硫辛酸灌胃對大鼠腎缺血再灌注后肝損傷的防治作用及機制探討

王佳，王麗萍，張偉

(華北理工大學，河北唐山 063000)

硫辛酸灌胃對大鼠腎缺血再灌注后肝損傷的防治作用及機制探討

王佳，王麗萍，張偉

(華北理工大學，河北唐山 063000)

目的觀察硫辛酸(LA)灌胃對大鼠腎缺血再灌注(RIR)后肝損傷的防治作用，并探討其機制。方法30只SD大鼠隨機分為3組各10只，對照組及模型組常規(guī)飼養(yǎng)，實驗組灌胃給予250 mg/(kg·24 h)的LA，連續(xù)飼養(yǎng)4周。實驗組及模型組制備RIR模型，對照組除不夾閉雙側腎動、靜脈外，其余操作均與實驗組及模型組相同。檢測各組血漿肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、谷草轉氨酶(ALT)、谷丙轉氨酶(AST)、一氧化氮(NO)和肝組織Ca2+、黃嘌呤氧化酶(XOD)、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、髓過氧化物酶(MPO)，比較肝細胞線粒體Ca2+及Na+-K+-依賴ATP提供能量運轉的離子泵(ATPase)、Ca2+-Mg2+-ATPase、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性，觀察肝組織ICAM-1、Caspase-3、Hsp70蛋白表達情況。結果與對照組比較，模型組血漿Scr、BUN、ALT、AST、NO升高，肝組織Ca2+、XOD、ROS、MDA、MPO升高，肝線粒體Ca2+升高，Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、GSH-Px活性降低；ICAM-1蛋白表達增強，肝組織Caspase-3、Hsp70陽性率升高。與模型組比較，實驗組血漿Scr、BUN、ALT、AST降低，肝組織Ca2+、XOD、ROS、MDA降低，肝線粒體Ca2+降低，Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、GSH-Px活性升高，血漿NO升高，肝組織MPO降低，ICAM-1表達減弱，Caspase-3陽性細胞數(shù)減少，Hsp70陽性細胞數(shù)增多。結論LA對RIR后肝損傷有防治作用，其機制可能通過抗氧化、保護線粒體、抑制炎癥因子、抗凋亡等途徑來實現(xiàn)。

硫辛酸；缺血再灌注損傷；肝損傷；氧化應激；炎性反應；細胞凋亡

腎缺血再灌注損傷(RIRI)是一個非常復雜的病理過程，其主要通過線粒體損傷、炎癥、凋亡、氧化應激等途徑造成腎臟損傷[1～4]。大多數(shù)情況下，腎缺血再灌注(RIR)不僅損傷原位器官，還可引起遠隔器官損傷，而肝臟是人體內最大的實質性器官，其血流量大，易受循環(huán)中有害物質影響而出現(xiàn)病理改變和功能損傷。硫辛酸(LA)作為一種類維生素物質，能抵抗多種氧自由基，又能與金屬離子(如鐵、銅、鎘、鉛、汞等金屬離子)螯合[5]，還能促進線粒體葡萄糖代謝循環(huán)、增加能量產(chǎn)生、影響新陳代謝、緩解炎癥、增強免疫系統(tǒng)及啟動細胞修復機制等[6,7]。本研究觀察了LA對大鼠RIR后肝損傷的防治作用，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雌性SPF級SD大鼠30只[由華北理工大學實驗動物中心提供，實驗動物編號SCXK(京)2012-0001]，56～62日齡。所有大鼠隨機分為實驗組、模型組、對照組各10只。

1.2 LA給予方法及RIR模型制備 制備模型前對照組及模型組常規(guī)飼養(yǎng)，實驗組灌胃給予250 mg/(kg·24 h)的LA，連續(xù)飼養(yǎng)4周。后實驗組及模型組大鼠以3%戊巴比妥鈉溶液(100 mg/kg)腹腔麻醉，開腹，暴露并夾閉雙側腎動、靜脈45 min后恢復血流，復制RIR模型；操作中觀察腎臟由紅變白再變紅，即認為腎臟經(jīng)歷缺血再灌注損傷，即造模成功；模型復制后逐層縫合大鼠腹膜、腹壁肌肉和皮膚。對照組除不夾閉雙側腎動、靜脈外，其余手術操作均與實驗組及模型組相同。

1.3 血漿肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、谷草轉氨酶(ALT)、谷丙轉氨酶(AST)、一氧化氮(NO)檢測 再灌注6 h，大鼠經(jīng)麻醉后開腹，取腹主動脈血。分別采用苦味酸不除蛋白法和OPA法檢測Scr、BUN，采用賴氏法檢測ALT、AST；采用硝酸還原酶法檢測NO，通過顯色深淺檢測其濃度高低。

1.4 肝組織Ca2+、黃嘌呤氧化酶(XOD)、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、髓過氧化物酶(MPO)檢測 再灌注6 h，大鼠經(jīng)麻醉后開腹，取肝組織，液氮速凍后-70 ℃保存。取0.5 g肝組織，用冷生理鹽水制成10%勻漿，采用火焰法檢測肝組織中Ca2+，比色法檢測XOD、ROS、MDA、MPO。

1.5 線粒體Ca2+及Na+-K+-依賴ATP提供能量運轉的離子泵(ATPase)、Ca2+-Mg2+-ATPase、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性檢測 取部分肝組織，制成10%組織勻漿，后離心取沉淀，采用比色法檢測線粒體中Ca2+和Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、GSH-Px酶活性。

1.6 肝組織ICAM-1蛋白檢測 采用Western blotting法。取100 mg液氮凍存的肝組織，加入組織蛋白裂解液0.5 mL，充分研磨,取出勻漿液，4 ℃離心(15 000 r/min)20 min。取100 μg蛋白樣品，于100 ℃煮沸3 min后上樣，進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后，在冰浴中以350 mA電轉移2 h，將蛋白轉移至PVDF膜上，后經(jīng)以下程序：①BSA封閉；②加ICAM-1Ⅰ抗(1∶1 000)置4 ℃冰箱振蕩孵育過夜，TBST洗膜；③加入HRP標記的Ⅱ抗(1∶3 000)室溫反應1 h，TBST洗滌；④ECL化學發(fā)光試劑于暗室中顯影，X光膠片曝光，拍照。以Quantity One對條帶進行定量分析，結果以目的條帶和β-actin條帶積分灰度值比值得出。

1.7 肝組織Caspase-3蛋白檢測 采用免疫組化染色法。制備4 μm肝組織石蠟切片，以Caspase-3抗體為一抗(Caspase-3抗體為北京中山生物技術公司產(chǎn)品)，進行過氧化物酶標記的鏈霉卵白素(SP)染色(染色按SP試劑盒說明書操作)和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，復染，透明，封片鏡檢。高倍鏡下，以胞質染成棕色定義為陽性。根據(jù)陽性細胞分布情況，在400倍高倍鏡視野下，1 000個肝細胞中(每張切片隨機選擇10個視野，每個視野計數(shù)100個細胞)，計算Caspase-3表達陽性率，陽性細胞表達指數(shù)(PEI)=(陽性細胞數(shù)/計數(shù)細胞總數(shù))×100%。

1.8 肝組織Hsp70蛋白檢測 采用免疫組化染色法。制備4 μm肝組織石蠟切片，染色操作按試劑盒說明書進行。高倍鏡下，以胞質染成棕色的細胞為Hsp70蛋白表達陽性細胞。根據(jù)陽性細胞分布情況，在400倍高倍鏡視野下，1 000個肝細胞中(每張切片隨機選擇10個視野，每個視野計數(shù)100個細胞)計算Hsp70蛋白表達陽性率，PEI=(陽性細胞數(shù)/計數(shù)細胞總數(shù))×100%。

2 結果

2.1 各組血漿Scr、BUN、ALT、AST、NO含量比較 結果見表1。

表1 各組血漿Scr、BUN、ALT、AST、NO含量比較

注：與對照組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

2.2 各組肝組織Ca2+含量、XOD、ROS、MDA、MPO含量比較 結果見表2。

表2 各組肝組織Ca2+、XOD、ROS、MDA、MPO含量比較

注：與對照組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

2.3 各組肝線粒體Ca2+含量及Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、GSH-Px活性比較 結果見表3。

表3 各組肝線粒體Ca2+含量及Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、GSH-Px活性比較

注：與對照組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

2.4 各組肝組織ICAM-1、Caspase-3、Hsp70蛋白表達比較 結果見表4。

3 討論

表4 各組肝組織ICAM-1、Caspase-3、Hsp70蛋白表達比較

注：與對照組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

各種手術操作如夾閉主動脈、腎血管引起短暫的腎血流停頓，或出血性休克引起的血流驟減，都會造成腎臟代謝產(chǎn)物的聚集，甚至發(fā)生嚴重的腎組織損傷和功能障礙[1～3]，增加了患者的住院時間和病死率[2]。RIRI是一個非常復雜的病理過程，主要通過線粒體損傷、炎癥、凋亡、氧化應激等途徑造成腎臟損傷[4～7]。在大多數(shù)情況下，RIR不僅損傷原位器官，還可引起遠隔器官損傷，而肝臟是人體內最大的實質性器官，血流量大，易受循環(huán)中的有害物質影響而致肝臟出現(xiàn)病理改變和功能損傷。

LA是硫醇類化合物，具有顯著的親電性及與自由基反應能力，可以提高細胞溶質中谷胱甘肽水平清除ROS，也可直接清除氧自由基[8]。LA不僅具有較強抵抗長時間氧化損傷的作用，還可以有效修復維生素C和維生素E不能修復的、較嚴重的細胞氧化損傷。LA兼具脂溶性和水溶性，可以深入到細胞中的各個部位，是人體內不可缺少的抗氧化劑，口服和靜脈途徑給藥都可以良好吸收，可以透過血腦屏障。LA能與金屬離子(如鐵、銅、鎘、鉛、汞等金屬離子)螯合[9]，表現(xiàn)出很強的抗氧化性，乃至起到重金屬離子中毒的解毒作用。還能促進線粒體的葡萄糖代謝循環(huán)、增加能量產(chǎn)生、影響新陳代謝、緩解炎癥、增強免疫系統(tǒng)及啟動細胞修復機制等[10,11]。有研究[12]表明，LA可減少機體氧化對內皮細胞和上皮細胞的損傷，有效維持內皮細胞和上皮細胞完整性，形成屏障，減少血管內液體及溶質從血管內滲到血管外，有利于氧合，減輕炎癥反應。多項研究[13～16]表明，LA預處理可以減低心肌、睪丸、腎臟、肝臟等器官缺血再灌注損傷。LA有抗氧化應激的作用，近幾年其主要應用于糖尿病周圍神經(jīng)病變治療中，獲得了良好的療效，但其對RIR造成肝損傷的保護作用鮮有報道。

血漿Scr、BUN是反映腎小球濾過率的敏感標志物。本研究顯示，大鼠RIR時血漿Scr、BUN均增加，表明RIRI模型制備成功。血漿ALT、AST變化可以反映肝損傷程度[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組血漿ALT、AST增高,提示RIR后肝細胞受損；而實驗組血漿ALT、AST明顯低于模型組，提示肝細胞損傷的程度減輕，說明LA可以減輕RIR后對肝的損傷。

RIR后腎臟鈣超載聯(lián)合其他原因可導致肝細胞胞質Ca2+升高，線粒體通過從胞質攝取過量的Ca2+來維持胞質內鈣穩(wěn)態(tài)，從而導致線粒體基質Ca2+升高[18]，并且RIR后肝臟中ATPase如Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase的活性受到明顯抑制，導致細胞內Ca2+和Na+超載[19～21]，細胞內鈣離子超載促進黃嘌呤脫氫酶變成XOD，使得次黃嘌呤變成黃嘌呤，并且產(chǎn)生大量的ROS。GSH-Px作為一種重要的過氧化物分解酶，是體內重要的氧自由基清除劑[22]。MDA是脂質過氧化反應的終產(chǎn)物,其反映了機體脂質過氧化的強度和速度。本研究顯示，與對照組比較，模型組肝組織線粒體中Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性降低，肝組織內和線粒體中Ca2+增高，肝組織中ROS、XOD、MDA增多，而GSH-Px酶活性降低。說明在RIR發(fā)生后，各種原因使大鼠肝組織Ca2+升高，導致肝細胞線粒體鈣超載和線粒體損傷；線粒體鈣超載合并其他因素導致大鼠肝內產(chǎn)生了大量ROS，而GSH-Px活性下降，ROS清除不足，ROS與脂類物質發(fā)生過氧化反應，引起MDA等脂類過氧化產(chǎn)物的大量堆積。以上結果提示當RIR發(fā)生后，遭受氧化應激損傷的不僅有腎組織，還有肝細胞及其線粒體，這可能是導致肝功能嚴重受損的重要機制之一。本研究還顯示，與模型組比較，實驗組線粒體中Ca2+和肝組織內Ca2+、ROS、XOD、MDA降低，GSH-Px酶活性升高，肝組織線粒體中Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性升高。提示LA不僅可增強肝組織線粒體組分中ATPase活性和線粒體清除活性氧自由基的能力，還可以保護和促進相關的抗氧化酶GSH-Px活性，減少肝臟脂質過氧化物的產(chǎn)生，從而保護線粒體和肝細胞，進而減輕腎臟缺血再灌注對肝的損害，但其保護作用的具體機制需進一步的研究。

RIR后造成肝組織中性粒細胞集聚與激活，阻塞微血管，肝臟微循環(huán)障礙，產(chǎn)生“無復流現(xiàn)象”，并且產(chǎn)生大量自由基及釋放各種炎性物質，這可能是導致肝臟損傷的原因之一。大量的NO通過刺激中性粒細胞釋放氧自由基，引起氧自由基大量生成，加重組織炎癥反應，對組織細胞產(chǎn)生損傷；其還可作用于血管內皮細胞、組織細胞等破壞血管壁的完整性，進而造成組織器官的功能障礙與損傷。MPO是中性粒細胞和單核細胞氧依賴性殺菌系統(tǒng)的重要組分，可形成具有氧化能力的自由基，檢測MPO水平能反應組織中中性粒細胞聚集的數(shù)量和活化程度。ICAM-1是一種細胞表面糖蛋白。眾多研究發(fā)現(xiàn)，ICAM-1介導了中性粒細胞與血管內皮細胞之間的黏附，而中性粒細胞與血管內皮細胞之間的黏附則是中性粒細胞聚集、活化和釋放炎性介質的關鍵。本文結果顯示，與對照組比較，模型組NO、MPO升高，ICAM-1表達增強。提示在RIR發(fā)生后，ICAM-1表達增加導致大鼠肝內大量中性粒細胞聚集，造成微血管阻塞，NO大量增加刺激中性粒細胞產(chǎn)生大量自由基及釋放各種炎癥因子，造成肝的損傷。本文結果還顯示，實驗組NO高于模型組，而MPO、ICAM-1表達低于模型組。提示LA可以下調ICAM-1的表達來抑制中性粒細胞與血管內皮細胞的黏附，減少RIR后中性粒細胞在肝組織內的積聚，減輕肝損傷。而使用LA后NO水平持續(xù)升高，其機制有待于進一步研究。

肝缺血再灌注損傷時產(chǎn)生的ROS及炎癥因子可導致肝細胞凋亡。因此，推測肝細胞凋亡可能是一個RIR后造成肝損傷的原因。研究證明，凋亡發(fā)生是一個復雜的、由Caspase家族成員介導的蛋白酶級聯(lián)反應過程，而該家族成員Caspase-3是哺乳動物凋亡過程中的關鍵蛋白酶。Hsps是在生理應激或病理狀態(tài)等環(huán)境因素刺激下于細胞內誘導合成的高度保守的多肽類蛋白質分子家族。Hsp70對細胞有明確的內源性保護作用，其成為Hsps中最受關注、研究最深入的一種。正常細胞Hsp70少量存在，創(chuàng)傷后、缺血缺氧及炎性因子等不良刺激導致其合成增加。有研究表明，Hsp70對細胞凋亡的死亡受體通路和線粒體通路也有抑制作用。本研究顯示，與對照組比較，模型組Caspase-3表達增強，Hsp70表達降低。提示RIR后，各種因素可刺激肝細胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應發(fā)生，降低肝細胞內源性保護蛋白的酶活性，減輕Hsp70對細胞及線粒體凋亡的抑制作用，加重肝細胞損傷。本研究還顯示，與模型組比較，實驗組Caspase-3表達降低，Hsp70表達升高。提示外源性補充LA可以明顯減輕RIR導致的肝細胞凋亡，其機制可能是LA通過抑制Caspase-3表達和促進Hsp70表達來保護肝臟。

總之，LA可能通過抗氧化、保護線粒體、抑制炎癥因子和抗凋亡等途徑實現(xiàn)對RIR后肝損傷的防治作用。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.47.009

R363

A

1002-266X(2017)47-0031-04

國家自然科學基金資助項目(81600316)；大學生創(chuàng)新課題(X2017179)。

張偉(E-mail: zhangwei6_ren@163.com)

2017-07-31)