潰瘍性結(jié)腸炎患者TNF-α基因啟動(dòng)子-308G/A單核苷酸多態(tài)性觀察

常廷民，張超賢，張利利，李秀敏

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南衛(wèi)輝 453100)

潰瘍性結(jié)腸炎患者TNF-α基因啟動(dòng)子-308G/A單核苷酸多態(tài)性觀察

常廷民，張超賢，張利利，李秀敏

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南衛(wèi)輝 453100)

目的分析潰瘍性結(jié)腸炎(UC)患者腫瘤壞死因子-α(TNF-α)基因啟動(dòng)子-308G/A單核苷酸多態(tài)性。方法UC患者750例(觀察組)，健康體檢者750例(對(duì)照組)，采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)分析兩組TNF-α基因啟動(dòng)子-308G/A單核苷酸多態(tài)性；ELISA法檢測(cè)兩組血漿TNF-α。結(jié)果觀察組GG、GA、AA基因型頻率及G、A等位基因頻率分別為14.93%、42.27%、42.80%、36.07、63.93%，對(duì)照組分別為67.73%、16.40%、15.87%、75.93、24.07%，兩組比較，P均<0.05。觀察組及對(duì)照組血漿TNF-α水平分別為(31.48±11.52)、(14.82±5.61)pg/L，兩組比較，P<0.05。觀察組GG、GA、AA基因型攜帶者TNF-α水平分別為(17.95±7.82)、(34.32±0.75)、(34.64±13.83)pg/L，對(duì)照組分別為(10.63±3.29)、(21.25±10.47)、(21.91±8.51)pg/L，GA、AA基因型與同組GG基因型攜帶者比較，兩組GG、GA、AA基因型攜帶者比較，P均<0.05。結(jié)論UC患者TNF-α基因啟動(dòng)子-308G/A存在單核苷酸多態(tài)性，GA、AA基因型是UC的易患因素，這可能與兩基因型可提高患者血漿TNF-α水平密切相關(guān)。

腫瘤壞死因子-α基因啟動(dòng)子-308G/A；單核苷酸多態(tài)性；潰瘍性結(jié)腸炎；腫瘤壞死因子α

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前認(rèn)為腸道微生態(tài)失衡及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)等炎癥細(xì)胞因子調(diào)節(jié)紊亂起重要作用[1～4]。TNF-α是由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，具有廣泛的生物學(xué)活性，除有抗腫瘤作用外，對(duì)免疫反應(yīng)、機(jī)體代謝、炎癥反應(yīng)均有重要的調(diào)節(jié)介導(dǎo)作用[5,6]。TNF-α參與UC致病作用主要是使中性粒細(xì)胞聚集、內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)上調(diào)及引起凝血酶原效應(yīng)等。在腸道中，TNF-α介導(dǎo)黏膜損傷的作用，同時(shí)刺激炎癥細(xì)胞分泌其他細(xì)胞因子，如誘導(dǎo)產(chǎn)生血小板激活因子、白三烯等，使結(jié)腸固有膜內(nèi)小血管在炎癥基礎(chǔ)上形成微血栓，導(dǎo)致黏膜微循環(huán)障礙，使腸黏膜組織損傷進(jìn)一步加重，TNF-α通過上述過程參與UC發(fā)病，為UC發(fā)病機(jī)制中的啟動(dòng)因子[7,8]。TNF-α基因具有單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，即一個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)具有2個(gè)或多個(gè)等位基因，不同的等位基因編碼的TNF-α活性有差異[9～12]。TNF-α基因的多態(tài)性可使機(jī)體對(duì)外界環(huán)境飲食因素(如高脂飲食)的反應(yīng)能力有所不同，這是決定機(jī)體炎癥性疾病易感性的一個(gè)重要因素。本研究對(duì)750例UC患者和750例健康體檢者的TNF-α基因啟動(dòng)子-308G/A單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行了觀察，并探討TNF-α基因啟動(dòng)子-308G/A單核苷酸多態(tài)性與UC發(fā)病的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2009年4月～2014年8月新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的UC患者750例(觀察組)，男466，女284例；年齡40～68(50.67±9.14)歲；所有患者均經(jīng)內(nèi)鏡檢查結(jié)合病理學(xué)確診，體檢顯示無腫瘤、其他自身免疫性及遺傳性疾病，納入研究時(shí)均為第一次就診，未經(jīng)任何藥物和手術(shù)治療。另選750例健康體檢者作為對(duì)照組，男466，女284例；年齡39～69(50.38±8.63)歲。均為豫北居民或在豫北10年及以上，在年齡、性別、民族、籍貫和生活習(xí)慣上比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且無血緣關(guān)系。觀察組有飲酒史389例(51.87%)、吸煙史360例(48.00%)，對(duì)照組分別為172例(22.93%)、563例(75.07%)，兩組比較，P均<0.05。

1.2 TNF-α基因啟動(dòng)子-308G/A基因單核苷酸多態(tài)性分析 參照文獻(xiàn)[13]方法。于清晨抽取受試者靜脈血8 mL，其中4 mL置于乙二胺四乙酸鈉抗凝管中，分離白細(xì)胞層。用QIAampDNA提取試劑盒(德國(guó)QIAgen公司)提取白細(xì)胞DNA，DNA置于-30 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ镄蛄校?′-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT′，5′-TCCTCCCTGCTGCTCCGATTCCG-3′，由Invitrogen公司合成，PCR反應(yīng)體系包括：dNTPmix 4 μL(終濃度0.2 mol/L)，10×緩沖液5 μL，MgCl24 μL(終濃度1.5 mol/L)，基因組DNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，Taq DNA聚合酶Mix液(Takara公司)6 μL，使用美國(guó)PE-2400型PCR擴(kuò)增儀。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為107 bp，經(jīng)Bio-Rad染色瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增結(jié)果后，以限制性內(nèi)切酶NcoⅠ酶切，37 ℃孵育4 h，取酶切產(chǎn)物4 μL經(jīng)Bio-Rad染色瓊脂糖凝膠電泳。酶切產(chǎn)物放入紫外線凝膠成像儀觀測(cè)?？梢?種帶型：GG純合子完全被酶切，產(chǎn)生87、20 bp兩種片段，20 bp片段在電泳圖中不能顯示，可見87 bp的1條區(qū)帶；GA雜合子部分被酶切，產(chǎn)生為107、87、20 bp的三種片段，20 bp片段不能顯示，在電泳圖中可見為107、87 bp的兩條區(qū)帶；AA純合子不能被酶切，顯示107 bp的1條區(qū)帶。每組隨機(jī)抽取30個(gè)初步確定了基因型的樣本，用PCR擴(kuò)增后，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3 血漿TNF-α檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)血漿TNF-α。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件。Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)研究樣本的群體代表性，以P>0.05為符合Hardy-Weinberg規(guī)律。用相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度的比值比(OR)和95%可信區(qū)間(95%CI)評(píng)價(jià)相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)，觀察組和對(duì)照組之間的基因型頻率和等位基因頻率采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

TNF-α基因啟動(dòng)子-308G/A的基因型分別為GG、GA、AA，等位基因分別為G、A。符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(P>0.05)，表明本實(shí)驗(yàn)所選取人群具有群體代表性。兩組TNF-α基因啟動(dòng)子-308G/A基因型、等位基因分布見表1。由表1可知，兩組GG、GA、AA基因型頻率及G、A等位基因頻率比較，P均<0.05。觀察組及對(duì)照組血漿TNF-α水平分別為(31.48±11.52)、(14.82±5.61)pg/L，兩組比較，P<0.05。兩組不同基因型攜帶者血漿TNF-α水平比較見表2。

3 討論

表1 兩組TNF-α基因啟動(dòng)子-308G/A基因型、等位基因分布

表2 兩組不同基因型攜帶者血漿TNF-α水平比較

注：與同組GG基因型攜帶者比較，*P<0.05；與對(duì)照組比較，△P<0.05。

TNF-α是一種促炎癥細(xì)胞因子，是機(jī)體炎癥反應(yīng)與免疫反應(yīng)應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子，可使中性粒細(xì)胞聚集，產(chǎn)生呼吸爆發(fā)、脫顆粒，對(duì)淋巴細(xì)胞有刺激作用，可上調(diào)趨化因子IL-8的表達(dá)，IL-8可進(jìn)一步通過對(duì)中性粒細(xì)胞的趨化作用，導(dǎo)致腸組織內(nèi)各種炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[14,15]。此外，TNF-α可增強(qiáng)干擾素-γ誘導(dǎo)的組織相容性復(fù)合物表達(dá)，協(xié)同IFN -γ改變腸道上皮的屏障功能，還可誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞凋亡；在IL-6的參與下，誘導(dǎo)凝血酶形成，使小血管在炎癥基礎(chǔ)上形成微血栓，導(dǎo)致黏膜微循環(huán)障礙；還可激活磷脂酶，繼而生成白三烯和氧自由基等[16]。大量研究[17,18]表明，TNF-α在UC中呈高表達(dá)并在UC中發(fā)揮重要的作用。人類TNF-α基因位于第6條染色體短臂Ⅲ類MHC區(qū)域，包括4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，與MHCⅠ類抗原基因的HLA-B相鄰，這個(gè)區(qū)域的差異能決定某些疾病發(fā)生的易感素質(zhì)。

TNF-α基因的單核苷酸多態(tài)性多發(fā)生在TNF-α基因的啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)，目前研究較多的是5′端側(cè)翼序列的啟動(dòng)子-308G/A位點(diǎn)多態(tài)性。-308G/A位點(diǎn)多態(tài)性有三種基因型，即-308G/A(GG)、-308G/A(GA)和-308G/A(AA)，國(guó)內(nèi)外已有研究報(bào)道認(rèn)為-308G/A位點(diǎn)的多態(tài)性與多種炎癥性、自身免疫性的易感性有關(guān)[19,20]，但機(jī)理還不清楚。相關(guān)研究顯示，-308G/A處于與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的活化子蛋白-2相結(jié)合的共同序列中，A等位基因可增強(qiáng)TNF-α轉(zhuǎn)錄6～7倍，并在基因轉(zhuǎn)染中能誘導(dǎo)mRNA的表達(dá)。啟動(dòng)子區(qū)域G→A的突變使TNF-α基因轉(zhuǎn)錄、翻譯水平失常，導(dǎo)致TNF-α表達(dá)、功能異常[21]，增加了炎癥相關(guān)性疾病發(fā)生的危險(xiǎn)性。本研究顯示，觀察組GG、GA、AA基因型頻率高于對(duì)照組，提示攜帶-308G/A(GG)、-308G/A(GA)、-308G/A(AA)基因者患UC的風(fēng)險(xiǎn)高。本文結(jié)果顯示，觀察組血漿TNF-α水平高于對(duì)照組，提示血漿TNF-α表達(dá)和UC的發(fā)生密切相關(guān)，血漿TNF-α增高可能促進(jìn)UC的發(fā)生發(fā)展。本研究還顯示，觀察組和對(duì)照組突變基因型攜帶者血漿TNF-α表達(dá)水平均明顯高于同一組野生純合子基因型攜帶者，提示-308G/A基因突變可以明顯提高血漿TNF-α表達(dá)，這可能是血漿TNF-α表達(dá)基因突變促進(jìn)UC發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制；兩組三個(gè)基因型攜帶者血漿TNF-α水平比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明-308G/A基因型雖是影響血漿TNF-α表達(dá)的重要因素，但不是惟一因素，還有哪些因素影響血漿TNF-α表達(dá)水平值得進(jìn)一步研究。

總之，UC的發(fā)生是涉及多種基因相互作用的復(fù)雜過程，本研究提示攜帶TNF-α基因啟動(dòng)子-308G/A突變基因型的個(gè)體屬UC發(fā)生高危險(xiǎn)人群，UC診治方案中應(yīng)加以重視，雖然尚不能通過改變其易感基因型來防治UC，但可以通過TNF-α基因啟動(dòng)子-308G/A基因檢測(cè)，預(yù)測(cè)個(gè)體發(fā)生UC的風(fēng)險(xiǎn)性，并采取相應(yīng)的措施如調(diào)控基因表達(dá)、對(duì)可能的危險(xiǎn)因素的控制等，以達(dá)到有效預(yù)防UC的目的。

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SinglenucleotidepolymorphismsofTNF-αgenepromoter-308G/Ainpatientswithulcerativecolitis

CHANGTingmin,ZHANGChaoxian,ZHANGLili,LIXiumin

(TheFirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity,Weihui453100,China)

ObjectiveTo analyze the single nucleotide polymorphisms of tumor necrosis factor-α (TNF-α) gene promoter-308G/A in patients with ulcerative colitis (UC).MethodsThe single nucleotide polymorphisms of TNF-α gene promoter-308G/A were analyzed in the peripheral blood leukocytes of 750 patients with confirmed UC (observation group) and 750 healthy persons (control group) by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). The expression of TNF-α in plasma was determined by ELISA.ResultsThe frequencies of GG, GA, AA genotypes and G, A allele in the observation group were 14.93%, 42.27%, 42.80%, 36.07%, and 63.93%, respectively, and 67.73%, 16.40%, 15.87%, 75.93, and 24.07 in the control group, allP<0.05. The levels of TNF-α in the plasma of the observation group and control group were (31.48±11.52) pg/L and (14.82±5.61) pg/L, respectively (P<0.05). The levels of TNF-α in patients with GG, GA and AA genotypes of the observation group were (17.95±7.82), (34.32±0.75), and (34.64±13.83) pg/L, respectively, while those in the control group were (10.63±3.29) and (21.25±10.47), and (21.91±8.51) pg/L, respectively.The differences were significant between patients with GA and AA genotypes and patients with GG genotype in the same group, and between patients with GG, GA and AA genotypes of the two groups (allP<0.05).ConclusionThere is single nucleotide polymorphism of TNF-α gene promoter-308G/A in patients with UC, and GA and AA genotypes are the risk factors for UC, because they can increase the TNF-α expression in plasma.

tumor necrosis factor-α gene promoter-308G/A; single nucleotide polymorphism; ulcerative colitis; tumor necrosis factor-α

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.47.006

R574.62

A

1002-266X(2017)47-0020-04

河南省科技廳科技攻關(guān)計(jì)劃(112102310283)。

常廷民(1970-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)檠装Y性腸病和消化道腫瘤。E-mail: ctminmail@163.com

李秀敏(1964-)，女，博士，主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)檠装Y性腸病和消化道腫瘤。E-mail: lxm3029981@126.com

2017-07-15)

的標(biāo)識(shí)

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