生長(zhǎng)抑素與吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人轉(zhuǎn)移性胰腺癌細(xì)胞株AsPC-1增殖的影響

劉力，饒奇碩，雷昌斌，王文婷，彭釗，曠星星，劉國(guó)文

(1湘南學(xué)院附屬醫(yī)院，湖南郴州 423000；2南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院；3南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所)

生長(zhǎng)抑素與吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人轉(zhuǎn)移性胰腺癌細(xì)胞株AsPC-1增殖的影響

劉力1，饒奇碩2，雷昌斌1，王文婷1，彭釗1，曠星星3，劉國(guó)文2

(1湘南學(xué)院附屬醫(yī)院，湖南郴州 423000；2南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院；3南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所)

目的觀察生長(zhǎng)抑素(SST)與吉西他濱(Gem)聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人轉(zhuǎn)移性胰腺癌細(xì)胞AsPC-1增殖的影響。方法體外培養(yǎng)AsPC-1細(xì)胞。①采用0、100、200、400、600、800 μg/mL SST處理24、48、72 h，計(jì)算SST的半數(shù)抑制濃度(IC50)；②采用0、0.1、1、5、10、20、40、60 μmol/L Gem處理48 h(按照SST IC50時(shí)間)，計(jì)算出Gem IC50；③依據(jù)以上實(shí)驗(yàn)得出的SST、Gem IC50，將AsPC-1細(xì)胞分為4組，A組不做任何處理，B組加入SST IC50，C組加入Gem IC50，D組加入1/2 SST IC50+1/2 Gem IC50，處理時(shí)間按SST IC50時(shí)間進(jìn)行，計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率。結(jié)果AsPC-1細(xì)胞在SST濃度為600 μg/mL處理48 h時(shí)達(dá)到半數(shù)抑制。AsPC-1細(xì)胞在Gem濃度為20 μmol/L時(shí)達(dá)到半數(shù)抑制。A、B、C、D組細(xì)胞增殖抑制率分別為0.00%±3.79%、52.59%±4.57%、48.11%±10.93%、64.86%±4.83%，B、C、D組分別與A組比較，B、C組分別與D組比較，P均<0.05。結(jié)論SST聯(lián)合Gem可抑制AsPC-1細(xì)胞的增殖。

生長(zhǎng)抑素；吉西他濱；轉(zhuǎn)移性胰腺癌細(xì)胞AsPC-1

胰腺癌是一種惡性程度高、治療難度大的消化道惡性腫瘤，具有高度侵襲傾向，80%以上的患者會(huì)發(fā)生局部蔓延和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差[1]。文獻(xiàn)[2,3]報(bào)道，胰腺癌預(yù)后差的主要原因?yàn)樵缙跇O易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移及對(duì)吉西他濱(Gem)一線化療藥物存在一定的耐藥性。因考慮到研發(fā)新型高效的抗腫瘤藥物難度大，故采用現(xiàn)有藥物提高轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者化療效果是目前研究人員的主要研究方向。近年研究[4]發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)抑素(SST)具有抗腫瘤作用，其中就包括對(duì)肝癌等的增殖抑制作用。人胰腺癌細(xì)胞株AsPC-1源自于轉(zhuǎn)移性胰腺癌細(xì)胞，SST對(duì)AsPC-1細(xì)胞的增殖是否有影響國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。本研究觀察了SST聯(lián)合Gem對(duì)AsPC-1細(xì)胞增殖的影響，旨在為臨床尋找治療轉(zhuǎn)移性胰腺癌更有效的化療方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物及試劑 AsPC-1細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))，注射用SST(揚(yáng)子江集團(tuán)藥業(yè)有限公司)，Gem(揚(yáng)子江集團(tuán)藥業(yè)有限公司)，四氮甲唑蘭(MTT，MP Biomedicals公司)，DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(美國(guó)Sigma公司)，胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)。

1.2 AsPC-1細(xì)胞培養(yǎng) AsPC-1細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基包含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、50 μL/mL青霉素和100 μL/mL鏈霉素雙抗。細(xì)胞置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中，待生長(zhǎng)良好后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AsPC-1細(xì)胞，胰酶消化后制成細(xì)胞懸液；利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板將細(xì)胞密度調(diào)整約為5×104細(xì)胞/mL，按照每孔約5 000細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中；37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后細(xì)胞貼壁。取細(xì)胞分別進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.3 SST對(duì)AsPC-1細(xì)胞增殖的影響觀察 將AsPC-1細(xì)胞分別加入濃度為0、100、200、400、600、800 μg/mL的SST以加入0 μg/mL SST的細(xì)胞為對(duì)照組，其余濃度為實(shí)驗(yàn)組，處理24、48、72 h；每種濃度各為5復(fù)孔。平行培養(yǎng)以上時(shí)間后小心吸去孔內(nèi)反應(yīng)液，無(wú)菌PBS洗去殘留液2次，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL及相應(yīng)培養(yǎng)液至100 μL，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h；小心吸干每孔MTT的培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，室溫?fù)u床上震蕩5～10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度值(OD值)，細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值。由以上結(jié)果計(jì)算出SST半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.4 Gem對(duì)AsPC-1細(xì)胞增殖的影響觀察 將AsPC-1細(xì)胞分別加入0、0.1、1、5、10、20、40、60 μmol/L的Gem，處理時(shí)間按1.3中SST IC50時(shí)間進(jìn)行；每種濃度各為5復(fù)孔。平行培養(yǎng)以上時(shí)間后小心吸去孔內(nèi)反應(yīng)液，無(wú)菌PBS洗去殘留液2次，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL及相應(yīng)培養(yǎng)液至100 μL，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h；小心吸干每孔MTT的培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，室溫?fù)u床上震蕩5～10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的OD值，細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值；由以上結(jié)果計(jì)算出Gem IC50。

1.5 SST聯(lián)合Gem對(duì)AsPC-1細(xì)胞增殖的影響觀察 根據(jù)1.3和1.4實(shí)驗(yàn)得出的SST、Gem IC50，將細(xì)胞進(jìn)行分組，A組不做任何處理，B組加入SST IC50，C組加入Gem IC50，D組加入1/2 SST IC50+1/2 Gem IC50，處理時(shí)間按SST IC50時(shí)間進(jìn)行。每種濃度各為5復(fù)孔。平行培養(yǎng)以上時(shí)間后小心吸去孔內(nèi)反應(yīng)液，無(wú)菌PBS洗去殘留液2次，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL及相應(yīng)培養(yǎng)液至100 μL，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心吸干每孔MTT的培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，室溫?fù)u床上震蕩5～10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的OD值，細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值。按公式計(jì)算兩藥相互作用：q=兩藥聯(lián)合抑制率/兩藥單用抑制率之和-兩藥單用抑制率之積。q<0.85，兩藥拮抗作用；0.85≤q≤1.15，兩藥相加作用；q>1.15，兩藥協(xié)同作用。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度SST作用于AsPC-1細(xì)胞增殖抑制率比較 結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，AsPC-1細(xì)胞在SST濃度為600 μg/mL處理48 h后，達(dá)到半數(shù)抑制。

表1 不同濃度SST作用于AsPC-1細(xì)胞增殖抑制率比較

注：與0 μg/mL SST比較，★P<0.05；與上一濃度比較，☆P<0.05。

2.2 不同濃度Gem作用于AsPC-1細(xì)胞增殖抑制率比較 0、0.1、1、5、10、20、40、60作用于AsPC-1細(xì)胞增殖抑制率分別為0.00%±2.49%、28.33%±5.88%、32.53%±7.41%、37.58%±7.20%、44.09%±7.36%、49.72%±6.18%、83.50%±0.36%、87.88%±5.89%，其余各濃度組與0 μmol/L的Gem組比較,P均<0.05；20、40 μmol/L Gem組比較，P均<0.05。由以上結(jié)果可知，AsPC-1細(xì)胞在Gem濃度為20 μmol/L時(shí)達(dá)到半數(shù)抑制。

2.3 SST聯(lián)合Gem作用于AsPC-1細(xì)胞增殖抑制率比較 A、B、C、D組細(xì)胞增殖抑制率分別為0.00%±3.79%、52.59%±4.57%、48.11%±10.93%、64.86%±4.83%，B、C、D組分別與A組比較，B、C組分別與D組比較，P均<0.05。經(jīng)公式計(jì)算，兩藥相互作用q=0.87，表明聯(lián)合用藥具有相加作用。

3 討論

胰腺癌是惡性程度、致死率極高的消化系腫瘤，被稱為“癌中之王”[5]。由于胰腺癌在早期無(wú)明顯癥狀、體征，并且缺乏有效的早期篩查和診斷方法，80%以上患者就診時(shí)已伴有淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，喪失手術(shù)切除機(jī)會(huì)，并且轉(zhuǎn)移性胰腺癌5年生存率<5%[6]。盡管過(guò)去的數(shù)十年內(nèi)，研究者對(duì)胰腺癌的治療提出了很多新的方法，但是外科手術(shù)治療聯(lián)合化療仍是目前治療胰腺癌的最佳方式，但這僅能使20%的患者獲益[7]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約有超過(guò)40%的胰腺癌患者雖無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，但伴有廣泛的血管及淋巴結(jié)侵犯，而不能接受及時(shí)的手術(shù)治療[8]。故化療仍是轉(zhuǎn)移性胰腺癌或胰腺癌晚期患者首選。胰腺癌預(yù)后差的主要原因是早期極易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移[9]，且胰腺癌細(xì)胞對(duì)一線化療藥Gem存在耐藥性，是最終導(dǎo)致治療失敗的關(guān)鍵所在[10,11]。

Gem是治療轉(zhuǎn)移性胰腺癌的最佳一線化療藥物，但由于它在細(xì)胞內(nèi)的代謝過(guò)程復(fù)雜，有多種相關(guān)蛋白和因子的參與，極易產(chǎn)生耐藥性[12,13]。由于化療耐藥性的存在，現(xiàn)如今提倡聯(lián)合用藥對(duì)轉(zhuǎn)移性胰腺癌進(jìn)行更有效的化療，并且取得了顯著效果。最新NCCN胰腺癌治療指南提出了一些新的聯(lián)合化療方案[14]：①遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胰腺癌：Gem聯(lián)合白蛋白結(jié)合型紫杉醇方案被列為推薦方案；②新輔助治療方案：Gem聯(lián)合白蛋白結(jié)合型紫杉醇方案；③復(fù)發(fā)性胰腺癌治療方案：Gem聯(lián)合白蛋白結(jié)合型紫杉醇方案等。故如今尋找有效的聯(lián)合化療方案有重要的意義。SST是從羊和豬的下丘腦提取液中分離和鑒定的一種生長(zhǎng)激素釋放抑制激素，能強(qiáng)烈抑制垂體分泌生長(zhǎng)激素，常用于胰腺手術(shù)后、急性胰腺炎、胃泌素瘤、胰島素瘤等的治療。近期研究發(fā)現(xiàn)，SST及其類似物具有多種抗腫瘤作用，主要表現(xiàn)為直接與受體結(jié)合激活cAMP途徑、蛋白磷酸酶途徑等抑制腫瘤增殖[15]，或間接抑制促腫瘤生長(zhǎng)的激素或細(xì)胞因子的釋放、腫瘤血管生成等[16]。Berindan-Neagoe等[17]發(fā)現(xiàn)，高濃度SST對(duì)胰腺癌細(xì)胞具有抑制作用，并與濃度呈依賴關(guān)系，而且對(duì)凋亡亦有促進(jìn)作用。同時(shí)SST類似物對(duì)轉(zhuǎn)染SST2R的胰腺癌細(xì)胞可下調(diào)Survivin的表達(dá)量[18]，可增強(qiáng)SST對(duì)胰腺癌細(xì)胞株的殺傷力[19]。并且有研究報(bào)道[20，21]，SST與腫瘤化療藥物具有協(xié)同效應(yīng)，能夠增強(qiáng)多種消化道腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性，以致增加療效。但目前國(guó)內(nèi)外鮮有關(guān)于SST與Gem聯(lián)合用藥治療轉(zhuǎn)移性胰腺癌細(xì)胞的研究，故本實(shí)驗(yàn)中選取SST作為研究對(duì)象，觀察其是否能夠協(xié)同Gem抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖作用。

本研究顯示，A、B、C、D組細(xì)胞增殖抑制率分別為0.00%±3.79%、52.59%±4.57%、48.11%±10.93%、64.86%±4.83%，B、C、D組分別與A組比較，B、C組分別與D組比較，P均<0.05。提示SST和Gem均能抑制胰腺癌AsPC-1細(xì)胞增殖，但SST與Gem聯(lián)用抑制率明顯大于單藥。表明聯(lián)合用藥具有相加作用，能有效地提高Gem化療效果。

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EffectofsomatostatincombinedwithgemcitabineonproliferationofhumanmetastaticpancreaticcancercelllineAsPC-1

LIULi1,RAOQisuo,LEIChangbin,WANGWenting,PENGZhao,KUANGXingxing,LIUGuowen

(1AffiliatedHospitalofXiangnanUniversity,Chenzhou423000,China)

ObjectiveTo observe the effect of combined therapy with somatostatin (SST) and gemcitabine (Gem) on the proliferation of human metastatic pancreatic cancer AsPC-1 cells.MethodsThe AsPC-1 cells were cultured in vitro. ① The cells were treated with 0, 100, 200, 400, 600, and 800 μg/mL SST for 24, 48, and 72 h, then we calculated the IC50of SST. ② The cells were treated with 0, 0.1, 1 5, 10, 20, 40, and 60 μmol/L Gem for 48 h, and we calculated the IC50of Gem. After that, AsPC-1 cells were divided into four groups: an untreated control group (group A), a group treated with SST at IC50(group B), a group treated with Gem at IC50(group C), and a group treated with SST+Gem at half of their IC50(group D). At 48 h after treatment, the inhibition rates were calculated.ResultsFor AsPC-1 cells, IC50of SST was 600 μg/mL at 48 h, and IC50of Gem was 20 μmol/L. The inhibition rates in the groups A, B, C and D were 0.00%±3.79%, 52.59%±4.57%, 48.11%±10.93%, and 64.86%±4.83%, respectively. The cell growth was significantly inhibited in the groups B, C, and D as compared with that of group A (P<0.05), and the inhibition rate was significantly higher in the group D than in the groups B and C (P<0.05).ConclusionThe combination of SST and Gem can inhibit the growth of AsPC-1 cells.

somatostatin; gemcitabine; metastatic pancreatic cancer cells AsPC-1

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.47.003

R735

A

1002-266X(2017)47-0009-04

湖南省教育廳資助科研項(xiàng)目(16C1487)。

劉力(1983-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向?yàn)楦文懸饶[瘤的防治。E-mail: 276016958@qq.com

劉國(guó)文(1969-)，男，博士，碩士生導(dǎo)師，教授，主要研究方向?yàn)槠胀饽[瘤的防治。E-mail： lgw8318@yahoo.com.cn

2017-08-29)

·作者·編者·讀者·

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活體組織檢查(活檢)