皮下注射重組人生長激素對血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、空間探索能力的影響及其機(jī)制探討

尹加珍，李蓓華，李國春，張紅，黃新武

(1西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，四川瀘州 646000；2西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院)

皮下注射重組人生長激素對血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、空間探索能力的影響及其機(jī)制探討

尹加珍1,2，李蓓華1，李國春2，張紅1，黃新武1

(1西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，四川瀘州 646000；2西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院)

目的觀察重組人生長激素(rhGH)對血管性癡呆(VD)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、空間探索能力的影響，并探討其可能機(jī)制。方法45只大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、模型組、正常組各15只，其中實(shí)驗(yàn)組和模型組通過不同時(shí)間點(diǎn)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法(結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈3 d后再結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈)制備VD模型，正常組用同樣方法分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，但不結(jié)扎頸總動(dòng)脈；造模后第1天開始，實(shí)驗(yàn)組大鼠頸部皮下注射rhGH(0.2 IU/100 g)，正常組和模型組給予等量生理鹽水，1次/d，連續(xù)28 d。采用水迷宮實(shí)驗(yàn)評價(jià)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及空間探索能力，ELISA法檢測血清、皮質(zhì)、海馬中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、胰島素樣生長因子1(IGF-1)、生長激素(GH)，TUNEL凋亡染色觀察神經(jīng)元凋亡情況[以積分光密度值(IOD值)表示]。結(jié)果與正常組比較，實(shí)驗(yàn)組第1～4天及模型組第1～6天逃避潛伏期長(P均<0.05)；與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組第2、4、5、6天逃避潛伏期短(P均<0.05)。與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組、正常組經(jīng)過平臺(tái)次數(shù)多(P均<0.05)。與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組血清、皮質(zhì)、海馬中VEGF、IGF-1、GH水平升高(P均<0.05)；與正常組比較，模型組血清、皮質(zhì)、海馬中VEGF、IGF-1、GH水平降低(P均<0.05)。與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組、正常組海馬TUNEL凋亡染色I(xiàn)OD值降低(P均<0.05)。結(jié)論rhGH可改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、空間探索能力，其機(jī)制可能與其可增加血清、皮質(zhì)、海馬中VEGF和IGF-1水平有關(guān)。

血管性癡呆；重組人生長激素；血管內(nèi)皮生長因子；胰島素樣生長因子

血管性癡呆(VD)是指由各種腦血管疾病導(dǎo)致的腦功能障礙從而產(chǎn)生大腦智能及認(rèn)知功能障礙的臨床綜合征[1]，誘因以慢性腦缺血最為常見，其主要臨床表現(xiàn)為學(xué)習(xí)及記憶能力的障礙[2]。近年來，隨著人口老齡化比率增加，VD發(fā)病率日漸增高。據(jù)國外資料報(bào)道，VD是迄今為止惟一可防治的癡呆，早期干預(yù)治療具有可逆性[3]。目前，關(guān)于VD預(yù)防的研究取得了很大的進(jìn)展，但仍缺乏有效的治療手段和藥物，因此探索VD的發(fā)病機(jī)制以及治療方法具有重要意義[4,5]。研究[6～8]發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長因子1(IGF-1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)對缺血缺氧的病理改變具有重要的作用。重組人生長激素(rhGH)能促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)、神經(jīng)再生和神經(jīng)發(fā)育，具有強(qiáng)大的神經(jīng)保護(hù)作用[9]。然而，rhGH對VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶是否有改善作用？IGF-1、VEGF與VD之間的關(guān)系及rhGH對腦缺血大鼠IGF-1、VEGF有何影響至今未見報(bào)到。本研究觀察了rhGH對VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、空間探索能力的影響，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠45只，體質(zhì)量(200±10)g，SPF級(jí)，由西南醫(yī)科大學(xué)SPF動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 藥物、試劑、儀器 注射用rhGH購自安徽安科生物工程(集團(tuán))股份有限公司。大鼠(Rat)生長激素(GH)ELISA檢測試劑盒、大鼠(Rat)VEGF ELISA檢測試劑盒、大鼠(Rat)IGF-1 ELISA檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。低溫離心機(jī)(ST16R)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司，Morris水迷宮購自成都泰盟科技有限公司，SpectraMax?M3多功能酶標(biāo)儀購自Molecular Devices公司。

1.3 VD模型制備及rhGH給予方法 45只大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、模型組、正常組各15只，其中實(shí)驗(yàn)組和模型組通過不同時(shí)間點(diǎn)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法(結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈3 d后再結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈)制備VD模型[10,11]。正常組用同樣方法分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，但不結(jié)扎頸總動(dòng)脈。造模后第1天開始，實(shí)驗(yàn)組大鼠頸部皮下注射rhGH(0.2 IU/100 g)，正常組和模型組給予等量生理鹽水，1次/d，連續(xù)28 d。4周后正常組除去死亡的剩余13只，模型組和實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過水迷宮篩選出學(xué)習(xí)記憶能力明顯障礙的大鼠，每組13只。

1.4 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及空間探索能力評價(jià) 采用水迷宮實(shí)驗(yàn)。Morris水迷宮中加入牛奶使水呈乳白色，水深沒過平臺(tái)約2 cm，水溫控制在(26±1)℃。設(shè)備固定后不再移動(dòng)，實(shí)驗(yàn)期間實(shí)驗(yàn)室的燈光和布置保持不變，盡量排除干擾因素。①定位航行：歷時(shí)6 d，每次將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別從4個(gè)入水點(diǎn)面朝池壁輕輕放入水中，記錄大鼠從入水至找到平臺(tái)的游泳軌跡及逃避潛伏期。每次時(shí)間為120 s，如果120 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)者用手牽引其至平臺(tái)上停留20 s，并記錄潛伏期為120 s，每次實(shí)驗(yàn)后用干毛巾將大鼠擦干放入籠中。2次/d，連續(xù)6 d，計(jì)算平均成績，此時(shí)的逃避潛伏期作為評價(jià)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的指標(biāo)。②空間探索：在定位航行實(shí)驗(yàn)后，撤去平臺(tái)，選擇離原平臺(tái)所在處最遠(yuǎn)的象限為入水點(diǎn)將大鼠放入水中，記錄其在120 s內(nèi)游泳經(jīng)過原平臺(tái)所在處的次數(shù)，將其作為評價(jià)大鼠空間探索能力的指標(biāo)。

1.5 大鼠血清和腦組織VEGF、IGF-1、GH檢測 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，禁食12 h，禁水4 h。各組大鼠隨機(jī)取8只，稱重，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(0.15 mL/100 g)麻醉，腹主動(dòng)脈取血，加入含抗凝劑的真空采血管中，室溫放至凝固，在4 ℃條件下以3 000 r/min離心10 min，分離血清，分裝于EP管中，-80 ℃保存，測定前室溫下復(fù)蘇。大鼠取血后，斷頭取腦，立即分離大鼠的皮質(zhì)和海馬，稱重，分別按組織重量(g)∶生理鹽水(mL)=1∶10的比例制作10%勻漿，4 ℃條件下以3 000 r/min離心10 min，棄去沉淀，取其清液，分裝，-80 ℃保存。 采用ELISA雙抗體夾心法的原理，往預(yù)先包被VEGF、IGF-1、GH抗體的包被微孔中，依次加入待測樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和待測樣本中VEGF、IGF-1、GH呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度值(OD值)，并將其在標(biāo)準(zhǔn)曲線下?lián)Q算成濃度。

1.6 大鼠海馬神經(jīng)元TUNEL凋亡染色I(xiàn)OD值測算 各組另取5只大鼠，取腦組織包埋切片，進(jìn)行TUNEL凋亡染色，觀察神經(jīng)元凋亡情況。按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行染色。切片脫蠟及水合后滴加蛋白酶K工作液，滴加50 μL的TUNEL反應(yīng)液(TdT酶溶液與Dutp標(biāo)記液按照1∶9比例混合)于37 ℃濕盒中60 min、PBS漂洗、加POD轉(zhuǎn)化劑50 μL于25 ℃濕盒10 min、PBS漂洗、DAB顯色，鏡下控制、蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，透明，封片。各組大鼠腦組織進(jìn)行連續(xù)切片，每個(gè)腦組織均勻間隔選取5張進(jìn)行染色，在10×40倍鏡下于海馬CA1區(qū)隨機(jī)選取3個(gè)視野，采用IPP圖像處理軟件，測量積分光密度值(IOD值)，取平均值作為每張切片的IOD值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期比較 結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期比較

注：與正常組比較，★P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05。

2.2 各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)經(jīng)過平臺(tái)次數(shù)比較 實(shí)驗(yàn)組、模型組、正常組經(jīng)過平臺(tái)次數(shù)分別為(3.14±1.50)、(1.32±1.19)、(5.87±3.27)次，模型組與正常組比較，實(shí)驗(yàn)組與模型組比較，P均<0.05。

2.3 各組大鼠血清VEGF、IGF-1、GH水平比較 結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠血清VEGF、IGF-1、GH水平比較

注：與模型組比較，▲P<0.05；與正常組比較，★P<0.05。

2.4 各組大鼠皮質(zhì)和海馬VEGF、IGF-1、GH表達(dá)比較 結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠皮質(zhì)和海馬VEGF、IGF-1、GH表達(dá)比較

注：與模型組比較，▲P<0.05；與正常組比較，★P<0.05。

2.5 各組大鼠海馬TUNEL凋亡染色I(xiàn)OD值比較 實(shí)驗(yàn)組、模型組、正常組海馬TUNEL凋亡染色I(xiàn)OD值分別為165.30±16.51、275.02±20.60、75.99±4.95，實(shí)驗(yàn)組、正常組分別與模型組比較，P均<0.05。

3 討論

VD是各種腦血管疾病導(dǎo)致的腦功能受損，誘因以慢性腦缺血最為常見，其主要臨床表現(xiàn)為學(xué)習(xí)與記憶能力障礙。研究[12]表明，中國60歲及以上的老年人中，VD患病率高達(dá)1.1%。目前，臨床常采取活血化淤等藥物改善VD患者血液循環(huán)，擬膽堿藥物改善患者學(xué)習(xí)記憶能力[13,14]，但效果不是特別理想。

rhGH是由基因工程合成具有與人體內(nèi)源性生長激素相同結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)類激素，與內(nèi)源性生長激素具有同等的作用，有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、抑制缺氧導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、神經(jīng)保護(hù)等作用[9]。劉海濤等[15]應(yīng)用線栓法制作大鼠腦缺血/再灌注損傷模型，給予rhGH干預(yù)，并在干預(yù)后的7、14、21 d運(yùn)用免疫組化法測定凋亡細(xì)胞和Nestin表達(dá)，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元凋亡數(shù)較對照組明顯減少，Nestin的表達(dá)顯著增加，說明rhGH可抑制缺血性腦損傷后細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞增殖，從而減少神經(jīng)元損傷和促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射rhGH能減小大腦中動(dòng)脈供血區(qū)缺血梗死模型大鼠腦組織含水量、梗死體積，兩者均明顯低于缺血組。張曄等[16]采用線栓法制備SD大鼠大腦永久性閉塞模型，皮下注射rhGH后觀察到大鼠腦缺血致腦梗死面積差異和神經(jīng)能力恢復(fù)情況，提示rhGH能顯著減小大鼠持續(xù)性腦缺血后的腦梗死面積，對大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)有明顯改善。本研究顯示，與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組逃避潛伏期短，穿過平臺(tái)的次數(shù)多，海馬CA1區(qū)凋亡神經(jīng)元數(shù)量減少，說明rhGH可以顯著改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和空間探索能力。

生長激素(GH)是由垂體前葉嗜酸細(xì)胞所分泌的非糖基化蛋白，主要功能是促進(jìn)肌肉組織蛋白質(zhì)合成，增加肌肉體積和肌肉力量，促進(jìn)機(jī)體的生長，GH可以促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)、神經(jīng)再生和神經(jīng)發(fā)育，具有強(qiáng)大的神經(jīng)保護(hù)作用。VEGF通過作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管生成，增加血管密度，改善缺血區(qū)的血液循環(huán)，改善神經(jīng)系統(tǒng)的功能[17]。GH直接或間接地通過IGF-1來發(fā)揮作用。正常情況下，GH通過肝臟受體促進(jìn)肝臟IGF-1基因的表達(dá)，從而促進(jìn)IGF-1的合成和釋放，血清中IGF-1通過反饋調(diào)節(jié)抑制垂體釋放GH，使得血液中GH和IGF-1處于平衡狀態(tài)[18]。局灶性腦缺血大鼠側(cè)腦室注射IGF-1，發(fā)現(xiàn)腦組織VEGF蛋白、mRNA表達(dá)增加，缺血性腦組織的病理損傷減輕，提示GH促進(jìn)IGF-1合成的同時(shí)，可以間接增加VEGF水平[19]。VD患者GH的分泌受到抑制，眾多實(shí)驗(yàn)表明VD的發(fā)生發(fā)展與IGF-1、VEGF有緊密的聯(lián)系。本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組血清、皮質(zhì)、海馬中VEGF、IGF-1、GH水平均高于模型組。表明rhGH可能通過增加VD大鼠IGF-1和VEGF的水平從來減少神經(jīng)元凋亡，提高學(xué)習(xí)記憶能力，改善其認(rèn)知功能障礙。

[1] 張?jiān)蕩X,梅建勛,謝穎楨,等.老年期血管性癡呆分期分證探討[J].中醫(yī)雜志,2008,49(2):173-175.

[2] 張崗,王發(fā)渭.血管性癡呆的中醫(yī)臨床研究新進(jìn)展[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2010,21(3):769-771.

[3] Gorelick PB. Status of risk factors for dementia associated with stroke[J].Stroke, 1997,28(2):459-463.

[4] He Z, Pan Z, Lu W. Neuroprotective effects of tanshinone Ⅱ A on vascular dementia in rats[J]. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 2010,35(14):1883-1886.

[5] 肖迎春,劉楠,周宜燦,等.文拉法辛對血管性癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響[J].中華老年醫(yī)學(xué)雜志,2012,31(11):1027-1030.

[6] Lin S, Fan LW, Pang Y, et al. IGF-1 protects oligodendrocyte progenitor cells and improves neurological functions following cerebral hypoxia-ischemia in the neonatal rat[J]. Brain Research, 2005,1063(1):15-26.

[7] 黃體秀,張紅.鼠神經(jīng)生長因子治療新生兒缺氧缺血性腦病的臨床療效及神經(jīng)保護(hù)作用[J].河北醫(yī)學(xué),2014,20(12):1956-1958.

[8] 廖德榮,劉啟功,程燕子,等.血管內(nèi)皮生長因子拮抗缺氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2007,17(22):2732-2735.

[9] 孫曉靜,張皓.生長激素在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中的作用[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2015,21(1):54-57.

[10] 黃新武,李華,秦大蓮,等.不同時(shí)點(diǎn)分別結(jié)扎左、右頸總動(dòng)脈建立大鼠血管性癡呆模型[J].中國老年學(xué)雜志,2010,30(14):2006-2007.

[11] 任瑩,劉靜,申秀萍,等.不同亞型血管性癡呆的動(dòng)物模型研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥,2012,52(35):97-99.

[12] 劉伯源,王久玲,肖義澤.中國60歲及以上人群老年期癡呆患病率Meta分析[J].中華流行病學(xué)雜志,2016,37(11):1541-1545.

[13] Zhang LD, Gong XJ, HU MM, et al. Anti-vascular dementia effect of gastrodin and its mechanism of action[J].Chin J Nat Med, 2008,6(2):130-134.

[14] 于飛,孫永馨.血管性癡呆大鼠模型的治療方法研究進(jìn)展[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2014,19(9):66-71.

[15] 劉海濤,白宏英,曾志磊,等.重組人生長激素對腦缺血/再灌注損傷細(xì)胞凋亡及Nestin表達(dá)的影響[J].中國實(shí)用神經(jīng)疾病雜志,2010,13(1):39-41.

[16] 張曄,王旭開,楊成明,等.重組人生長激素對AMI大鼠缺血心肌VEGF表達(dá)的影響及其生物學(xué)效應(yīng)[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,26(13):1148-1151.

[17] Zimmerman MW, McQueeney KE, Isenberg JS, et al. PTP4A3 phosphatase promotes VEGF signaling and enables endothelial cell motility[J]. J Biol Chem, 2014,289(9):5904-5913.

[18] 上官芳芳,施建農(nóng).生長激素/IGF-1對認(rèn)知功能的影響[J].中國心理衛(wèi)生雜志,2007,21(8):568-570.

[19] Wang Y, Kilic E, Kilic U, et al. VEGF overexpression induces post-ischaemic neuroprotection, but facilitates haemodynamic steal phenomena[J]. Brain, 2005,128(Pt 1):52-63.

Effectsofsubcutaneousinjectionofrecombinanthumangrowthhormoneonabilityoflearning,memory,andspatialexplorationofratswithvasculardementia

YINJiazhen1,LIBeihua,LIGuochun,ZHANGHong,HUANGXinwu

(1SchoolofPharmacy,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China)

ObjectiveTo observe the effects of recombinant human growth hormone (rhGH) on the ability of learning, memory and space exploration of rats with vascular dementia (VD) and to explore its possible mechanism.MethodsForty-five rats were randomly divided into three groups: the experimental group, model group, and normal group, with 15 rats in each. The VD model was prepared in the experimental group and the model group through bilateral carotid artery ligation at different time points (we ligated the right carotid artery three days after the left carotid artery was ligated). The normal group used the same method to separate the bilateral carotid arteries, but we did not ligate the common carotid artery. At the beginning of the first day after modeling, rhGH (0.2 IU/100 g) was injected into the neck of the rats in the experimental group, while rats of the normal group and model group were given the same amount of normal sodium once a day for 28 days. Water maze test was used to assess the ability of learning and memory and space exploration of rats. ELISA was used to detect the levels of vascular endothelial growth factor (VEGF), insulin-like growth factor 1 (IGF-1) and growth hormone (GH) in the serum, cortex, and hippocampus. TUNEL apoptosis staining was used to observe the status of neuronal apoptosis (IOD value).ResultsCompared with the normal group, the experimental group from the first to the fourth day and the model group from the first to the sixth day had longer escape latency (P<0.05). Compared with the model group, the experimental group had shorter escape latency on the 2nd, 4th, 5th, and 6th days (P<0.05). Compared with the model group, the experimental group and the normal group passed the platforms more (P<0.05). Compared with model group, the levels of VEGF, IGF-1, and GH in the serum, cortex, and hippocampus of the experimental group increased (allP<0.05). Compared with the normal group, the levels of VEGF, IGF-1, and GH in the serum, cortex, and hippocampus of the model group decreased (allP<0.05). Compared with the model group, the IOD value of TUNEL apoptosis staining in the hippocampus of the experimental group and the normal group decreased (P<0.05).ConclusionThe rhGH can improve the ability of learning, memory, and space exploration in VD rats by increasing the VEGF and IGF-1 levels in the serum, cortex, and hippocampus.

vascular dementia; recombinant human growth hormone; vascular endothelial growth factor; insulin-like growth factor

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.47.007

R743

A

1002-266X(2017)47-0024-04

四川省教育廳課題(13ZB0266)。

尹加珍(1989-)，女，碩士，藥師，主要研究方向?yàn)樯窠?jīng)藥理學(xué)。E-mail: 422390158@qq.com

黃新武(1972-)，男，碩士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)樯窠?jīng)藥理學(xué)。E-mail: hxw-lgc@163.com

2017-08-08)