芒果BCH基因的克隆與表達(dá)

陳景鋒+趙志常+高愛平+黃建峰+羅睿雄+劉寬亮+張夢云

摘要： β-胡蘿卜素羥化酶（BCH）基因是催化玉米黃素合成的關(guān)鍵基因，玉米黃素在植物光保護(hù)過程中發(fā)揮著重要的作用。采用RACE方法從黃色的金煌芒果的果皮中克隆得到了1個(gè)BCH基因，該基因全長cDNA序列為 1 160 bp，開放閱讀框?yàn)?88 bp，編碼295個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為32.97 ku，分子等電點(diǎn)為9.51。利用生物信息學(xué)在線分析軟件對(duì)其組成成分、疏水性/親水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、功能結(jié)構(gòu)域以及三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測和分析。通過系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的蛋白與溫州蜜柑、柚子、大豆、草莓等具有較近的親緣關(guān)系。對(duì)不同芒果品種的BCH基因的表達(dá)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，紅色的貴妃品種中表達(dá)量較高，而黃色的金煌品種中表達(dá)量較低。

關(guān)鍵詞： 芒果；β-胡蘿卜素羥化酶（BCH）基因；基因克?。换虮磉_(dá)分析；親緣關(guān)系

中圖分類號(hào)： Q785；S667.701 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）22-0024-03

β-胡蘿卜素羥化酶（β-carotene hydroxylase，BCH） 基因是催化玉米黃素合成的關(guān)鍵基因。目前，已經(jīng)報(bào)道了從擬南芥、甜橙、南豐蜜橘、甜椒等[1-5]植物中克隆到了該基因。由于BCH在類胡蘿卜素生物合成中的關(guān)鍵作用，已成為植物類胡蘿卜素遺傳工程改良中的主要目的基因。芒果類胡蘿卜素生物合成途徑中的 BCH基因分離和鑒定研究國內(nèi)外至今未見報(bào)道，BCH在芒果類胡蘿卜素生物合成途徑中具體作用和功能目前還不清楚。本研究中克隆并分析了芒果BCH基因，為進(jìn)一步研究BCH在芒果果實(shí)著色上的調(diào)控功能奠定分子基礎(chǔ)，對(duì)揭示 BCH基因在芒果類胡蘿卜素合成及果色形成中的作用具有重要理論意義，為進(jìn)一步創(chuàng)制高胡蘿卜素含量新種質(zhì)資源、開展芒果類胡蘿卜素品質(zhì)育種提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

分別用刀片切取桂七芒果完全成熟的綠果皮、金煌芒果完全成熟的黃色果皮、貴妃芒果完全成熟的紅色果皮，切碎放入采樣袋中液氮速凍后，立即放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 芒果果皮總RNA提取 采用植物RNA提取試劑盒提取芒果果皮總RNA，用DNase試劑盒進(jìn)行基因組DNA消除，RNase-free無菌水溶解，采用SMARTerTM RACE Amplification Kit（Clontech）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng) 擴(kuò)增條件為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 50 s，50 ℃ 50 s，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。 反應(yīng)體系為25 μL，其中含10×PCR buffer（含Mg2+） 2.5 μL、25 ng DNA模板、20 μmol引物、1.0 U Taq DNA聚合酶、5.0 mmol dNTPs。

1.3 BCH基因全長cDNA序列的獲得

以合成的 cDNA 為模板，根據(jù)已知的BCH基因片段設(shè)計(jì)cDNA 3′-RACE和5′-RACE引物，進(jìn)行3′和5′端的擴(kuò)增。將目的基因片段回收、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定及測序，并根據(jù)得到的cDNA 3′ 端和5′末端的序列結(jié)果拼接BCH的全長cDNA，設(shè)計(jì)特異引物，進(jìn)行全長cDNA序列的擴(kuò)增。

1.4 BCH基因生物信息學(xué)分析

根據(jù)BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）登錄的BCH蛋白序列進(jìn)行氨基酸序列的同源性分析，用DNAMAN軟件進(jìn)行序列多重比對(duì)，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹推斷其在進(jìn)化過程中親緣關(guān)系。采用bioedit軟件對(duì)BCH蛋白中各個(gè)氨基酸的含量、親水/疏水性進(jìn)行了分析。WoLFPSORT（http：//www.genscript.com/wolf-psort.html）軟件進(jìn)行定位預(yù)測，采用Swissmodel（http：//swissmodel.expasy.org/）蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.5 表達(dá)分析

分別提取桂七、金煌、貴妃芒果果皮的RNA，反轉(zhuǎn)為cDNA 并采用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RT-PCR的擴(kuò)增。RT-PCR分析采用的內(nèi)參引物序列為：actin-F，5′-AATGG AACTGGAATGGTCAAGGC-3′；actin-R，5′-TGCCAGATCT TCTCCATGTCATCCCA-3′。目的基因擴(kuò)增采用的引物為：BCH-F，5′ -CAGCATAGCCCATATAGCACTC-3′；BCH-R，5′-CAATGGAGCCGATATAAAACTAT-3′。PCR 產(chǎn)物在10%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，并采用Quantity One 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，作出相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 BCH基因的獲得

根據(jù)得到金煌芒果BCH基因的3′端和5′端序列信息進(jìn)行拼接，最后得到BCH基因的全長cDNA序列。設(shè)計(jì)特異引物，進(jìn)行全長cDNA序列擴(kuò)增，將電泳條帶回收測序后得到BCH基因的cDNA全長序列，為1160 bp，分析發(fā)現(xiàn)開放閱讀框?yàn)?888 bp，編碼295個(gè)氨基酸序列。通過NCBI上已經(jīng)登錄的擬南芥、柚子、大豆、葡萄的BCH蛋白序列進(jìn)行了比對(duì)（圖1），發(fā)現(xiàn)克隆的基因?yàn)锽CH基因。

2.2 部分生物信息學(xué)分析

采用bioedit軟件對(duì)芒果BCH蛋白中各個(gè)氨基酸的含量進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該蛋白丙氨酸（Ala）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）和纈氨酸（Val）的含量較高（圖2），用NCBI 上的CDD（conserved domain database，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）數(shù)據(jù)庫分析其氨基酸序列中可能有的蛋白功能結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明該蛋白有1個(gè)典型的FA-hydroxylase superfamily（脂肪酸羥化酶超家族） 保守結(jié)構(gòu)域（圖3）。對(duì)其蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)芒果BCH蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲和β-折疊為主，也具有少量的α-螺旋結(jié)構(gòu)（圖4）。采用bioedit軟件的Kyte 和Doolittle 算法對(duì)BCH蛋白的親水性/疏水性（正值表示疏水性，負(fù)值表示親水性）進(jìn)行分析，BCH蛋白所含的氨基酸主要介于2.4～-2.3之間（圖5），采用WoLFPSORT（http：//www.genscript.com/wolf-psort.html）軟件對(duì)BCH蛋白進(jìn)行定位預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該基因定位在葉綠體中，采用Swissmodel（http：//swissmodel.expasy.org/）在線軟件對(duì)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，推導(dǎo)出該蛋白可能的三級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)型（圖6）。采用DNAMAN軟件進(jìn)行親緣關(guān)系聚類分析發(fā)現(xiàn)，芒果BCH蛋白與溫州蜜柑、柚子、大豆等植物的蛋白序列聚為一類（圖7）。endprint

2.3 BCH基因的RT-PCR分析

分別提取桂七、金煌、貴妃這3種不同著色品種芒果果皮的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過上述RT-PCR分析的引物進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該基因在紅色品種貴妃的果實(shí)中表達(dá)較多，綠色品種的桂七果皮中次之，而黃色品種的金煌果皮中相對(duì)表達(dá)較少（圖8），初步推斷BCH基因可能與紅色品種的貴妃果實(shí)中的類胡蘿卜素合成有密切的關(guān)系。

3 討論

BCH是玉米黃素生物合成的重要基因，基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特征決定其基因的功能和性質(zhì)。通過對(duì)幾個(gè)物種的BCH蛋白的比對(duì)發(fā)現(xiàn)芒果BCH蛋白含有BCH蛋白家族相同的保守序列，即含有一個(gè)脂肪酸羥化酶超家族保守結(jié)構(gòu)域，前人通過對(duì)擬南芥、玉米、水仙等研究發(fā)現(xiàn)，也含有相同的保守結(jié)構(gòu)域，亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)該基因定位于葉綠體中[6]，這與本研究結(jié)果相一致。通過聚類分析表明，芒果BCH基因與柑橘類具有較近的親緣關(guān)系。對(duì)其表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，紅色的貴妃品種中表達(dá)量較高， 而黃色的金煌品種中表達(dá)量較低。孫化雨等對(duì)毛竹的根、幼莖、葉片、葉鞘、節(jié)等部分的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，BCH基因主要在葉片中表達(dá)，而根中表達(dá)量較少[7]；對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥分析發(fā)現(xiàn)，葉片中葉綠素、葉黃素、類胡蘿卜素等含量升高，表明在毛竹中BCH基因的過量表達(dá)促進(jìn)了類胡蘿卜素向玉米黃素轉(zhuǎn)化，使其含量增加，抗脅迫能力增加[8-9]。本研究從金煌芒果果皮中克隆得到了1個(gè)BCH基因，對(duì)該基因在芒果中的功能研究還須要進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證其功能及在對(duì)芒果果實(shí)色澤形成的作用機(jī)理，為深入理解芒果果實(shí)色澤形成多樣性的原因提供理論依據(jù)，并為生產(chǎn)中著色不良成因提供改善的技術(shù)支持。

[HS2][HT8.5H]參考文獻(xiàn)：

[1] Tian L，Magallanes-Lundback M，Musetti V，et al. Functional analysis of beta- and epsilon-ring carotenoid hydroxylases in Arabidopsis[J]. Plant Cell，2003，15（6）：1320-1332.

[2]Sun Z R，Gantt E，Cunningham F X. Cloning and functional analysis of the β-carotene hydroxylase of Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Biological Chemistry，1996，271（40）：24349-24352.

[3]徐昌杰，陳昆松，張上隆，等. 甜橙β-胡蘿卜素羥化酶cDNA克隆及其瞬間反義表達(dá)[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2003，11（6）：593-597.

[4]馮唐鍇，李思光，汪艷璐，等. 南豐蜜橘β-胡蘿卜素羥化酶基因的克隆和序列分析[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2007，27（2）：238-243.

[5]Wolfraim L A，Dhindsa R S. Cloning and sequencing of the cDNA for cas17，a cold acclimation-specific gene of alfalfa[J]. Plant Physiology，1993，103（2）：667-668.

[6]趙大球，曹春燕，孔 芬，等. 植物β-胡蘿卜素羥化酶的生物信息學(xué)分析[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2010（4）：116-121.

[7]孫化雨，陳 穎，趙韓生，等. 毛竹β-胡蘿卜素羥化酶基因的分子特征及其功能[J]. 林業(yè)科學(xué)，2015，51（10）：53-59.

[8]Kim J，Smith J J，Tian L，et al. The evolution and function of carotenoid hydroxylases in Arabidopsis[J]. Plant & Cell Physiology，2009，50（3）：463-479.

[9]Pons E，Alquézar B，Rodríguez A，et al. Metabolic engineering of β-carotene in orange fruit increases its in vivo，antioxidant properties[J]. Plant Biotechnology Journal，2014，12（1）：17-27.endprint