環(huán)孢素A和他克莫司在體外對外周血單個核細(xì)胞內(nèi)乙型肝炎病毒復(fù)制的影響

張友福 羅來邦 楊華 丁利民 楊錦然 羅文峰 龍成美 李新長

摘 要 目的：探討環(huán)孢素A（ciclosporin A， CsA）和他克莫司（FK506）在體外對外周血單個核細(xì)胞內(nèi)乙型肝炎病毒復(fù)制的影響。方法：建立乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸（HBV-DNA）永久轉(zhuǎn)染人外周血單個核細(xì)胞株，計算CsA和FK506對HBV-DNA永久轉(zhuǎn)染人外周血單個核細(xì)胞株的藥物安全濃度，采用狹縫印跡雜交法半定量分析細(xì)胞內(nèi)HBVDNA水平。結(jié)果：CsA和FK506的藥物作用安全濃度分別是≤36 μg/ml和≤200 ng/ml。在安全濃度范圍內(nèi)，CsA的質(zhì)量濃度與細(xì)胞內(nèi)HBV-DNA相對復(fù)制水平呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.886，P<0.05）；FK506的質(zhì)量濃度與細(xì)胞內(nèi)HBVDNA相對復(fù)制水平無明顯相關(guān)性（r=-0.593，P>0.05）。結(jié)論：CsA在體外呈劑量依賴性地抑制外周血單個核細(xì)胞內(nèi)乙型肝炎病毒復(fù)制，而FK506不具備上述特性。

關(guān)鍵詞 環(huán)孢素A 他克莫司 乙型肝炎病毒 外周血單個核細(xì)胞

中圖分類號：R373.21 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1006-1533（2018）23-0097-03

In vitro effect of ciclosporin A and tacrolimus on the replication of peripheral blood mononuclear cells mesne hepatitis B virus *

ZHANG Youfu**， LUO Laibang， YANG Hua， DING Limin， YANG Jinran， LUO Wenfeng， LONG Chengmei， LI Xinchang（Department of No.3 General Surgery， the Peoples Hospital of Jiangxi Province， Nanchang 331100， China）

ABSTRACT Objective： To discuss the effect of ciclosporin A （CsA） and tacrolimus （FK506） on the replication of peripheral blood mononuclear cells mesne hepatitis B virus in vitro. Methods： A human peripheral blood mononuclear cell line permanently transfected with hepatitis B virus deoxyribonucleic acid （HBV-DNA） was established to calculate the safe concentrations of CsA and FK506 for HBV-DNA permanently transfected human peripheral blood mononuclear cell line， and semi-quantitative analysis of intracellular HBV-DNA levels was performed by slot blot hybridization. Results： The safe concentrations of CsA and FK506 were <36 mg/ml and <200 ng/ml， respectively. Within the safe concentration range， the mass concentration of CsA was negatively correlated with the relative replication level of HBV-DNA in cells （r=-0.886， P<0.05）； the mass concentration of FK506 was not correlated with the relative replication level of HBV-DNA in cells （r=-0.593， P>0.05）. Conclusion： CsA can in vitro inhibit hepatitis B virus replication in peripheral blood mononuclear cells in a dose-dependent manner but not FK506.

KEY WORDS ciclosporin A； tacrolimus； hepatitis B virus； peripheral blood mononuclear cell

環(huán)孢素A（cyclosporin A， CsA）和他克莫司（FK506）均為常用的器官移植后免疫抑制劑。研究發(fā)現(xiàn)，CsA 對乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸（HBV-DNA）轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞的乙肝表面抗原、HBV-DNA表達(dá)具有抑制作用[1]。然而，HBV不僅存在于肝細(xì)胞中，而且存在于外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell， PBMC）中，PBMC內(nèi)HBV成為乙型肝炎病患者肝移植術(shù)后HBV再感染的病毒來源之一[2-3]。目前，關(guān)于CsA或FK506對PBMC內(nèi)HBV復(fù)制的體外實驗研究卻鮮有報道。為此，我院開展本研究，旨在探討CsA和FK506在體外對PBMC內(nèi)HBV復(fù)制的影響，為日后肝移植免疫抑制方案的臨床研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

收集乙肝病毒攜帶者的外周靜脈血，分離PBMC，將PBMC種植于10%胎牛血清（美國Gibco 公司）、100 U/ml青霉素（美國Sigma公司）的RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），置于孵箱中培養(yǎng)（37 ℃、飽和濕度、5% CO2），待細(xì)胞融合度達(dá)85%±5%時，用0.25%胰蛋白酶（美國Thermo Fisher Scientific公司）消化傳代，待P/N值>5時，用于實驗[4]。

1.2 四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl terazolium， MTT）試驗

取對數(shù)生長期的PBMC，0.25%胰蛋白酶消化后稀釋成2.5×104個/ml的混懸液，接種于96孔板上，200μl/孔。培養(yǎng)24 h后棄上清液，分別加入100 μl預(yù)先配制好的含不同濃度CsA 的培養(yǎng)基（0.00、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00、24.00、36.00、40.00、80.00、100.00及200.00 μg/ml）和FK506的培養(yǎng)基（0.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00、200.00、400.00、800.00、1000.00、2000.00、4000.00及5000.00 ng/ml），以不含藥孔作對照，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。每隔24 h換相應(yīng)藥物質(zhì)量濃度的新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 d后棄上清液，每孔加入5 g/L的MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入二甲基亞砜200 μl，用全自動酶標(biāo)儀于570 mm處測定A值[5]。采用下列公式計算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=藥物處理孔A值平均值/對照孔A值平均值×100%。

1.3 藥物干預(yù)實驗

取對數(shù)生長期的PBMC，胰酶消化后稀釋成2.5×104個/ml的混懸液，接種于24孔板上，200 μl/孔。培養(yǎng)24 h后棄上清液，分別加入100 μl預(yù)先配制好的含不同濃度 CsA的培養(yǎng)基（0.00、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00、24.00及36.00 μg/ml）和 FK506的培養(yǎng)基（0.00、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00、160.00及200.00 ng/ml），以不含藥孔作對照。每隔24 h換相應(yīng)藥物質(zhì)量濃度的新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 d后收集24孔板各孔培養(yǎng)細(xì)胞，獨立保存。

1.4 HBV-DNA檢測

培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)磷酸鹽緩沖液（氫離子濃度指數(shù)為7.8）漂洗，采用全蛋白提取試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）按說明書提取細(xì)胞 DNA。以所提取的DNA為模板，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（全式金生物技術(shù)有限公司）按說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以b肌動蛋白為內(nèi)參，并用DNA凝膠電泳回收提純。采用狹縫印跡雜交半定量（試劑盒購自上海羅氏制藥有限公司）分析HBV-DNA復(fù)制相對水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS 20.00統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。采用Pearson相關(guān)性分析藥物的質(zhì)量濃度與細(xì)胞內(nèi)HBV-DNA相對復(fù)制水平的相關(guān)關(guān)系，檢驗水準(zhǔn)a=0.05。

2 結(jié)果

2.1 MTT 結(jié)果

CsA的質(zhì)量濃度在0.00、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00、24.00、36.00 μg/ml 時，細(xì)胞存活率>95%。提示，CsA≤36 μg/ml對培養(yǎng)細(xì)胞無毒性，為藥物作用安全濃度。FK506的質(zhì)量濃度在0.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00、200.00 ng/ml 時，細(xì)胞存活率>95%。提示，F(xiàn)K506≤200 ng/ml 對培養(yǎng)細(xì)胞無毒性，為藥物作用安全濃度。

2.2 CsA和FK506在體外對細(xì)胞內(nèi)HBV-DNA復(fù)制的影響

0.00、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00、24.00及36.00 μg/ml的CsA作用4 d時間后，細(xì)胞內(nèi)HBVDNA相對復(fù)制水平分別為99.68、92.76、88.96、89.92、85.49、79.54、75.44、74.80及70.26%。0.00、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00、160.00及200.00 ng/ml的FK506作用4 d時間后，細(xì)胞內(nèi)HBV-DNA 相對復(fù)制水平分別為99.46、99.72、99.83、99.65、99.49、99.20、99.50及99.30%。

CsA的質(zhì)量濃度與細(xì)胞內(nèi)HBV-DNA相對復(fù)制水平呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.886，P<0.05）；FK506的質(zhì)量濃度與細(xì)胞內(nèi)HBV-DNA相對復(fù)制水平無明顯相關(guān)性（r=-0.593，P>0.05）。

3 討論

HBV-DNA是觀察病毒感染復(fù)制的“金標(biāo)準(zhǔn)”，HBV-DNA永久轉(zhuǎn)染人PBMC細(xì)胞株能完整地表達(dá)HBV-DNA，因此是PBMC內(nèi)HBV復(fù)制體外實驗的理想模型[5-6]。MTT結(jié)果提示，CsA≤36 μg/ml對培養(yǎng)細(xì)胞無毒性，F(xiàn)K506≤200 ng/ml對培養(yǎng)細(xì)胞無毒性，為藥物作用安全濃度。因此，本研究在上述藥物作用濃度下觀察CsA和FK506對培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)HBV-DNA相對復(fù)制水平的影響。

本研究結(jié)果顯示，CsA的質(zhì)量濃度與細(xì)胞內(nèi)HBVDNA相對復(fù)制水平呈顯著負(fù)相關(guān)；FK506的質(zhì)量濃度與細(xì)胞內(nèi)HBV-DNA相對復(fù)制水平無明顯相關(guān)性。提示，CsA能呈劑量依賴性地抑制細(xì)胞內(nèi)HBV-DNA復(fù)制，而FK506對細(xì)胞內(nèi)HBV-DNA復(fù)制無明顯影響。有關(guān)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路的研究發(fā)現(xiàn)，CsA能與HBV-DNA轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞中的線粒體膜通透轉(zhuǎn)運復(fù)合孔結(jié)合，與該復(fù)合孔結(jié)合后能抑制該復(fù)合孔的構(gòu)成亞基——親環(huán)孢素D的催化活性，從而阻止該復(fù)合孔的構(gòu)象變化，續(xù)而干擾HBV-DNA轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞表達(dá)，進(jìn)而抑制HBV-DNA轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞復(fù)制[7-9]。FK506在HBV-DNA轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白質(zhì)為FKBP，其介導(dǎo)的鈣離子與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與親環(huán)孢素D不同，這可能是FK506不能抑制HBV-DNA轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞復(fù)制的原因[10]。HBV-DNA轉(zhuǎn)染人PBMC細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的感染復(fù)制及致病機制完全相同[11]。筆者推測，CsA 在 HBV-DNA 永久轉(zhuǎn)染人PBMC細(xì)胞中抑制HBV復(fù)制的過程與HBV-DNA 轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞相同。上述論斷還有待進(jìn)一步研究來證實。

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