舌靜脈注射沒食子酸的慢性低灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及腦氧化應(yīng)激損傷相關(guān)指標(biāo)觀察

尚運(yùn)之，翟志永

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，沈陽 110014)

舌靜脈注射沒食子酸的慢性低灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及腦氧化應(yīng)激損傷相關(guān)指標(biāo)觀察

尚運(yùn)之，翟志永

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，沈陽 110014)

目的觀察舌靜脈注射沒食子酸(GA)的慢性低灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及腦氧化應(yīng)激損傷相關(guān)指標(biāo)變化。方法48只大鼠隨機(jī)分為4組各12只。A、B組大鼠制備慢性低灌注模型，A組在制模前后各5天舌靜脈注射100 mg/kg GA，B組給予等量生理鹽水；C、D組參照A組手術(shù)方法處理大鼠但不結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈，C組在手術(shù)前后各5天舌靜脈注射100 mg/kg GA，D組給予等量生理鹽水。比較各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力(逃避潛伏期、目標(biāo)象限所用時間百分比、游泳速度)及腦氧化應(yīng)激損傷相關(guān)指標(biāo)[超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、總硫醇(TT)]。結(jié)果與D組比較，B組第1～4天逃避潛伏期增加(P均<0.05)；與B組比較，A組第1～4天逃避潛伏期減少(P均<0.05)。與D組比較，B組目標(biāo)象限所用時間百分比減少(P均<0.05)；與B組比較，A、C組目標(biāo)象限所用時間百分比增加(P均<0.05)。與D組比較，B組SOD、GSH-Px、TT降低，MDA升高(P均<0.05)；與B組比較，A組和C組SOD、GSH-Px、TT升高，MDA降低(P均<0.05)。結(jié)論GA能改善慢性低灌注大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及修復(fù)腦氧化應(yīng)激損傷。

沒食子酸；慢性腦低灌注；學(xué)習(xí)記憶能力；氧化應(yīng)激

隨著我國人民生活水平的提高和生活方式的改變，高血脂、高血糖、高血壓疾病頻發(fā)，腦血管病的發(fā)病率及病死率也居高不下[1,2]。慢性腦低灌注狀態(tài)是血管性癡呆、阿爾茨侮默病(AD)、Binswanger病等多種腦血管疾病發(fā)展過程中的一個共同病理過程[3,4]。沒食子酸(GA)是一種很好的神經(jīng)保護(hù)劑[5]，具有羧基、羥基的芳香族化合物和可水解單寧的組成部分。GA廣泛存在于五倍子、茶葉、葡萄、葉下珠、石榴等植物中，具有抗氧化、清除自由基、抗癌、抗炎、抗真菌等多種作用，還可以用于治療糖尿病[6]。本研究觀察了舌靜脈注射GA的慢性低灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及腦氧化應(yīng)激損傷相關(guān)指標(biāo)變化，旨在為慢性腦低灌注所致的認(rèn)知功能障礙疾病的治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性Wistar大鼠48只，體質(zhì)量200～250 g，清潔級，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑及儀器 5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、GA購自Sigma-Aldrich公司，純度>95%；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)測定試劑盒購自上海信裕生物技術(shù)有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒由Randox Company提供；其余試劑都是使用分析純試劑，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。MD-100半自動生化測定儀購自上海益聯(lián)科教設(shè)備有限公司；UV2450-紫外分光光度計(jì)購自日本島津；大鼠Morris水迷宮及分析軟件購自上海多毅實(shí)業(yè)有限公司；Eppendorf 5424R低溫離心機(jī)購自德國Eppendorf。

1.3 GA給予方法及慢性低灌注模型制備 48只大鼠隨機(jī)分為A、B、C、D組各12只。A、B組參照文獻(xiàn)[7,8]方法(大鼠仰臥位固定，頸部常規(guī)消毒鋪巾后，在頸腹側(cè)正中切開皮膚，逐層剝離肌肉，暴露頸總動脈，小心分離伴行的迷走神經(jīng)，將雙側(cè)頸總動脈用雙重絲線結(jié)扎，縫合皮膚)制備慢性低灌注模型，A組在制模前后各5天舌靜脈注射100 mg/kg GA[9]，B組給予等量生理鹽水；C、D組參照A組手術(shù)方法處理大鼠但不結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈，C組在制模前后各5天舌靜脈注射100 mg/kg GA，D組給予等量生理鹽水。

1.4 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力評價(jià) 注射GA結(jié)束后次日(手術(shù)結(jié)束后第6天)，用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)來測定各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。Morris水迷宮由帶站臺的水池、自動攝像機(jī)及Morris水迷宮數(shù)據(jù)處理軟件三部分組成。在測試前將水和牛奶的混合物注入池中，水深30 cm(水面高出站臺表面1 cm，大鼠見不到站臺)，水溫(26±1)℃。實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求在隔音、光線偏暗的室內(nèi)，各次實(shí)驗(yàn)間相應(yīng)的條件保持不變。在實(shí)驗(yàn)前1 d，將每只大鼠頭部標(biāo)記，試驗(yàn)周期共4 d，前3 d為訓(xùn)練階段，第4天為測試階段。訓(xùn)練階段每天訓(xùn)練3次，入池位置分別為站臺所對及相鄰象限，將大鼠置于象限邊緣1/2弧度處，并且頭朝池壁入水，大鼠入水時攝像機(jī)開始記錄且Morris水迷宮數(shù)據(jù)處理軟件開始記錄及計(jì)算。①逃避潛伏期：記錄大鼠每次入水到游到站臺的時間(s)，如大鼠在120 s仍內(nèi)未找到站臺，可在第120 s時將其放置在站臺上，此時潛伏期記為120 s，大鼠到達(dá)站臺后，使其在站臺上停留15 s；②目標(biāo)象限所用時間百分比：在第4天的測試階段移除站臺，將大鼠從原站臺所對象限中面向池壁輕輕放入池中自由游泳60 s，記錄大鼠花費(fèi)在原站臺所在象限中的時間，并除以60 s，所得為目標(biāo)象限所占時間百分比；③游泳速度：記錄大鼠每次訓(xùn)練及測試時的游泳速度，并取平均值。數(shù)據(jù)采集及圖像分析均由圖像自動監(jiān)視和處理系統(tǒng)完成[10]。

1.5 大鼠腦氧化應(yīng)激損傷相關(guān)指標(biāo)檢測 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后第2天，各組大鼠斷頭取腦，分離腦皮層，制備出10%的組織勻漿液。ELISA法測定SOD活性及MDA含量，具體操作方法嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行測定。GSH-Px檢測采用比色法，嚴(yán)格按照GSH-Px試劑盒說明書測定?？偭虼?TT)使用DTNB作為還原劑測定。1 mL tris-EDTA(pH 8.6)緩沖溶液加入50 μL腦勻漿液中，然后定容在紫外分光光度412 nm測定。之后加入20 μL DTNB試劑(10 mmol/L溶液)加入到上述溶液15 min后再測定，然后根據(jù)他們的比值計(jì)算濃度[11]。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期比較 結(jié)果見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)第1～4天各組大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期比較

注：與D組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05。

2.2 各組大鼠Morris水迷宮目標(biāo)象限所用時間百分比及游泳速度比較 結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠Morris水迷宮目標(biāo)象限所用時間百分比及游泳速度比較

注：與D組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05。

2.3 各組大鼠腦皮層SOD、MDA、GSH-Px、TT水平比較 結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠腦皮層SOD、MDA、GSH-Px、TT水平比較

注：與D組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05。

3 討論

隨著多種新技術(shù)在神經(jīng)科臨床的應(yīng)用，臨床醫(yī)師對慢性低灌注狀態(tài)的研究得到越來越多的認(rèn)識和重視[12]。慢性低灌注是指由動脈狹窄所致腦組織血供長期低于生理閾值而出現(xiàn)慢性缺血性神經(jīng)系統(tǒng)功能損害的病理狀態(tài)，可能與腦白質(zhì)疏松、血管性癡呆、短暫性腦缺血發(fā)作、動脈硬化性腦梗死等發(fā)病有關(guān)[13～16]，大量臨床研究[17,18]也觀察到輕度認(rèn)知功能障礙、血管性癡呆(VD)、AD患者腦血流量減少，提示腦血流降低與神經(jīng)元凋亡、認(rèn)知障礙及癡呆的進(jìn)展密切相關(guān)。永久性結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動脈可導(dǎo)致其大腦慢性不完全性缺血，是目前最常用的VD動物模型[19]。多項(xiàng)研究[20,21]表明，在低灌注狀態(tài)下，認(rèn)知功能會發(fā)生減退，同時伴隨有腦部自由基代謝的紊亂，這也是低灌注對腦實(shí)質(zhì)和腦微血管系統(tǒng)造成損害的重要機(jī)制。當(dāng)慢性低灌注發(fā)生時，氧化應(yīng)激機(jī)制啟動，而氧化應(yīng)激已被廣泛研究證實(shí)是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞缺血性損傷的重要致病原因之一[1,22]。另外，活性氧物質(zhì)還可使線粒體產(chǎn)生氧化性病理損傷[23]。

GA是多種中藥及其復(fù)方制劑中重要的功效成分，廣泛存在于葡萄、茶葉、五倍子、刺云、實(shí)豆莢等植物中，其酯類化合物作為抗氧化劑被廣泛應(yīng)用于食品、制藥及輕工等行業(yè)。已有的研究發(fā)現(xiàn)，GA具有明顯抗腫瘤[24]、抗炎、抗病毒、抗真菌及心腦血管保護(hù)[25]和抗氧化[26]等藥理作用。有報(bào)道[23]顯示，大鼠雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎后有15個腦區(qū)的局部腦血流量降低25%～87%。本研究顯示，與D組比較，B組第1～4天逃避潛伏期增加；與B組比較，A組第1～4天逃避潛伏期減少。與D組比較，B組目標(biāo)象限所用時間百分比減少；與B組比較，A、C組目標(biāo)象限所用時間百分比增加。表明雖然處于慢性低灌注時，缺血缺氧狀態(tài)會對學(xué)習(xí)記憶功能產(chǎn)生持續(xù)作用，但GA可以使這種學(xué)習(xí)記憶功能下降的趨勢有所減弱，從而改善認(rèn)知功能。

在缺氧狀態(tài)下，具有抗氧化活性的物質(zhì)SOD、過氧化氫酶、GSH-Px等減少，過氧化脂質(zhì)產(chǎn)物MDA增加，外源性給予抗氧化酶或自由基清除劑，對缺血及再灌注心肌有明顯保護(hù)作用，因此MDA含量可間接反映氧自由基的產(chǎn)生與組織的損傷程度，而SOD活性與GSH-Px則可直接反映機(jī)體清除自由基和抗脂質(zhì)過氧化的能力[23，27]。本研究顯示，與D組比較，B組SOD、GSH-Px降低，MDA升高；與B組比較，A組和C組SOD、GSH-Px升高，MDA降低。說明GA對這些參與到氧化應(yīng)激反應(yīng)中酶促的相關(guān)因子都有一定的調(diào)節(jié)作用。另外，GA也能參與到非酶促的氧化應(yīng)激反應(yīng)中[6]。本研究還顯示，與D組比較，B組TT降低；與B組比較，A、C組TT升高。表明GA對非酶促的氧化應(yīng)激反應(yīng)也有積極的作用。但是我們的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，GA處理只能使大鼠經(jīng)手術(shù)后SOD、GSH-Px、MDA、TT恢復(fù)到機(jī)體內(nèi)的基礎(chǔ)水平，并不能通過GA的作用促使這些指標(biāo)水平超過大鼠機(jī)體基礎(chǔ)水平。因而我們的研究進(jìn)一步說明，GA并不能增加大鼠機(jī)體氧化應(yīng)激相關(guān)因子的基礎(chǔ)水平，只是在氧化應(yīng)激相關(guān)因子水平發(fā)生改變時才會做出相應(yīng)的改變。造成這一結(jié)果可能的推測是，機(jī)體內(nèi)可能存在一種反饋的機(jī)制，SOD、GSH-Px、MDA、TT超出基礎(chǔ)水平時，會產(chǎn)生其他的反應(yīng)途徑轉(zhuǎn)化這些氧化應(yīng)激相關(guān)的因子[28]。

總之，GA能改善慢性低灌注大鼠的認(rèn)知缺陷及修復(fù)腦氧化應(yīng)激損傷，GA對認(rèn)知與神經(jīng)保護(hù)作用的增強(qiáng)是與氧化應(yīng)激作用相關(guān)，但本實(shí)驗(yàn)未能直接證明GA如何與這些因子相互作用。由于慢性低灌注引起的損傷會產(chǎn)生一個復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)，其中會涉及到多種的信號通路，因此如何更進(jìn)一步的研究該機(jī)制，還需要從細(xì)胞水平、分子代謝及信號傳導(dǎo)通路等不同角度去挖掘，進(jìn)而為慢性低灌注所致的認(rèn)知功能障礙疾病的治療提供幫助。

[1] Safouris A, Hambye AS, Sculier C, et al. Chronic brain hypoperfusion due to multi-vessel extracranial atherosclerotic disease: a potentially reversible cause of cognitive impairment[J]. J Alzheimers Dis, 2015,43(1):23-27.

[2] 張建斌,李小慧.石榴汁對慢性腦低灌注大鼠認(rèn)知行為的影響及其作用機(jī)制研究[J].中國生化藥物雜志,2015,35(3):58-61.

[3] 賈寧,韓錕.EGCG改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠認(rèn)知功能及減輕海馬胰島素抵抗的機(jī)制研究[J].中國生化藥物雜志,2014,34(1):12-15.

[4] Salminen A, Jouhten P, Sarajarvi T, et al.Hypoxia and GABA shunt activation in the pathogenesis of Alzheimer′s disease[J].Neurochem Int, 2015,23(5):423-430.

[5] 謝曉艷,劉洪濤,張吉,等.沒食子酸體外抗氧化作用研究[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2011,36(3):319-322.

[6] 于艷華,卜麗梅,趙麗紅,等.沒食子酸對缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用[J].中國老年學(xué)雜志,2010,30(20):2935-2937.

[7] Roohbakhsh A, Moghaddam AH, Massoudi R, et al. Role of dorsal hippocampal cannabinoid receptors and nitric oxide in anxiety like behaviours in rats using the elevated plus-maze test[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2007,4(3):223-229.

[8] Xu X, Li Z, Yang Z, et al. Decrease of synaptic plasticity associated with alteration of information flow in a rat model of vascular dementia[J]. Neuroscience, 2012,206:136-143.

[9] Hsu CL, Yen GC. Effect of gallic acid on high fat diet-induced dyslipidaemia, hepatosteatosis and oxidative stress in rats[J]. Br J Nutr, 2007,98(4):727-735.

[10] 趙玲,劉麗,李雅莉,等.慢性腦低灌注狀態(tài)對大鼠學(xué)習(xí)記憶功能及腦組織自由基代謝的影響[J].中國行為醫(yī)學(xué)科學(xué),2005,14(11):961-963.

[11] Sarkaki A, Fathimoghaddam H, Mansouri SM, et al. Gallic acid improves cognitive, hippocampal long-term potentiation deficits and brain damage induced by chronic cerebral hypoperfusion in rats[J]. Pak J Biol Sci, 2014,17(8):978-990.

[12] 鄒璨,郝磊,田洪,等.慢性腦低灌注后失交感神經(jīng)支配對腦動脈生成的影響[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2015,37(18):1818-1822.

[13] Narantuya D, Nagai A, Sheikh AM, et al.Microglia transplantation attenuates white matter injury in rat chronic ischemia model via matrix metalloproteinase-2 inhibition[J]. Brain Res, 2010,1316:145-152.

[14] Kwon KJ, Lee EJ, Kim MK, et al. Diabetes augments cognitive dysfunction in chronic cerebral hypoperfusion by increasing neuronal cell death: implication of cilostazol for diabetes mellitus-induced dementia[J]. Neurobiol Dis, 2015,73:12-23.

[15] Hotter B, Ostwaldt AC, Levichev-Connolly A, et al. Natural course of total mismatch and predictors for tissue infarction[J]. Neurology, 2015,85(9):770-775.

[16] Safouris A, Hambye AS, Sculier C, et al. Chronic brain hypoperfusion due to multi-vessel extracranial atherosclerotic disease: a potentially reversible cause of cognitive impairment[J]. J Alzheimers Dis, 2015,43(1):23-27.

[17] Schuff N, Matsumoto S, Kmiecik J, et al. Cerebral blood flow in ischemic vascular dementia and Alzheimer′s disease, measured by arterial spin-labeling magnetic resonance imaging[J]. Alzheimers Dement, 2009,5(6):454-462.

[18] Kume K, Hanyue H, Sato T, et al. Vascular risk factors are associated with faster decline of Alzheimer disease: alongitudinal SPECT study[J]. J Neurol, 2011,258(7):1295-1303.

[19] Farkas E, Luiten PG, Bari F. Permanent, bilateral common carotid artery occlusion in the rat: a model for chronic cerebral hypoperfusion-related neurodegenerative diseases[J]. Brain Res Rev, 2007,54(1):162-180.

[20] Gupta S, Singh P, Sharma BM, et al. Neuroprotective effects of agomelatine and vinpocetine against chronic cerebral hypoperfusion induced vascular dementia[J]. Curr Neurovasc Res, 2015,12(3):240-252.

[21] Jing Z, Shi C, Zhu L, et al. Chronic cerebral hypoperfusion induces vascular plasticity and hemodynamics but also neuronal degeneration and cognitive impairment[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2015,35(8):1249-1259.

[22] Yang Y, Zhang J, Xiong L, et al. Cognitive improvement induced by environment enrichment in chronic cerebral hypoperfusion rats: a result of upregulated endogenous neuroprotection[J]. J Mol Neurosci, 2015,56(2):278-289.

[23] Sweet JG, Chan SL, Cipolla MJ. Effect of hypertension and carotid occlusion on brain parenchymal arteriole structure and reactivity[J]. J Appl Physiol, 2015,119(7):817-823.

[24] Shi L, Lei Y, Srivastava R, et al. Gallic acid induces apoptosis in human cervical epithelial cells containing human papillomavirus type 16 episomes[J]. J Med Virol, 2016,88(1):127-134.

[25]卜麗梅,關(guān)鳳英,喬萍,等.沒食子酸對大鼠缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制研究[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2010,14(11):1693-1697.

[26] de Cristo Soares Alves A, Mainardes RM, Khalil NM. Nanoencapsulation of gallic acid and evaluation of its cytotoxicity and antioxidant activity[J]. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl, 2015,60(3):213-215.

[27] Choi JY, Cui Y, Kim BG. Interaction between hypertension and cerebral hypoperfusion in the development of cognitive dysfunction and white matter pathology in rats[J]. Neuroscience, 2015,303:115-125.

[28] Ma L, Lu ZN, Hu P, et al. Neuroprotective effect of escitalopram oxalate in rats with chronic hypoperfusion[J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 2015,35(4):514-518.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.47.010

R741.05

A

1002-266X(2017)47-0035-04

翟志永(E-mail：snezzy@sj-hospital.org)

2017-07-25)