甘草藥渣降解菌的篩選及其產(chǎn)酶工藝研究

曾飛 張森 錢大瑋 朱振華 周嘉琳 段金廒

（1. 南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心 中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心 國家中醫(yī)藥管理局中藥資源循環(huán)利用重點(diǎn)研究室，南京 210023；2. 江蘇天江藥業(yè)有限公司，江陰 214400）

甘草藥渣降解菌的篩選及其產(chǎn)酶工藝研究

曾飛1張森1錢大瑋1朱振華1周嘉琳2段金廒1

（1. 南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心 中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心 國家中醫(yī)藥管理局中藥資源循環(huán)利用重點(diǎn)研究室，南京 210023；2. 江蘇天江藥業(yè)有限公司，江陰 214400）

篩選能夠有效降解甘草藥渣的菌株，優(yōu)化菌株的纖維素酶生產(chǎn)工藝。從腐爛的甘草及土壤中篩選甘草藥渣降解菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察及18S rDNA測序確定菌株的分類地位；考察了不同因素對菌株發(fā)酵的影響；采用L9（34）正交分析法確定菌株最佳產(chǎn)酶條件；利用菌株生產(chǎn)的纖維素酶對甘草藥渣進(jìn)行酶解研究。確定分離菌株為Penicillium oxalicum，命名為草酸青霉G2。正交分析結(jié)果表明，藥渣含量、發(fā)酵時(shí)間對G2的發(fā)酵有顯著影響（P＜0.05，P＜0.05）；在最佳產(chǎn)酶工藝條件下，測得G2濾紙酶活力3.43 U /mL、內(nèi)切酶活力16.89 U /mLu；甘草藥渣的酶解結(jié)果表明，G2生產(chǎn)的纖維素酶（G2酶）對甘草藥渣的酶解效率優(yōu)于商品酶。此外，甘草藥渣經(jīng)酶解以后，甘草總黃酮提取率明顯升高。對甘草藥渣降解菌的篩選以及對菌株的產(chǎn)酶工藝研究，旨在為合理利用甘草藥渣以及生產(chǎn)成本低廉、性能優(yōu)良的纖維素酶奠定基礎(chǔ)。

甘草藥渣；纖維素酶；草酸青霉

纖維素酶在生物乙醇的生產(chǎn)過程中具有重要作用。但纖維素酶生產(chǎn)成本較高，在一定程度上限制了生物能源行業(yè)的發(fā)展［1］。目前，工業(yè)上常采用液體發(fā)酵法生產(chǎn)纖維素酶，其中原材料就占到了生產(chǎn)成本的40%-60%［2］。可見控制原材料的成本可以有效地降低纖維素酶的生產(chǎn)成本。此外，工業(yè)上還通過篩選高產(chǎn)菌株來控制生產(chǎn)成本［3］。

我國每年大概產(chǎn)生3 000萬t左右的中藥藥渣。中藥藥渣的大量排放，已經(jīng)對環(huán)境造成了嚴(yán)重的破壞，同時(shí)也嚴(yán)重制約了中藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［4］。目前，藥渣過剩的問題已經(jīng)引起了越來越多的關(guān)注。特別是利用生物發(fā)酵技術(shù)對藥渣進(jìn)行再利用研究，已經(jīng)成為目前的研究熱點(diǎn)。如敖楊等［5］利用生物發(fā)酵將金蓮花藥渣轉(zhuǎn)化為飼料添加劑，其可以顯著改善肉雞的生產(chǎn)性能。黃凡等［6］利用黑曲霉固態(tài)發(fā)酵三七藥渣生產(chǎn)纖維素酶。

甘草是臨床上常用藥，每年僅其制劑及提取物的消耗量就達(dá)近萬噸，也因此產(chǎn)生了大量的廢棄甘草藥渣［7］。研究發(fā)現(xiàn)，甘草藥渣不僅可以作為提取藥用活性成分的原料，還可以作為廉價(jià)的生物質(zhì)資源。甘草藥渣中除含有豐富藥用活性成分外［8-9］，其纖維素、半纖維素及木質(zhì)素的含量分別達(dá)到17.4%、16.95%和9.54%［10］。近年來，關(guān)于甘草藥渣的研究主要是對其生物活性物質(zhì)的再利用研究，如張娟等［11］利用甘草藥渣制備甘草查爾酮A；方詩琪等［7］從甘草藥渣中分離出具有抗氧化活性的物質(zhì)。但甘草藥渣在提取有效成分以后，其殘余的固體物質(zhì)仍會對環(huán)境造成污染。由此可見，僅利用甘草藥渣的有效成分，仍不能有效的處置甘草藥渣。因此，需要對甘草藥渣中的有效成分和纖維素資源進(jìn)行綜合利用，尤其是纖維素資源的再利用研究。本實(shí)驗(yàn)的主要目的是篩選能夠有效降解甘草藥渣的菌株，確定菌株的最佳產(chǎn)酶工藝，同時(shí)研究該酶對甘草藥渣的降解效率，以及酶解后藥渣中藥用活性成分提取率的變化。旨在合理處置甘草藥渣，同時(shí)生產(chǎn)成本低廉、性能良好的纖維素酶。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 草酸青霉G2由本實(shí)驗(yàn)室從腐爛的甘

草植株（甘肅定西）中分離得到。

1.1.2 甘草藥渣 甘草藥渣由江陰天江藥業(yè)提供，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)段金廒教授鑒定為烏拉爾甘草藥渣。甘草藥渣經(jīng)自然風(fēng)干、烘干、粉碎、過60目篩后，置于干燥器中備用。

1.1.3 培養(yǎng)基 選擇培養(yǎng)基：（NH4）2SO43 g/L、尿素0.3 g/L、KH2PO42 g/L、甘草藥渣50 g/L、MgSO40.5 g/L ；CMC-Na平板 ：（NH4）2SO43 g/L、尿素 0.3 g/L、KH2PO42 g/L、MgSO40.5 g/L、CMC-Na 10 g/L、瓊脂15 g/L；PDA培養(yǎng)基：土豆200 g/L、葡萄糖10 g/L、瓊脂15 g/L；種子培養(yǎng)基：酵母膏1 g/L、葡萄糖1 g/L、（NH4）2SO43 g/L、尿素 0.3 g/L、KH2PO42 g/L ；初始發(fā)酵培養(yǎng)基：甘草藥渣、（NH4）2SO43 g/L、尿素0.3 g/L、KH2PO42 g/L、MgSO40.5 g/L、0.1%金屬離子（FeSO4·7H2O 0.005 g/L、MnSO4·H2O 0.001 6 g/L、ZnSO4·7H2O 0.001 4 g/L、CoCl20.002 g/L）、0.1% 吐溫-80。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選與鑒定 菌株篩選：取腐爛的甘草或土壤1 g。將其分別置于以藥渣為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行富集，30℃、培養(yǎng)48 h。再將培養(yǎng)液適當(dāng)?shù)南♂?，并涂抹到CMC-Na平板上，30℃、培養(yǎng)72 h。剛果紅染色，挑選透明圈較明顯的菌落置于PDA平板上進(jìn)行純化。同時(shí)，對純化后的菌株進(jìn)行液體發(fā)酵復(fù)篩。菌株的鑒定：對復(fù)篩后的菌株，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，同時(shí)外出送樣進(jìn)行測序。

1.2.2 培養(yǎng)方法 斜面培養(yǎng)：將菌株劃線接種于PDA斜面，30℃培養(yǎng)48 h。種子培養(yǎng)：每支斜面加5 mL無菌水，取1 mL接入種子培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速180 r/min，30℃、培養(yǎng)24 h。發(fā)酵培養(yǎng)：250 mL三角瓶中裝入發(fā)酵培養(yǎng)基80 mL，按5%接種量接入種子培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)速180 r/min搖床培養(yǎng)。

1.2.3 酶活測定 發(fā)酵液經(jīng)4 000 r/min離心30 min，收集上清液即為粗酶液。參照文獻(xiàn)［12］，粗酶液經(jīng)適當(dāng)稀釋后，采用DNS比色法，測定濾紙酶、內(nèi)切酶活力。參照文獻(xiàn)［13］，粗酶液經(jīng)適當(dāng)稀釋后，測定β-葡萄糖苷酶活。（1 mL酶液在pH4.8、50℃恒溫水浴條件下水解底物，1 min內(nèi)生成1 μmol 葡萄糖定義為一個(gè)酶活單位，用U/mL表示。）

1.2.4 草酸青霉G2產(chǎn)酶條件分析 分別考察藥渣含量、初始pH、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、原材料預(yù)處理方式等因素對草酸青霉G2液體發(fā)酵的影響，并測量各發(fā)酵液的纖維素酶活力。

1.2.4.1 藥渣含量對酶活的影響 在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加1%、3%、5%、7%、9%、11%的甘草藥渣，其它條件不變，30℃、自然pH發(fā)酵120 h。1.2.4.2 初始pH對酶活的影響 在單因素實(shí)驗(yàn)1.2.4.1的結(jié)果下，將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH分別調(diào)至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，30℃發(fā)酵 120 h，測量各發(fā)酵液的纖維素酶活性。

1.2.4.3 發(fā)酵溫度對酶活的影響 在單因素實(shí)驗(yàn)1.2.4.1和1.2.4.2的結(jié)果下，發(fā)酵溫度分別為20、25、30、35、40℃的條件下培養(yǎng)120 h，測量各發(fā)酵液的纖維素酶活性。

1.2.4.4 發(fā)酵時(shí)間對酶活的影響 在單因素實(shí)驗(yàn)1.2.4.1-1.2.4.3的結(jié)果下，分別發(fā)酵24、48、72、96、120、144、168、192 h，測量各發(fā)酵液的纖維素酶活性。

1.2.4.5 原材料預(yù)處理方式對酶活的影響 以分別經(jīng)過超聲2 h、5% NaOH靜置24 h、5% NaOH超聲2 h處理的甘草藥渣為基質(zhì)配制培養(yǎng)基。在發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH6.0、藥渣含量3%、及培養(yǎng)基其它條件不變的情況下，30℃發(fā)酵144 h，測量各發(fā)酵液的纖維素酶活。以空白組的酶活為100%，計(jì)算相對酶活。1.2.5 草酸青霉G2產(chǎn)酶條件優(yōu)化 在單因子實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用對發(fā)酵結(jié)果影響較大的藥渣用量、發(fā)酵時(shí)間、初始pH值、發(fā)酵溫度4個(gè)因素，進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)（見表1），以濾紙酶活及內(nèi)切酶活為指標(biāo)用于優(yōu)化草酸青霉G2液體發(fā)酵條件。

1.2.6 甘草藥渣的酶解研究 參考文獻(xiàn)［14］，利用G2酶、商品酶1（Sigma）、商品酶2（Novozymes）對甘草藥渣進(jìn)行酶解研究。G2酶組、商品酶1組、商品酶2組中酶的用量為10 U/g（每克甘草藥渣），所有組中固液比1∶50（pH4.8的檸檬酸緩沖鹽），空白組最后加入相同量的緩沖液。在50℃、200 r/min的條件下分別酶解24、48、72 h，取樣測定葡萄糖含量及總黃酮的含量。依據(jù)文獻(xiàn)［15］利用葡萄氧化酶法測定葡萄糖量。甘草總黃酮的提取∶料液比1∶20，70%乙醇超聲提取30 min，提取兩次，過濾，合并兩次濾液。參考文獻(xiàn)［16］，測定甘草總黃酮的含量。

表1 草酸青霉G2發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶因素水平

2 結(jié)果

2.1 甘草藥渣降解菌的篩選及鑒定

2.1.1 菌種初篩 從腐爛的甘草、土壤中篩選得到25株能以甘草藥渣為唯一碳源生長的菌株，其中4株長勢最佳，且在纖維素-剛果紅平板上透明圈較大。同時(shí)，經(jīng)過液體發(fā)酵酶活力初步測定（表2），菌株G2最優(yōu)，故挑選該菌做后續(xù)研究。

表2 不同菌種纖維素酶活力的比較

2.1.2 形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定 將菌株G2接種于PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)3 d，菌落平坦或近于平坦，質(zhì)地絨狀，菌絲初為白色后逐漸變?yōu)榘稻G色，分生孢子易脫落，分生孢子結(jié)構(gòu)大量產(chǎn)生，分生孢子面深橄欖綠色，滲出液缺乏，反面近于無色，可溶性色素缺乏。根據(jù)以上特征，參照《真菌鑒定手冊》和《中國真菌志》，菌株可初步判定為半知菌綱（Fungi Imperficti）殼霉目（Sphaeropsidales）杯霉科（Discellaceae）青霉屬（Penicillium）。菌株經(jīng)18S rDNA鑒定為草酸青霉菌（Penicillium oxalicum），命名為草酸青霉菌G2。

圖1 草酸青霉菌G2的18S rDNA進(jìn)化樹分析

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 藥渣含量對酶活的影響 利用甘草藥渣作為唯一碳源，考察培養(yǎng)基中不同含量的甘草藥渣對酶活的影響。結(jié)果如圖2所示。培養(yǎng)基中甘草藥渣含量為3%時(shí)，濾紙酶和內(nèi)切酶活均為最高。當(dāng)藥渣含量高于3%時(shí)，濾紙酶和內(nèi)切酶活均開始出現(xiàn)不同程度的降低，尤其是濾紙酶活力降低的較為明顯。

圖2 不同含量藥渣對酶活的影響

2.2.2 初始pH對酶活的影響 圖3為在液態(tài)發(fā)酵條件下濾紙酶和內(nèi)切酶活力變化曲線。當(dāng)培養(yǎng)基的初始pH6-7時(shí)，內(nèi)切酶與濾紙酶活力均較高。當(dāng)培養(yǎng)基的初始pH3-6時(shí)，隨著pH的增加內(nèi)切酶與濾紙酶活力均逐漸增加；培養(yǎng)基的初始pH大于7時(shí)內(nèi)切酶和濾紙酶活均顯著降低，pH8.0時(shí)，內(nèi)切酶與濾紙酶活均到達(dá)最低值。

圖3 初始pH對酶活的影響

2.2.3 發(fā)酵溫度對酶活的影響 如圖4所示，發(fā)酵溫度20℃時(shí)，酶活力最低。發(fā)酵溫度30℃時(shí)，濾紙酶活和內(nèi)切酶活均達(dá)到最高。當(dāng)發(fā)酵溫度高于30℃時(shí)，酶活開始下降，內(nèi)切酶活下降的較為明顯，但濾紙酶活下降并不明顯。溫度為40℃時(shí)，內(nèi)切酶活和濾紙酶活均高于20℃。

圖4 溫度對酶活的影響

2.2.4 發(fā)酵時(shí)間對酶活的影響 如圖5所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，酶活力逐漸升高，發(fā)酵144 h時(shí)，濾紙酶活和內(nèi)切酶活均達(dá)到最大值。發(fā)酵時(shí)間低于144 h時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，濾紙酶活和內(nèi)切酶活出現(xiàn)不同程度的升高。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間高于144 h時(shí)，此時(shí)濾紙酶活和內(nèi)切酶活開始顯著下降。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對酶活的影響

2.2.5 原材料預(yù)處理方式對酶活的影響 以經(jīng)過不同預(yù)處理方式的甘草藥渣為基質(zhì)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，其對酶活的影響如圖6。結(jié)果表明，預(yù)處理組的酶活均低于未處理組。其中NaOH超聲2 h組，產(chǎn)生的酶活最低。在所有預(yù)處理組中，濾紙酶活力下降的水平比內(nèi)切酶更顯著。由于原材料的預(yù)處理，導(dǎo)致濾紙酶活力的顯著下降，因此采用不經(jīng)預(yù)處理的甘草藥渣進(jìn)行發(fā)酵。

圖6 原材料預(yù)處理方式酶活的影響

2.3 發(fā)酵條件的正交優(yōu)化

在單因子實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用對發(fā)酵結(jié)果影響較大的發(fā)酵溫度（A）、初始pH值（B）、藥渣含量（C）、發(fā)酵時(shí)間（D）4個(gè)因素，以濾紙酶活及內(nèi)切酶活為指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）的正交實(shí)驗(yàn)，用于優(yōu)化草酸青霉G2液體發(fā)酵條件。試驗(yàn)安排及結(jié)果見表3，方差分析見表4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，上述4個(gè)因素對濾紙酶活與內(nèi)切酶活的影響一致。由直觀分析可知，4個(gè)因素對濾紙酶與內(nèi)切酶活的影響順序D＞C＞A＞B。表4方差分析結(jié)果表明，因素C、D的不同水平對濾紙酶活有顯著影響（P＜0.05，P＜0.05），這與直觀分析的結(jié)果一致。因此，最佳發(fā)酵工藝條件為A2B2C2D3，即發(fā)酵溫度30℃、起始pH6.0、藥渣含量3%、發(fā)酵時(shí)間144 h。

2.4 正交驗(yàn)證

通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出的最佳組合A2B2C2D3，并未出現(xiàn)在正交實(shí)驗(yàn)中。因此需要進(jìn)行工藝驗(yàn)證。結(jié)果最優(yōu)組合的濾紙酶活為3.43 U/mL，較正交試驗(yàn)中的較優(yōu)組合3.23 U/mL提高了6.2%；內(nèi)切酶活為16.89 U/mL，高于正交試驗(yàn)中的較優(yōu)組合16.07 U/mL，提高了5%。因此，G2的最適發(fā)酵條件為：甘草藥渣含量3%、溫度30℃、起始pH6.0、發(fā)酵時(shí)間144 h。

2.5 甘草藥渣的酶解研究

如表5所示，G2酶對甘草藥渣的降解作用明顯優(yōu)于商品酶1及商品酶2。在酶解72 h時(shí)，G2酶組葡萄糖產(chǎn)量達(dá)到最大值121 mg/g，同時(shí)總黃酮含量達(dá)到68.5 mg/g，與空白組相比總黃酮提取率提高36.2%。酶解72 h時(shí)，商品酶1組的葡萄糖產(chǎn)量達(dá)到最大值44 mg/g，總黃酮含量達(dá)到59.3 mg/g，與空白組相比總黃酮提取率提高17.7%；商品酶2組的葡萄糖產(chǎn)量達(dá)到最大值58 mg/g，總黃酮含量達(dá)到60.3 mg/g，與空白組相比總黃酮提取率提高了19.6%。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

表4 方差分析結(jié)果

表5 纖維素酶對甘草藥渣的酶解作用

3 討論

篩選性能優(yōu)良纖維素酶生產(chǎn)菌，是降低纖維素酶生產(chǎn)成本的有效途徑之一［17］。本試驗(yàn)以腐爛的甘草及土壤為篩選對象。同時(shí)，為了避免遺漏優(yōu)良菌種，除了采用傳統(tǒng)的剛果紅平板法進(jìn)行初篩外，還以多種纖維素酶活為指標(biāo)，利用甘草藥渣為底物進(jìn)行液體發(fā)酵復(fù)篩。最后從腐爛的甘草中篩選出纖維素降解菌G2，結(jié)合形態(tài)學(xué)以及18S rDNA分析結(jié)果確定為草酸青霉。目前，關(guān)于草酸青霉的研究較多，不同的研究結(jié)果表明，菌株發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的性能受培養(yǎng)基組成、原料的品質(zhì)、菌種數(shù)量、操作條件等因素的影響。如李洋等［18］研究發(fā)現(xiàn)，碳源、氮源、發(fā)酵初始pH對草酸青霉菌株產(chǎn)酶性能有顯著影響。

本試驗(yàn)考察了藥渣含量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵起始pH、發(fā)酵時(shí)間以及原材料預(yù)處理方式對草酸青霉G2發(fā)酵影響。培養(yǎng)基的碳氮比直接影響了發(fā)酵效率和微生物的產(chǎn)酶能力［18］。當(dāng)培養(yǎng)基中藥渣含量發(fā)生變化時(shí)，其碳氮比也會發(fā)生明顯變化，從而導(dǎo)致微生物的產(chǎn)酶效率發(fā)生不同程度的變化。發(fā)酵起始pH6-7時(shí)，G2的產(chǎn)酶性能較高；pH＞7時(shí)，G2的產(chǎn)酶性能顯著降低。草酸青霉菌適宜在酸性條件下生長［19］，因此當(dāng)環(huán)境pH呈酸性時(shí)利于菌體的生長以及菌株發(fā)酵性能的提高。發(fā)酵時(shí)間低于144 h時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，濾紙酶活和內(nèi)切酶活出現(xiàn)不同程度的升高，這與生物量逐漸增加以及菌體的活力逐漸達(dá)到最大值有關(guān)。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間高于144 h時(shí)，此時(shí)濾紙酶活和內(nèi)切酶活顯著下降，這可能與發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)的減少以及菌體的活力下降有關(guān)。原材料經(jīng)超聲和NaOH處理均能有效的破壞其木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)，從而暴露纖維素［20-21］。但甘草藥渣經(jīng)超聲和堿處理以后，酶活卻出現(xiàn)了降低，推測是由于實(shí)驗(yàn)菌株G2分離于腐爛的甘草，G2的生長可能依賴于甘草中的某些成分如：三萜皂苷、黃酮、多糖及蛋白等。本研究雖然應(yīng)用的是甘草藥渣，對其成分分析結(jié)果顯示仍含有一定量的這些成分，但這些成分在預(yù)處理過程中會大量損失，如超聲處理可促進(jìn)這些成分進(jìn)入溶媒中，堿處理可破壞這些成分，兩者結(jié)合會使這些成分的損失更加嚴(yán)重，損失越多越不利于菌株G2的生長，從而導(dǎo)致菌株的產(chǎn)酶效率降低，圖6的結(jié)果似乎亦支持這一推測。

正交分析結(jié)果表明，藥渣含量、發(fā)酵時(shí)間對菌種的發(fā)酵影響較大。同時(shí)，還確定了G2的最佳產(chǎn)酶條件：藥渣含量3%、溫度30℃、起始pH6.0、發(fā)酵時(shí)間144 h。G2利用優(yōu)化后的工藝進(jìn)行發(fā)酵，濾紙酶活和內(nèi)切酶活分別達(dá)到了3.43 U/mL和16.89 U/mL，濾紙酶活高于此前報(bào)道的草酸青霉IODBF-5液體發(fā)酵的酶活 2.7 U/mL［22］。

甘草藥渣的酶解結(jié)果表明，G2酶對甘草藥渣的酶解效率高于商品酶1、2。李瓊翠等［10］用商品酶酶解甘草藥渣葡萄糖產(chǎn)率僅為29.07 mg/g，低于本試驗(yàn)的121 mg/g。商品酶在純化的過程中，其成分會出現(xiàn)一定程度上的損失，從而導(dǎo)致其酶活降低［23］。因此，有可能導(dǎo)致商品酶在酶解效率上低于G2生產(chǎn)的粗酶液。已有研究表明，生產(chǎn)纖維素酶的底物與酶解底物為同一原材料時(shí)，其生產(chǎn)的纖維素酶對該材料的酶解效率更高［12］。

4 結(jié)論

草酸青霉G2液體發(fā)酵甘草藥渣可以產(chǎn)生活力較高的纖維素酶，并且該酶能夠有效地糖化甘草藥渣，同時(shí)使藥渣中有效成分的提取率得到顯著提高。

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Screening the Strains Degrading Glycyrrhiz uralensis Residues and Its Enzyme Production

ZENG Fei1ZHANG Sen1QIAN Da-wei1ZHU Zheng-hua1ZHOU Jia-lin2DUAN Jin-ao1
（1. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization，National and Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Traditional Chinese Medicine Resource Recycling，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023 ；2. Tianjiang Pharmaceutical Industry of Jiangsu Province，Jiangyin 214400）

This work aims to screen the strains that can degrade Glycyrrhiza uralensis residues（GUR）and to optimize the production process of cellulase by the strains. First，the strains were screened from decayed Glycyrrhiza uralensis and soil，and then were identified through morphological observation and 18S rDNA. Second，the effects of different factors on the fermentation of the isolated strains were studied，and the orthogonal test L9（34）was used to determine the optimal condition of producing enzyme. The produced cellulase complex was used to investigate how the enzymatic hydrolysis of GUR was proceeding. According to the results，the isolated strain was identified as Penicillium oxalicum，designated as G2. The effects of concentrations of herb residues and fermentation time on cellulase production of G2 were significant（P＜0.05 and P＜0.05）. Under the optimal conditions，the FPase activity reached 3.43 U/mL and EG activity reached 16.89 U/mL. Compared with commercial cellulase，the cellulase by G2 was more efficient in degrading GUR. In addition，the extraction rate of total flavonoids from Glycyrrhiza uralensis Fisch was significantly higher after enzymatic hydrolysis. Here screening the GUR-degrading bacteria and studying the process of producing the enzyme from the GUR laid the foundation for the rational utilization of GUR and the production of cellulase with low cost and fine performance.

Glycyrrhiza uralensis residues；cellulase；Penicillium oxalicum

2017-02-22

江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK20161048），江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心第三批重點(diǎn)項(xiàng)目（ZDXM-3-17），江蘇省產(chǎn)學(xué)研前瞻性聯(lián)合研究項(xiàng)目（BY2015008-04）

曾飛，男，碩士研究生，研究方向：中藥資源化學(xué)；E-mail：zoucungao@sina.com

段金廒，教授，研究方向：中藥資源化學(xué)；E-mail：dja@njucm.edu.cn

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0419

（責(zé)任編輯 李楠）