嬰幼兒配方奶粉中核苷酸含量測定

文/苑向杰 李則均＊

（黑龍江省完達山乳品股份有限公司）

嬰幼兒配方奶粉中核苷酸含量測定

文/苑向杰 李則均＊

（黑龍江省完達山乳品股份有限公司）

以 GB 5413.40-2016《食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中核苷酸的測定》為參考，采用SUPELCO LC-18-T液相色譜柱測定核苷酸。試驗調(diào)整了流動相比例，在檢測波長為254 nm時，核苷酸5 個組分目標峰與配方奶粉中雜質(zhì)完全分開，分離效果良好。5 種核苷酸濃度在1.00～10.00 μg/mL范圍內(nèi)與其目標峰面積呈良好的線性關(guān)系（R2≥0.99）。通過試驗重現(xiàn)性和回收率試驗等數(shù)據(jù)證明本方法穩(wěn)定可靠，前處理操作簡單，適合嬰幼兒配方奶粉廠家推廣使用。

嬰幼兒配方奶粉；核苷酸；高效液相色譜-紫外檢測法

核苷酸是一類由嘌呤堿或嘧啶堿、核糖或脫氧核糖以及磷酸三種物質(zhì)組成的化合物。核苷酸具有許多重要生物學功能，是生物體內(nèi)重要的低分子化合物。母乳中核苷酸含量很高，為72 mg/L。嬰幼兒配方奶粉中添加核苷酸能維持嬰兒正常腸道功能，減少腹瀉，提高免疫力等。核苷酸的測定方法主要包括質(zhì)譜法、色譜質(zhì)譜法、毛細管電泳-質(zhì)譜法等，本文采用高效液相色譜法。主要測定游離核苷酸總量，包括胞嘧啶核苷酸（CMP）、尿嘧啶核苷酸（UMP）、次黃嘌呤核苷酸（IMP）、鳥嘌呤核苷酸（GMP）、腺嘌呤核苷酸（AMP）。本方法樣品前處理簡便快速，有效減少核苷酸損失，采用SUPELCO LC-18-T色譜柱進行分離，5 種組分分離徹底，基線穩(wěn)定。

1 材料方法

1.1 儀器與藥品標準品

1.1.1 儀器

高效液相色譜：配UV/VIS紫外檢測器，美國PE生產(chǎn)；

數(shù)控超聲波清洗器：K Q-1000DB，昆山市超聲儀器有限公司；

pH計：MP220，METTLER TOLEDO生產(chǎn)；

渦旋振蕩器：GENIUS 3，IKA VORTEX生產(chǎn)。

1.1.2 藥品

超純水：Millipore純水機制備；

冰乙酸：科密歐生產(chǎn)，分析純，100 mL/L；

四丁基硫酸氫銨：CNW生產(chǎn)，色譜純；

甲醇：DiKMA生產(chǎn)，色譜純；

磷酸氫二鉀：科密歐生產(chǎn)，分析純，0.1 mol/L；

磷酸：科密歐生產(chǎn)，分析純；

磷酸鹽緩沖溶液（1.40 mol/L四丁基硫酸氫銨，0.01 mol/L磷酸二氫鉀）：稱取1.360 g磷酸二氫鉀，加 0.4753 g四丁基硫酸氫銨，用900 mL水溶解，用磷酸氫二鉀調(diào)pH值至3.2，加水定容至1 000 mL，一周內(nèi)使用。

1.1.3 核苷酸標準品及配制

胞嘧啶核苷酸（CMP）、腺嘌呤核苷酸（AMP）、尿嘧啶核苷酸（UMP）、鳥嘌呤核苷酸（GMP）純度、次黃嘌呤核苷酸（IMP），純度≥99%，SIGMA生產(chǎn)。

標準液配制：分別稱取核苷酸標準品CMP、AMP、UMP、GMP和IMP各10 mg，用超純水溶解并定容至100 mL容量瓶中。校正各組分水分和鈉鹽含量，以酸型計，各組分折算系數(shù)見表1。

1.2 預(yù)處理方法

稱取不含淀粉的嬰幼兒配方奶粉5.0000 g，加入20 mL熱水（50～60 ℃）充分溶解，冷卻至室溫，用醋酸溶液調(diào)節(jié)試樣pH值為4.1，移入50 mL容量瓶定容，12.5 cm定量濾紙過濾，所得濾液用0.45 μm微孔過濾備用。

表1 核苷酸校正水分和鈉鹽含量折算系數(shù)

1.3 分離條件

色譜柱：SUPELCO LC-18-T，5 μm，250 mm×4.6 mm；

流動相：磷酸鹽緩沖液+甲醇=（1000+25）mL；

流速：1 mL/min；

進樣量：10 μL；

檢測波長：254 nm；

柱溫：25 ℃。

圖1-1 濃度為10 μg/ mL的CMP色譜圖

圖1-2 濃度為10 μg/ mL的AMP色譜圖

2 結(jié)果分析

2.1 嬰幼兒配方奶粉中核苷酸目標峰的確定

核苷酸檢測主要有5 個組分，分別為胞嘧啶核苷酸（CMP）、腺嘌呤核苷酸（AMP）、尿嘧啶核苷酸（UMP）、鳥嘌呤核苷酸（GMP）、次黃嘌呤核苷酸（IMP）。5 個單一組分標準品色譜圖見圖1-1～1-5，5 個組分混合標準液色譜圖見圖2。

通過分析圖1-1～1-5，各單一組分目標峰出峰時間分別為：CMP 3.608 min，AMP 13.100 min，UMP 14.948 min，GMP 18.603 min，IMP 23.036 min。圖2中可以看出，核苷酸混合標準液各組分目標峰相互間沒有試劑峰干擾，具有很好的相應(yīng)強度，分離效果明顯，基線穩(wěn)定。

圖3為嬰幼兒配方奶粉中核苷酸色譜圖，奶粉加標后可以確定，圖3中的5 個目標峰即為需要的色譜峰。嬰幼兒配方奶粉成分復(fù)雜，樣品預(yù)處理去除大量酪蛋白后，CMP、AMP、UMP、GMP、IMP 5 個組分目標峰分離徹底，靈敏度高，無干擾雜峰。

圖1-3 濃度為10 μg/ mL的UMP色譜圖

圖1-4 濃度為5 μg/ mL的GMP色譜圖

圖1-5 濃度為5 μg/ mL的IMP色譜圖

圖2 核苷酸5 個組分混合標準液色譜圖

圖3 嬰幼兒配方奶粉中核苷酸色譜圖

2.2 標準曲線

以核苷酸5 個組分標準工作液的濃度為橫坐標；CMP以不同濃度標準工作液注入高效液相色譜儀測定的對應(yīng)峰高為縱坐標，AMP、UMP、GMP、IMP以不同濃度標準工作液注入高效液相色譜儀測定的對應(yīng)峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。CMP不同濃度工作液與對應(yīng)峰高見表 2-1，標準曲線見圖 4-1。AMP、UMP、GMP、IMP不同濃度工作液與對應(yīng)峰面積分別見表 2-2、2-3、2-4、2-5，標準曲線分別見圖 4-2、4-3、4-4、4-5。

線性回歸方程：CMP為y=2 194.9002x+1 136.4789，R2＞0.9990；AMP為y=38 156.9941x+38 199.4274，R2＞0.9969；UMP為y =21 598.3549x+41 572.7569，R2＞0.9934；GMP為y=39 652.7318x+28 655.5717，R2＞0.9980；IMP為y=29 986.7124x+26 814.7275，R2＞0.9958。說明核苷酸5 個組分工作液濃度在1.00～10.00 μg/mL時，核苷酸5 個組分峰面積（其中CMP為峰高）與質(zhì)量濃度之間具有良好的線性關(guān)系。本方法定量限見表3。

2.3 方法的重現(xiàn)性與回收率

2.3.1 重現(xiàn)性

核苷酸5 個組分的測定疊加圖見圖5，樣本量為6，定量重復(fù)性見表4。從圖5和表4可以看出，采用此方法測定嬰幼兒配方奶粉中核苷酸含量，試驗重現(xiàn)性良好。

2.3.2 回收率試驗

由于本文核苷酸五個組分成分復(fù)雜，在奶粉試樣中添加已知量的被測組分，然后進行測定，檢查被加入的五個核苷酸組分能否定量回收。本文選取沒有添加過核苷酸的全脂奶粉做空白，根據(jù)核苷酸五組分曲線濃度范圍1.00～10.00μg/mL，加標回收試驗分別添加核苷酸五組分含量為10mg/100g、20mg/100g、30 mg/100 g的三組進行試驗，測得回收率結(jié)果見表5。

添加水平為10mg/100g時，加標回收率較低，平均值為89.3%；添加水平為20mg/100 g時，加標回收率平均值為91.9%；添加水平為30mg/100g的加標回收率較高，平均值為93.1%。核苷酸5 個組分易水解，這就增大了加標回收的測定難度，因此加標標準品要現(xiàn)用現(xiàn)配。結(jié)果顯示此方法加標回收效果良好。

表2-1 CMP標準工作液液濃度與對應(yīng)峰高

表2-2 AMP標準工作液液濃度與對應(yīng)峰面積

表2-3 UMP標準工作液液濃度與對應(yīng)峰面積

表2-4 GMP標準工作液液濃度與對應(yīng)峰面積

表2-5 IMP標準工作液液濃度與對應(yīng)峰面積

圖4-1 CMP標準曲線

圖4-2 AMP標準曲線

圖4-3 UMP標準曲線

圖4-4 GMP標準曲線

3 討論

核苷酸需要測定5 個組分（CMP、AMP、UMP、GMP、IMP），蛋白類成分特別容易分解，標準樣品要現(xiàn)用現(xiàn)配，測定時柱溫箱溫度要嚴格控制在20～25 ℃。每次測定的樣品數(shù)量不能過多，樣品預(yù)處理液在室溫存放6～8 個小時后就會逐漸分解，導致測定結(jié)果偏低，或無法檢測到全部組分。樣品預(yù)處理液要在8 個小時內(nèi)全部測定完畢。

圖4-5 IMP標準曲線

圖5 核苷酸的重復(fù)試驗疊加圖

表3 核苷酸5 個組分定量限

表4 嬰幼兒配方奶粉中核苷酸5 個組分定性定量重復(fù)性結(jié)果表

表5 核苷酸5 個組分回收率試驗

核苷酸組分復(fù)雜，對流動相有很高的要求，流動相的pH值和緩沖鹽含量都對分離效果起到?jīng)Q定性影響。流動相的pH值和緩沖鹽含量稍微變化都會導致CMP目標峰不能徹底分離。CMP含量占核苷酸總添加量的40%左右，是計算核苷酸總量是否合格的主要依據(jù)，CMP分離不徹底，或者數(shù)值偏低，直接導致產(chǎn)品核苷酸含量不合格。當CMP分離不徹底時，需要在線測定流動相的pH值，適當添加緩沖鹽或者稀磷酸，調(diào)節(jié)pH值到3.2，保證CMP充分分離。

本文依據(jù)GB 5413.40-2016《食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中核苷酸的測定》方法，采用高效液相色譜法測定嬰幼兒配方奶粉中核苷酸含量，通過多個廠家多個型號色譜柱的對比，選用SUPELCO LC-18-T型號色譜柱，核苷酸5 個組分分離效果明顯。本方法前處理操作簡單，定量準確，適合批量測定。

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Determination of Nucleotide Content in Infant Formula Milk Powder

YUAN Xiang-jie，LI Ze-jun＊
（Heilongjiang Wondersun Dairy Co.，Ltd）

Based on GB 5413.40-2016“National Food Safety Standards Determination of Nucleotide in Infant Food and Milk products”as the reference，SUPELCO LC-18-T liquid chromatographic was used to determine the nucleotide content. The proportion of mobile phase was adjusted. When the detection wavelength was 254 nm，the target peaks of fi ve components of nucleotide were completely separated from the impurities in the formula milk powder and the separation effect was good. Five nucleotide concentrations ranged from 1.00 to 10.0 μg/mL and its target area showed a good linear relationship（R2≥0.99）. The experimental reproducibility and recovery test data have showed that the method is stable and reliable. Pre-treatment operation is simple， suitable for infant formula manufacturers to promote the use.

infant formula milk powder；nucleotide；high performance liquid chromatography-UV determination

苑向杰（1980-），女，助理工程師，主要從事乳品檢測工作。

?通信作者：李則均（1983-），女，工程師，主要從事質(zhì)量分析工作。

2017-08-24）