聚乙二醇沉淀蛋清蛋白質(zhì)的規(guī)律及在卵白蛋白分離中的應(yīng)用

聞崇煒，趙燁清，石 莉，歐陽(yáng)臻

（江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

聚乙二醇沉淀蛋清蛋白質(zhì)的規(guī)律及在卵白蛋白分離中的應(yīng)用

聞崇煒，趙燁清，石 莉，歐陽(yáng)臻

（江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

研究3 種pH值條件下4 種聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）對(duì)卵白蛋白（ovalbumin，OVA）、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白（ovotransferrin，OVT）與溶菌酶（lysozyme，LYZ）的沉淀效率，根據(jù)變化規(guī)律建立無(wú)需后續(xù)脫鹽的OVA分離新工藝。結(jié)果表明：PEG 4000、6000、8000及10000均可有效沉淀OVA、OVT及LYZ，沉淀率受PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)及pH值影響。其中pH 7.5、PEG 4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%時(shí)，OVA、OVT及LYZ的沉淀率相差最大，當(dāng)pH值從7.5調(diào)至5.5時(shí)，3 種蛋白質(zhì)沉淀率的變化幅度相差也最大。由此建立如下分離工藝：首先向pH 7.5的蛋清液中加PEG 4000至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，離心收集上清液，即得純度88.1%的OVA，提取率為95.1%；再將所得上清液pH值調(diào)至5.5，離心收集上清液，所得OVA純度提高至99.7%，提取率為87.3%。該工藝簡(jiǎn)便易行，有利于OVA的大規(guī)模制備及在食品及醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。

聚乙二醇沉淀；相對(duì)分子質(zhì)量；卵白蛋白；卵轉(zhuǎn)鐵蛋白；溶菌酶

雞蛋含有多種活性蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)在食品及醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛用途[1]。例如，占蛋清總蛋白質(zhì)含量54%的卵白蛋白（ovalbumin，OVA），既可提供各種人體必需氨基酸，還可與Fe3+反應(yīng)形成復(fù)合物，用于制備新型補(bǔ)鐵劑[2]，也可經(jīng)胰凝乳蛋白酶等處理后獲得血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽、抗氧化肽等生物活性肽[3-6]；占12%的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白（ovotransferrin，OVT），具有與人轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白相似的抗菌、抗病毒和抗真菌活性，有望開(kāi)發(fā)為新型免疫功能因子或化療藥物的載體[7-8]；占3.5%的溶菌酶（lysozyme，LYZ）可以破壞微生物細(xì)胞壁N-乙酰氨基葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的β-1,4糖苷鍵，可作為肉及海鮮等食品的天然防腐劑或用于生產(chǎn)母乳化乳粉以提高嬰幼兒的免疫力[9-11]。

這些蛋白質(zhì)目前主要采用鹽析法、離子交換法進(jìn)行制備。傅冰等[12-13]對(duì)鹽析法與離子交換法制備高純度OVA與OVT的工藝進(jìn)行了優(yōu)化研究；趙哲勛[14]與張文會(huì)[15]等對(duì)鹽析法與離子交換法制備LYZ的工藝進(jìn)行了優(yōu)化研究。此外，郅文波等[16]研究了以高速逆流色譜法制備OVA的工藝。Croguennec等[17]研究了利用兩步層析法制備OVT的工藝。膜分離在蛋白質(zhì)分離純化中有廣闊的應(yīng)用[18]。Wan Yinhua[19]與Datta等[20]研究了用超濾法分離LYZ及OVA的工藝。為了提高雞蛋利用率，Roy[21]、Guérin-Dubiard[22]與麻小娟[23]等還研究了OVA、OVT及LYZ的綜合分離工藝。然而上述工藝通常需要貴重設(shè)備，所得產(chǎn)物還需要后續(xù)脫鹽處理。

聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）是一種非離子型直鏈大分子聚合物，具有很強(qiáng)的親水性，因而可以破壞水化層使蛋白質(zhì)分子發(fā)生脫水，同時(shí)通過(guò)空間排斥作用擠壓及依靠鏈長(zhǎng)纏繞蛋白質(zhì)分子而使其發(fā)生沉淀。PEG沉淀法操作簡(jiǎn)便、易于放大、條件溫和，所得蛋白質(zhì)無(wú)需脫鹽，且不變性，現(xiàn)已備受關(guān)注[24]。鄭明奇[25]、余武英[26]與Fontes[27]等分別用PEG沉淀法制得了棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)中腸及脂肪體微粒體蛋白、豬胰蛋白酶與牛輪狀病毒。此外，該法還廣泛用于純化重組抗體[28-31]。Geng Fang等[32]也嘗試了以PEG法處理pH 6.0的雞蛋清，但還需結(jié)合離子交換法才能制得多種活性蛋白質(zhì)，分離工藝尚不夠簡(jiǎn)便。鑒于目前對(duì)PEG法沉淀OVA、OVT、LYZ的規(guī)律鮮見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)因此進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并據(jù)此建立了簡(jiǎn)便的OVA分離工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞蛋 江蘇大學(xué)愷源旅游超市；PEG 4000、6000、10000、丙烯酰胺、N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、甘氨酸、過(guò)硫酸銨（均為分析純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PEG 8000、OVA標(biāo)準(zhǔn)品（ovalbumin flake from egg white，BR級(jí)） 上海生工生物工程有限公司；N,N,N’,N’-四甲基乙二胺 美國(guó)Amresco公司；巰基乙醇 加拿大Bio Basic公司；蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品 日本Takara公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Micro Pico17微量臺(tái)式離心機(jī) 美國(guó)Thermo Scientific公司；Biofuge Stratos臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)美國(guó)Kendro（原Heraeus）公司；FE20型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)瑞士Mettler Toledo公司；TE601-L型電子天平 德國(guó)Sartorius公司；Mini-Protean3型電泳槽 美國(guó)Bio-Rad公司；DYY-6C型穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀 南京馳順科技發(fā)展有限公司；RCT basic加熱型磁力攪拌器 德國(guó)IKA公司；LC 1200液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；Avatar-370型傅立葉變換紅外光譜儀 美國(guó)Nicolet公司；J-815型圓二色譜（circular dichroism，CD）儀 日本Jasco公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋清液與PEG貯存液制備

手工方式分離足量雞蛋清，兩倍體積ddH2O稀釋，低速攪拌均勻，隨后在攪拌中調(diào)節(jié)蛋清液至預(yù)設(shè)pH值（7.5、6.5及5.5），-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

精密稱取適量PEG，加入等質(zhì)量ddH2O，攪拌至PEG充分溶解，即得質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%的PEG貯存液，貯存液至少靜置1 d后再用于PEG沉淀。準(zhǔn)備PEG 4000、6000、8000、10000共4 種貯存液。

1.3.2 PEG沉淀

取凍存蛋清液，化凍后以9 600×g離心20 min，稱取澄清的上清液，攪拌中滴加PEG貯存液至預(yù)設(shè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，取適量樣品以9 600×g離心20 min，分別收集上清液與沉淀，待后續(xù)檢測(cè)。

1.3.3 蛋白質(zhì)電泳

將1.3.2節(jié)所得沉淀及上清液分別加適量ddH2O溶解，取少量溶解液加等體積2×上樣緩沖液，沸水浴處理15 min。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electropheresis，PAGE）按Laemmli法[33]所述操作，12%分離膠、5%濃縮膠，70 V恒壓進(jìn)行電泳，待溴酚藍(lán)指示條帶到達(dá)分離膠底部后終止電泳，剝下凝膠，考馬斯亮藍(lán)R250染色。

1.3.4 蛋白質(zhì)沉淀率及純度分析

根據(jù)樣品中蛋白質(zhì)含量與SDS-PAGE后凝膠對(duì)應(yīng)條帶灰度值呈線性相關(guān)的原理進(jìn)行計(jì)算[34]。采集SDS-PAGE圖像，以Quantity One軟件定量各條帶灰度值，按公式（1）、（2）計(jì)算各樣品中各蛋白質(zhì)的沉淀率（PR）及純度（PU）。

式中：PGPRO代表沉淀中待測(cè)蛋白質(zhì)灰度值；EGPRO代表蛋清中待測(cè)蛋白質(zhì)灰度值；NP與NE分別代表沉淀及蛋清稀釋倍數(shù)；SGPRO代表樣品中待測(cè)蛋白質(zhì)灰度值；SGALL代表沉淀中所有蛋白質(zhì)總灰度值。

1.3.5 PEG沉淀法制備OVA

稱取澄清的pH 7.5蛋清液，攪拌中加PEG 4000貯存液至終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，9 600×g離心20 min，收集得上清液Ⅰ；將上清液Ⅰ的pH值再調(diào)至5.5，9 600×g離心20 min，收集得上清液Ⅱ。上清液Ⅰ、Ⅱ適當(dāng)留樣，備檢測(cè)OVA含量及純度。

1.3.6 高效液相色譜測(cè)定

采用LC 1200液相色譜儀，色譜柱為Eclipse Plus C18（100 mm×4.6 mm），流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B：0.1%甲酸的乙腈溶液，OVA樣品及標(biāo)準(zhǔn)品用B液溶解，0.45 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。流速：1.0 mL/min（0～5 min 10% B液；7～17 min 30% B液；19～29 min 50% B液），柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL，樣品質(zhì)量濃度為10 mg/mL，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。同時(shí)再取OVA對(duì)照品及樣品各一份，溶解后分別加巰基乙醇至終體積分?jǐn)?shù)為10%，混勻后室溫放置2 h，加適量乙腈及甲酸至高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）初始濃度，13 000 r/min離心15 min，取上清液按上述檢測(cè)條件進(jìn)行HPLC分析。

1.3.7 傅里葉變換紅外光譜測(cè)定

采用Avatar-370型傅里葉變換紅外光譜儀，將凍干樣品（約2 mg）與KBr（200 mg）充分混勻、壓片，置于傅里葉變換紅外光譜儀的變溫附件中于4 000～400 cm-1范圍內(nèi)掃描。

1.3.8 CD測(cè)定

采用J-815型CD儀檢測(cè)分析樣品二級(jí)結(jié)構(gòu)。取OVA凍干品粉末，溶于ddH2O中，比色池光徑0.1 cm，遠(yuǎn)紫外區(qū)（190～250 nm）掃描，譜帶寬度1.0 nm，掃描速率100 nm/min，連續(xù)掃描3 次取平均值。用平均摩爾橢圓率表示CD數(shù)據(jù)，單位為deg?cm2/dmol。通過(guò)K2D軟件計(jì)算各二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。

1.3.9 PEG質(zhì)量濃度測(cè)定

依據(jù)PEG可與鋇離子和碘離子形成有色復(fù)合物的原理，按《中國(guó)藥典》所述以比色法測(cè)定樣品中PEG含量[35]?；玖鞒倘缦拢壕芰咳悠啡芤? mL（蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度不高于1 g/100 mL），加入0.5 mol/L高氯酸溶液5.0 mL，混勻，室溫放置15 min，4 000 r/min離心10 min；取上清液4 mL，加入氯化鋇溶液1.0 mL和0.1 mol/L碘溶液0.5 mL，混勻，室溫反應(yīng)15 min；535 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以ddH2O代替樣品溶液，同法操作作為空白對(duì)照組；精密配制10～50 μg/mL PEG 4000標(biāo)準(zhǔn)品溶液，同法操作，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度對(duì)吸光度作回歸直線。將樣品溶液吸光度代入，計(jì)算其中PEG的質(zhì)量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用GraphPad Prism 6進(jìn)行作圖分析，選擇Two-way ANOVA采用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG法沉淀OVA

圖1 4 種PEG處理pH 7.5、6.5、5.5蛋清液時(shí)OVA沉淀率Fig. 1 Precipitation rates of OVA with four PEG fractions at different pH levels

按1.3.2節(jié)所述，取多份澄清的pH 7.5、6.5、5.5蛋清液，100 r/min低速攪拌中分別緩慢滴加PEG 4000貯存液至預(yù)設(shè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，離心收集各樣品的上清液與沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE并計(jì)算OVA的沉淀率。結(jié)果表明：無(wú)論何種pH值的蛋清液，PEG 4000均可有效沉淀其中的OVA；OVA沉淀率隨PEG 4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)的遞增而逐步上升，當(dāng)其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9%～24%時(shí)，OVA沉淀率最低為1.8%，最高達(dá)94.8%；同時(shí)，以相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG 4000處理3 種蛋清液，結(jié)果表明pH 5.5樣品中OVA沉淀率最高，pH 6.5樣品中次之，pH 7.5樣品中最低（圖1A）。繼續(xù)用PEG 6000、8000、10000分別處理上述3 種蛋清液，結(jié)果也表明，無(wú)論何種pH值的蛋清液，這3 種PEG均可以有效沉淀其中的OVA；OVA沉淀率均隨PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的遞增而逐步上升；同時(shí)相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG，總體在pH 5.5蛋清液中OVA沉淀率最高，pH 7.5蛋清液中最低，這一結(jié)果可能與OVA的等電點(diǎn)為4.5有關(guān)（圖1B～D）。

此外，PEG 10000 OVA的沉淀率總體高于相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG 8000、6000、4000（圖1），這是因?yàn)镻EG相對(duì)分子質(zhì)量越大，即鏈越長(zhǎng)，越有利于發(fā)揮PEG分子的脫水、纏繞及空間排斥作用，從而越有利于沉淀OVA。分析OVA沉淀率的變化趨勢(shì)還可看出，PEG 4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，蛋清液pH值為7.5時(shí)，OVA沉淀率較低，即上清液中可保留較多OVA；此時(shí)，蛋清液pH值調(diào)至5.5，沉淀率增幅（7.9%）也較低，上清液中因pH值變化損失的OVA也最少。

2.2 PEG法沉淀OVT

按2.1節(jié)所述，以PEG 4000、6000、8000、10000處理pH 7.5、6.5、5.5蛋清液，計(jì)算并分析OVT沉淀率。結(jié)果表明，4 種PEG均可以有效沉淀3 種蛋清液中的OVT，OVT沉淀率均隨PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的遞增而快速上升，直至OVT被完全沉淀；當(dāng)PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)相同時(shí)，pH值越低的蛋清液中OVT沉淀率越高；此外，當(dāng)?shù)扒逡簆H值相同且所加PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)相同時(shí)，OVT沉淀率隨PEG相對(duì)分子質(zhì)量增加而升高，直至被完全沉淀（圖2）。

圖2 4 種PEG處理pH 7.5、6.5、5.5蛋清液時(shí)OVT沉淀率Fig. 2 Precipitation rates of OVT with different PEG fractions at different pH levels

圖1、2對(duì)比分析可知，同一相對(duì)分子質(zhì)量PEG以相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)處理相同pH值的蛋清液，OVT沉淀率均高于OVA，即相同條件下，OVT比OVA更易發(fā)生沉淀，尤其PEG 4000處理時(shí)差異高度顯著。其中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的PEG 4000處理pH 7.5蛋清液時(shí)，OVA、OVT的沉淀率分別為1.8%、54.6%（P＜0.001），同樣處理pH 5.5蛋清液，OVA、OVT的沉淀率分別為9.7%、98.1%（P＜0.001）。對(duì)比分析圖1、2還可知，同一相對(duì)分子質(zhì)量PEG以相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)處理不同pH值的蛋清液，OVT沉淀率的變化幅度顯著高于OVA，因此PEG法處理蛋清液后再調(diào)節(jié)其pH值，OVT比OVA更容易發(fā)生沉淀。其中，PEG 4000處理pH 7.5蛋清液至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%后再調(diào)節(jié)pH值至5.5后，OVA、OVT的沉淀率增幅分別為7.9%（P＜0.001）、43.5%（P＜0.001）。

2.3 PEG法沉淀LYZ

圖3 4 種PEG處理pH 7.5、6.5、5.5蛋清液時(shí)LYZ沉淀率Fig. 3 Precipitation rates of LYZ with different PEG fractions at different pH levels

按2.1節(jié)所述，以PEG 4000、6000、8000、10000分別處理pH 7.5、6.5、5.5蛋清液，計(jì)算并分析LYZ沉淀率。結(jié)果表明，PEG沉淀LYZ具有與OVT相似的規(guī)律，即4 種PEG均可以有效沉淀3 種蛋清液中的LYZ，LYZ沉淀率均隨PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的遞增而快速上升，直至LYZ被完全沉淀；當(dāng)PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)相同時(shí)，pH值越低的蛋清液中LYZ沉淀率越高；此外，當(dāng)?shù)扒逡簆H值相同且所加PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)相同時(shí)，LYZ沉淀率隨PEG相對(duì)分子質(zhì)量增加而升高，直至被完全沉淀（圖3）。

對(duì)比分析圖1、3可知，同一相對(duì)分子質(zhì)量PEG以相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)處理相同pH值的蛋清液，LYZ沉淀率均高于OVA，即相同條件下，LYZ比OVA更易發(fā)生沉淀，尤其PEG 4000處理時(shí)差異高度顯著。其中，PEG 4000處理pH 7.5蛋清液至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%時(shí)，OVA、LYZ的沉淀率分別為1.8%、68.3%（P＜0.001），同樣處理pH 5.5蛋清液，OVA、LYZ的沉淀率分別為9.7%、90.2%（P＜0.001）。對(duì)比分析圖1、3還可知，同一種PEG以相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)處理不同pH值的蛋清液，LYZ沉淀率變化幅度顯著高于OVA，因此PEG法處理蛋清液后再調(diào)節(jié)其pH值，LYZ比OVA更容易發(fā)生沉淀。其中，PEG 4000處理pH 7.5蛋清液至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%后再調(diào)節(jié)pH值至5.5后，OVA、LYZ的沉淀率增幅分別為7.9%（P＜0.001）、21.9%（P＜0.001）。2.4 PEG法制備OVA

綜上所述，4 種PEG在3 種pH值的蛋清液中均可有效沉淀OVA、OVT及LYZ。PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，脫水及排斥作用越強(qiáng)，沉淀效率越高；高相對(duì)分子質(zhì)量的PEG具有更長(zhǎng)直鏈，纏繞作用更強(qiáng)，沉淀效率高于相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的低相對(duì)分子質(zhì)量PEG；同時(shí)pH值可通過(guò)改變蛋白質(zhì)分子表面電荷而影響其沉淀率。以蛋清蛋白質(zhì)而言，OVT及LYZ比OVA更容易被PEG沉淀，鑒于以質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的PEG 4000處理pH 7.5蛋清液時(shí)，OVA、OVT及LYZ的沉淀率差異最大，當(dāng)相應(yīng)蛋清液pH值調(diào)至5.5時(shí)，OVA、OVT及LYZ沉淀率的變化幅度差異也最大，由此設(shè)計(jì)如下分離工藝。

圖4 OVA樣品的SDS-PAGE結(jié)果Fig. 4 SDS-PAGE pattern of OVA

圖6 還原OVA樣品的HPLC分析結(jié)果Fig. 6 HPLC prof i le of reduced OVA

圖7 OVA樣品的傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果Fig. 7 Fourier transform infrared spectra of OVA

圖8 OVA樣品的CD分析結(jié)果Fig. 8 CD spectrum of OVA

結(jié)果表明，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的PEG 4000處理pH 7.5蛋清液，可以沉淀絕大多數(shù)OVT及LYZ，大部分OVA被保留在上清液中，所得上清液Ⅰ樣品中OVA純度為88.1%，提取率為95.1%；再將上清液Ⅰ的pH值調(diào)至5.5，可以進(jìn)一步除去OVT及LYZ，同時(shí)只沉淀?yè)p失少量OVA，所得上清液Ⅱ樣品中OVA純度為99.7%，提取率為87.3%。SDS-PAGE檢測(cè)表明所得上清液Ⅰ、Ⅱ樣品中OVA純度遠(yuǎn)高于BR級(jí)OVA標(biāo)準(zhǔn)品（圖4）。HPLC檢測(cè)表明，OVA樣品中主峰O的保留時(shí)間為7.959 min，與標(biāo)準(zhǔn)品主峰保留時(shí)間基本一致。此外，標(biāo)準(zhǔn)品主峰中可見(jiàn)肩峰，樣品中未見(jiàn)相應(yīng)肩峰，表明樣品純度高于目前BR級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品（圖5）。以巰基乙醇還原OVA樣品及標(biāo)準(zhǔn)品后再進(jìn)行HPLC檢測(cè)，可見(jiàn)原主峰O均消失，出現(xiàn)保留時(shí)間2.808 min附近的新主峰O’（圖6）。收集HPLC樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，表明樣品主峰O及新主峰O’均為OVA，另外兩個(gè)峰為殘留的少量OVT及LYZ等蛋白質(zhì)。紅外吸收光譜圖中可見(jiàn)樣品吸收峰（3 411、2 245、1 635、1 551 cm-1等）及峰型均與OVA標(biāo)準(zhǔn)品相吻合（圖7）。CD檢測(cè)表明OVA樣品在222、208 nm波長(zhǎng)處有兩個(gè)負(fù)峰，195 nm波長(zhǎng)處有一個(gè)正峰（圖8），軟件分析表明α-螺旋比例為28.8%，β-折疊比例為19.1%。此外，比色法測(cè)定表明1 mg精制OVA樣品中PEG 4000的殘留量為20.36 μg，97.32%的PEG 4000都隨OVT及LYZ進(jìn)入黏稠的沉淀中。因?yàn)镻EG 4000具有良好的生物安全性，因此PEG的微量殘留不會(huì)影響所得OVA在食品工業(yè)中的應(yīng)用。

3 討 論

我國(guó)早已成為世界上第一雞蛋生產(chǎn)大國(guó)，由于雞蛋深加工水平仍然不高，蛋清源活性蛋白質(zhì)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用仍有諸多不足。OVA具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，又具有良好的起泡性、膠凝性、持水性等功能特性，是食品加工中重要的原輔料。目前雖然已有多項(xiàng)研究以改進(jìn)鹽析法、等電點(diǎn)沉淀法、離子交換法、超濾法等常用的OVA制備工藝，但因?yàn)樵O(shè)備貴重、產(chǎn)物通常仍需脫鹽而影響了推廣。

本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)研究了4 種PEG在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)及不同pH值時(shí)對(duì)OVA、OVT及LYZ沉淀率的影響，并根據(jù)PEG 4000處理pH 7.5與pH 5.5的蛋清液時(shí)，OVA、OVT及LYZ的沉淀率及沉淀率變化幅度的差異建立了新的OVA分離工藝：即首先以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的PEG 4000處理pH 7.5蛋清液獲得純度為88.1%的OVA，再調(diào)節(jié)樣品的pH值至5.5后獲得純度為99.7%的OVA。該工藝僅需適量PEG沉淀及適當(dāng)調(diào)節(jié)樣品pH值，操作非常簡(jiǎn)便、無(wú)需貴重設(shè)備、易于放大，同時(shí)產(chǎn)物無(wú)需脫鹽、具有很高的生物安全性，為OVA在食品工業(yè)的應(yīng)用提供了便利。本研究所得PEG沉淀規(guī)律還為后續(xù)建立以該法為基礎(chǔ)的綜合分離利用蛋清源活性蛋白質(zhì)的工藝提供了理論依據(jù)。

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Protein Precipitation from Egg White with Polyethylene Glycol and Its Application for Ovalbumin Separation

WEN Chongwei, ZHAO Yeqing, SHI Li, OUYANG Zhen
(School of Pharmacy, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

This work was carried out to investigate the effect of polyethylene glycol (PEG) molecular weight, PEG dosage and pH value of egg white on the precipitation rate of ovalbumin (OVA), ovotransferrin (OVT) and lysozyme (LYZ), and further to establish a new procedure for the separation of OVA from egg white. It was found that OVA, OVT and LYZ could be precipitated by PEG 4000, 6000, 8000 or 10000. In addition, the precipitation rate of OVA, OVT and LYZ was signif i cantly inf l uenced by PEG dosage and pH. By addition of 12% PEG and at pH 7.5, the maximum difference between the precipitation rates of OVA, OVT and LYZ was observed. This result was also obtained when pH was adjusted to 5.5.Therefore, OVA could be produced by the following procedure. PEG 4000 was added into egg white (pH 7.5) until its concentration reached 12%, and then the supernatant was collected after centrifugation as OVA with a recovery of 95.1%and a purity of 88.1%. The purity was increased to 99.7%, while the recovery was decreased to 87.3% by adjusting the pH to 5.5 and collecting centrifugal supernatant. This purif i cation procedure was simple and easy to operate and could facilitate large-scale production and application of OVA in food and medicinal fi elds.

polyethylene glycol precipitation; relative molecular weight; ovalbumin; ovotransferrin; lysozyme

10.7506/spkx1002-6630-201801004

TS253.4；Q503

A

1002-6630（2018）01-0029-07

聞崇煒, 趙燁清, 石莉, 等. 聚乙二醇沉淀蛋清蛋白質(zhì)的規(guī)律及在卵白蛋白分離中的應(yīng)用[J]. 食品科學(xué), 2018, 39(1):29-35.

10.7506/spkx1002-6630-201801004. http://www.spkx.net.cn

WEN Chongwei, ZHAO Yeqing, SHI Li, et al. Protein precipitation from egg white with polyethylene glycol and its application for ovalbumin separation[J]. Food Science, 2018, 39(1): 29-35. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201801004. http://www.spkx.net.cn

2016-10-05

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81573529）；江蘇省普通高校研究生實(shí)踐創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（SJLX15_0512）

聞崇煒（1971—），男，副教授，博士，主要從事生物活性蛋白質(zhì)分離及功能研究。E-mail：wenchw@ujs.edu.cn