的炎癥反應是引發(fā)腦損傷的重要環(huán)節(jié)[10],其中參與炎癥反應的炎癥因子有IL-6、TNF-α,因此TNF-α和IL-6是評估腦外傷患者炎癥反應的重要指標[11-12]。有研究表明,腦外傷大鼠大腦組織中TNF-α和IL-6表達水平顯著升高,下調(diào)TNF-α和IL-6表達可以減少大鼠組織細胞的損傷,進而發(fā)揮對腦組織的保護作用[13]。本研究表明,模型組大鼠血清中IL-6、TNF-α表達水平顯著高于假手術組,提示腦外傷會引發(fā)嚴重的炎癥反應綜合征;燈盞花素組血清中IL-6和TNF-α表達水平顯著低于模型組,且呈劑量依賴性,提示燈盞花素能減弱腦外傷大鼠的炎癥反應。

    TLRs能夠介導炎癥反應[14]。 研究表明,IL-6和TNF-α是由TLR4/NF-κB信號通路調(diào)控的,當細胞內(nèi)TLR4被激活時,能夠與熱休克蛋白60(HSP 60)結合,進而激活 NF-κB[15]。 汪春研究表明,蛛網(wǎng)膜下腔出血可引發(fā)TLR4和NF-κB上調(diào)表達,同時可介導炎癥因子增加[16]。本研究表明,燈盞花素能夠抑制TLR4/NF-κB信號通路中TLR4和NF-κB蛋白的表達水平,且隨燈盞花素劑量增加,TLR4和NF-κB表達水平顯著降低,且呈劑量依賴性。

    綜上所述,燈盞花素能夠減弱腦外傷大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元自噬和炎癥損傷,推測這一作用是通過抑制TLR4/NF-κB信號通路來實現(xiàn)的,為腦外傷靶向藥物的開發(fā)提供一定的理論基礎。

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