杉木遺傳轉(zhuǎn)化中抗生素種類和濃度的篩選

薛 爽，葉義全，2，饒麗莎，左丹丹，汪鳳林，林思祖，2，許珊珊，2*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福州 350002；2.國家林業(yè)局杉木工程技術(shù)研究中心，福州 350002）

杉木遺傳轉(zhuǎn)化中抗生素種類和濃度的篩選

薛 爽1，葉義全1，2，饒麗莎1，左丹丹1，汪鳳林1，林思祖1，2，許珊珊1，2*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福州 350002；2.國家林業(yè)局杉木工程技術(shù)研究中心，福州 350002）

【目的】篩選適用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杉木遺傳轉(zhuǎn)化的抗生素種類和濃度，為杉木遺傳轉(zhuǎn)化體系建立提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳陨寄窘M培苗莖段和嫩芽為材料，探討了潮霉素、卡那霉素和頭孢霉素對(duì)其生長的影響以及對(duì)農(nóng)桿菌GV3101的抑菌效果?！窘Y(jié)果】潮霉素濃度為40 mg/L和60 mg/L時(shí)，杉木嫩芽和莖段培養(yǎng)42 d存活率分別為8.78%、13.97%和7.05%、5.93%，表現(xiàn)出良好的效果；80 mg/L時(shí)，其生長完全被抑制?？敲顾貪舛葹?00 mg/L時(shí)，杉木嫩芽和莖段在80 d時(shí)存活率仍高達(dá)75.04%和80.37%。300 mg/L的抗生素抑菌劑頭孢霉素能有效抑制農(nóng)桿菌GV3101生長，且該濃度下杉木嫩芽及莖段增殖效果良好?！窘Y(jié)論】在以杉木嫩芽和莖段為受體材料的遺傳轉(zhuǎn)化體系中，40～60 mg/L和60～80 mg/L的潮霉素可作為杉木遺傳轉(zhuǎn)化抗性苗二次篩選的選擇壓，300 mg/L頭孢霉素可作為農(nóng)桿菌GV3101的抑菌濃度。

杉木；遺傳轉(zhuǎn)化；抗生素；農(nóng)桿菌

杉木（Cunninghamia lanceolata Hook）是我國南方最重要速生用材樹種之一，因其具有材質(zhì)優(yōu)良和速生豐產(chǎn)等特點(diǎn)而被廣泛種植[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前杉木人工林栽植面積已達(dá)1 100多萬hm2，木材產(chǎn)量占全國商品材產(chǎn)量的1/4，在保障我國物質(zhì)安全、生態(tài)安全等方面具有重要作用[2]。然而，長期林業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐表明，杉木連栽導(dǎo)致林分生產(chǎn)力下降問題日益突出。引起杉木連栽產(chǎn)量下降的原因眾多，其中鋁毒害被認(rèn)為是主要原因之一[3-4]。因而，利用基因工程手段改良杉木耐鋁毒能力，增加酸性土壤上杉木產(chǎn)量，是實(shí)現(xiàn)杉木用材林可持續(xù)發(fā)展的當(dāng)務(wù)之急。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是獲得改良的植物品種的主要途徑，目前人們利用轉(zhuǎn)基因手段已獲得許多具有優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因植物[5-7]。穩(wěn)定的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立是獲得轉(zhuǎn)基因植株的前提。然而，在建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系中，篩選適合的抗生素種類和濃度是基因轉(zhuǎn)化成敗的關(guān)鍵，因?yàn)椴煌氖荏w材料對(duì)不同抗生素的敏感程度和毒害的忍耐程度存在較大差異[8]。因此，為取得較好的篩選效果，在轉(zhuǎn)化之前有必要開展抗生素種類和濃度篩選試驗(yàn)。本研究分別以杉木組培苗莖段和嫩芽為研究對(duì)象，比較分析不同抗生素種類及濃度對(duì)杉木莖段和嫩芽生長的影響，以期確定在杉木遺傳轉(zhuǎn)化中這些抗生素的適宜篩選濃度，為杉木遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為國家林業(yè)局杉木工程技術(shù)研究中心保存的杉木組培苗105。取其頂部莖段（切去莖尖）及新萌發(fā)的嫩芽用于杉木遺傳轉(zhuǎn)化中抗生素種類和濃度篩選。

1.2 方法

1.2.1 抗生素下杉木組培苗莖段及嫩芽生長試驗(yàn)

杉木組培苗105的頂部莖段（用手術(shù)刀片切去莖尖）及新萌發(fā)的嫩芽分別接種于含不同濃度的潮霉素（0、10、20、40、60、80、100 mg/L）、卡那霉素（0、3、5、7、9、50、100 mg/L）及頭孢霉素（0、50、100、150、200、250、300 mg/L）的誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+0.3 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+3%蔗糖，pH5.8。每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接種4株，3次重復(fù)。培養(yǎng)條件為光照12 h/d、光強(qiáng)1 800 Lx、培養(yǎng)溫度（25±2）℃。接種后，分別在35、42和80 d統(tǒng)計(jì)死亡率和枯萎率。死亡率=死亡株數(shù)/（接種總株數(shù)-污染株數(shù)）×100%；枯萎率=枯萎株數(shù)/（接種總株數(shù)-污染株數(shù)）×100%。

1.2.2 頭孢霉素對(duì)農(nóng)桿菌GV3101的抑菌試驗(yàn)

取15 μL活化過的農(nóng)桿菌GV3101菌液，在含50 mg/L利福平和300 mg/L頭孢霉素的YEB平板上劃菌，共進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，每次劃20個(gè)平板，共60個(gè)平板，于28℃的環(huán)境中倒扣培養(yǎng)48 h，觀察農(nóng)桿菌生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同潮霉素濃度對(duì)杉木嫩芽和莖段生長的影響

由表1可知，隨著潮霉素濃度的增加，杉木嫩芽及莖段的存活率均逐漸降低。從表2可知，在培養(yǎng)35 d時(shí)，一定的潮霉素濃度范圍內(nèi)（0～60 mg/L），嫩芽和莖段的存活率差異并不明顯，而當(dāng)潮霉素濃度高于60 mg/L時(shí)，莖段存活率顯著低于嫩芽，特別是當(dāng)潮霉素濃度為100 mg/L時(shí)，嫩芽和莖段存活率均達(dá)到最低值分別為50.25%和16.14%。繼續(xù)培養(yǎng)至42 d，各潮霉素濃度下嫩芽和莖段存活率均進(jìn)一步降低。其中當(dāng)潮霉素為40 mg/L時(shí)，嫩芽及莖段存活率僅為8.78%和13.97%；當(dāng)潮霉素濃度繼續(xù)增至60 mg/L時(shí)，嫩芽及莖段存活率則繼續(xù)降至7.05%和5.93%，直至潮霉素濃度為80 mg/L時(shí)，杉木嫩芽及莖段的生長完全被抑制。由此可見，杉木不同部位材料對(duì)潮霉素濃度的敏感性和毒害的耐受性存在一定的差異。同時(shí)，通過觀察我們還發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)前35 d對(duì)杉木嫩芽及莖段生長的影響效果并不理想，當(dāng)培養(yǎng)至42 d時(shí)，其對(duì)杉木嫩芽及莖段生長的影響效果顯著。由于過高濃度會(huì)使杉木嫩芽和莖段生長完全受抑，影響轉(zhuǎn)化，而低濃度又會(huì)增加假陽性概率。因此，利用杉木組培苗105嫩芽和莖段作為受體材料進(jìn)行二次篩選過程中，40～60 mg/L和60～80 mg/L的潮霉素可分別作為第一次和第二次篩選的適宜濃度，42 d可作為杉木轉(zhuǎn)化苗篩選時(shí)間。

2.2 不同卡那霉素濃度對(duì)杉木嫩芽和莖段生長的影響

轉(zhuǎn)化植株在含有卡那霉素培養(yǎng)基上的生長情況是篩選與檢測(cè)目的基因轉(zhuǎn)化成功與否的重要依據(jù)。通過分析不同濃度的卡那霉素對(duì)杉木嫩芽和莖段存活率的影響，結(jié)果表明（表3），隨著卡那濃度的增加，杉木嫩芽和莖段的存活率逐漸下降。方差分析結(jié)果顯示不同濃度卡那霉素對(duì)杉木嫩芽和莖段生長的影響存在極顯著差異（表4）。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)在低濃度（＜10 mg/L）條件下杉木嫩芽和莖段對(duì)卡那霉素的反應(yīng)比潮霉素敏感，卡那濃度為9 mg/L時(shí)，培養(yǎng)35 d的杉木嫩芽及莖段存活率僅分別為84.38%和86.24%，低于10mg/L濃度下潮霉素的存活率（95.3%和90.66%）；而當(dāng)卡那霉素濃度增加到100 mg/L時(shí)，杉木嫩芽及莖段存活率仍達(dá)到75.04%和80.37%，遠(yuǎn)高于同濃度下潮霉素的存活率（50.25%和16.14%）；繼續(xù)延長培養(yǎng)至80 d杉木嫩芽和莖段存活率仍為75.04%和80.37%，而在同濃度的潮霉素下杉木嫩芽和莖段的存活率在42 d時(shí)就已為0%，表明杉木嫩芽和莖段對(duì)高濃度卡那霉素比較耐受，其反應(yīng)較為遲鈍。因此，卡那霉素不適宜作為遺傳轉(zhuǎn)化過程中有效的抗生素篩選劑。此外，研究還表明不同培養(yǎng)天數(shù)對(duì)嫩芽和莖段存活率沒有影響，該結(jié)果間接證實(shí)相對(duì)于潮霉素而言，卡那霉素對(duì)杉木嫩芽和莖段生長的影響較小，不適宜作為抗生素篩選劑。

表1 不同潮霉素濃度對(duì)杉木嫩芽及莖段生長的影響Table 1 Effects of different concentrations of hygromycin on the growth of shoots and stems of C.lanceolata

表2 不同潮霉素濃度下杉木嫩芽及莖段存活率的方差分析Table 2 The variance analysis of the survival rate in shoots and stems of C.lanceolata under different concentrations of hygromycin

2.3 頭孢霉素對(duì)杉木嫩芽和莖段生長的影響

在遺傳轉(zhuǎn)化過程中，選擇既不影響受體材料生長又可有效抑制農(nóng)桿菌生長的抑菌劑濃度是獲得較高遺傳轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵。因此，本試驗(yàn)分析了不同頭孢霉素濃度對(duì)杉木嫩芽及莖段生長的影響。結(jié)果表明（表5），與潮霉素和卡那霉素相比，頭孢霉素對(duì)杉木嫩芽和莖段生長的影響相對(duì)較小。隨著頭孢霉素濃度的增加杉木嫩芽和莖段的存活率逐漸上升，當(dāng)頭孢霉素濃度達(dá)300 mg/L時(shí)，杉木嫩芽及莖段的存活率均為最高，分別為97.92%和100.00%。與卡那霉素類似，頭孢霉素對(duì)不同培養(yǎng)天數(shù)下杉木嫩芽和莖段存活率沒有影響。對(duì)不同濃度頭孢霉素的存活率進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（表6）結(jié)果表明，不同濃度頭孢霉素對(duì)杉木嫩芽存活率存在顯著影響，而對(duì)杉木莖段存活率的影響并不顯著。此外，在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)頭孢霉素濃度為100～200 mg/L時(shí)，杉木嫩芽及莖段出現(xiàn)基部膨大現(xiàn)象，且新長出的杉木苗矮小并有白化現(xiàn)象[圖 1（a）、圖 1（b）、圖 1（e）、圖 1（f）]；當(dāng)頭孢霉素濃度繼續(xù)增加到250～300 mg/L時(shí)，杉木嫩芽及莖段增殖效果良好，且新長出的杉木苗呈深綠色，長勢(shì)良好[圖 1（c）、圖 1（d）、圖 1（g）、圖 1（h）]。因此，可選擇300 mg/L的頭孢霉素繼續(xù)分析其對(duì)農(nóng)桿菌的抑菌效果，進(jìn)而確定其是否可以作為杉木遺傳轉(zhuǎn)化過程中頭孢霉素的抑菌濃度。

表3 不同卡那濃度對(duì)杉木嫩芽及莖段生長的影響Table 3 Effects of different concentrations of kanamycin on the growth of shoots and stems of C.lanceolata

表4 不同卡那濃度下杉木嫩芽及莖段存活率的方差分析Table 4 The variance analysis of the survival rate in shoots and stems of C.lanceolata under different concentrations of kanamycin

2.4 頭孢霉素對(duì)農(nóng)桿菌GV30101的抑菌試驗(yàn)

在確定300 mg/L的頭孢霉素對(duì)杉木嫩芽及莖段生長影響較小，且長勢(shì)良好后，將活化過的農(nóng)桿菌GV3101在含50 mg/L利福平和300 mg/L頭孢霉素的YEB平板進(jìn)行劃菌，28℃下培養(yǎng)48 h后，發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌GV3101的生長完全被抑制。因此，在杉木遺傳轉(zhuǎn)化過程中，300 mg/L頭孢霉素可作為農(nóng)桿菌GV3101的抑菌濃度。

3 討論

在植物遺傳轉(zhuǎn)化過程中，一般要求選擇抗生素的種類和濃度既要能有效抑制非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長，又不影響轉(zhuǎn)化細(xì)胞的正常生長[9]。由于不同受體材料對(duì)不同種類和濃度的抗生素敏感程度和毒害的耐受程度存在較大差異，確定適宜的選擇抗生素種類和濃度對(duì)獲得轉(zhuǎn)基因植株至關(guān)重要?？股氐倪x擇與遺傳轉(zhuǎn)化中所用載體所帶抗性基因密切相關(guān)，潮霉素和卡那霉素是遺傳轉(zhuǎn)化常用的抗生素標(biāo)記基因，研究表明潮霉素是一種很好的選擇抗生素，對(duì)未轉(zhuǎn)化材料的影響效果顯著[10]。李文蘭等[11]報(bào)道，羅漢果子葉不定芽分化的潮霉素選擇壓為25 mg/L，葡萄風(fēng)信子胚性愈傷組織的潮霉素選擇壓為90 mg/L[12]?？梢?，不同受體材料對(duì)潮霉素的敏感性差異較大。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，40 mg/L的潮霉素培養(yǎng)42 d時(shí)，杉木嫩芽及莖段存活率僅為8.78%和13.97%；當(dāng)潮霉素濃度繼續(xù)增至60 mg/L和80 mg/L時(shí)，杉木嫩芽及莖段存活率持續(xù)下降，直至其生長完全被抑制。因此，可將40～60 mg/L和60～80 mg/L的潮霉素分別作為杉木遺傳轉(zhuǎn)化過程中轉(zhuǎn)化苗第一次和第二次篩選的選擇壓。

表5 不同頭孢霉素濃度對(duì)杉木嫩芽及莖段生長的影響Table 5 Effects of different concentrations of cephalosporin on the growth of shoots and stems of C.lanceolata

表6 不同頭孢霉素濃度下杉木嫩芽及莖段存活率的方差分析Table 6 The variance analysis of the survival rate in shoots and stems of C.lanceolata under different concentrations of cephalosporin

卡那霉素作為另一種常用的選擇抗生素，其濃度范圍也常因受體材料的品種、部位的不同而有所不同。席夢(mèng)利等[13]研究發(fā)現(xiàn)低濃度的卡那霉素對(duì)杉木莖段芽的誘導(dǎo)產(chǎn)生顯著影響，8 mg/L卡那霉素完全抑制杉木芽生根。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)卡那濃度為100 mg/L時(shí)，對(duì)杉木嫩芽和莖段生長的影響還比較小，不適宜作為杉木遺傳轉(zhuǎn)化苗的抗性篩選，與席夢(mèng)利的研究結(jié)果相反，可能與所用的杉木品種不同有關(guān)。

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化過程中，頭孢霉素常用作抑菌劑，用來抑制農(nóng)桿菌的大量繁殖，同時(shí)還應(yīng)保證不影響植物正常生長。因此，選擇適宜的頭孢霉素濃度至關(guān)重要。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，300 mg/L的頭孢霉素能有效抑制農(nóng)桿菌GV3101生長，且在該濃度下杉木嫩芽及莖段增殖效果良好，新長出的杉木苗呈深綠色，長勢(shì)良好。因此，300 mg/L頭孢霉素可作為杉木遺傳轉(zhuǎn)化過程中農(nóng)桿菌GV3101的抑菌濃度。此外，值得注意的是相對(duì)于高濃度頭（孢霉素（250 mg/L和300 g/L）而言，低濃度頭孢霉素（50 mg/L）顯著降低莖段和嫩芽存活率（表5），這可能是外植體在適應(yīng)一定濃度范圍頭孢霉素時(shí)表現(xiàn)出的一種正常波動(dòng)現(xiàn)象。同樣在華北繡線菊再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系建立過程中，張嬌等[14]也發(fā)現(xiàn)當(dāng)頭孢濃度為50 mg/L時(shí)其愈傷分化率為40%，隨著濃度的升高，愈傷分化率逐漸上升并在150 mg/L時(shí)達(dá)到峰值（53%），當(dāng)頭孢濃度繼續(xù)增加，其分化率則呈不可逆的直線下降趨勢(shì)，直到分化率為0%。類似地，在不同抑菌抗生素對(duì)莫利莎葡萄葉片離體再生[15]及鹽稻8號(hào)愈傷組織分化[16]的影響研究中也有發(fā)現(xiàn)這種波動(dòng)現(xiàn)象，由此可見，在抑菌抗生素濃度達(dá)到特定閾值前，其對(duì)植物生長的影響表現(xiàn)出一定的波動(dòng)，當(dāng)其濃度超過特定閾值后對(duì)植物生長才表現(xiàn)出不可逆的顯著抑制作用，而導(dǎo)致這種在一定抑菌抗生素濃度范圍內(nèi)植物生長呈波動(dòng)現(xiàn)象的潛在原因有待進(jìn)一步研究。

本文對(duì)潮霉素、卡那霉素作為杉木轉(zhuǎn)化苗的篩選試劑及頭孢霉素作為農(nóng)桿菌GV3101的抑菌劑進(jìn)行研究，可為杉木遺傳轉(zhuǎn)化過程中提高篩選和鑒定轉(zhuǎn)基因植株提供一定的理論依據(jù)。在后續(xù)的研究過程中，我們將會(huì)在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)杉木的遺傳轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行分析。

圖1 頭孢霉素濃度對(duì)杉木嫩芽及莖段生長的影響Figure 1 Effects of different concentration of cephalosporins on the growth of shoots and stems of C.lanceolata

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Selection of Antibiotic Species and Concentration in Genetic Transformation of Cunninghamia lanceolata Hook

XUEShuang1，YEYi-quan1，2，RAOLi-sha1，ZUODan-dan1，WANGFeng-lin1，LINSi-zu1，2，XUShan-shan1，2*
（1.College of Forestry，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，China；2.State Forestry Administration Engineering Research Center of Chinese Fir，F(xiàn)uzhou 350002，China）

【Objective】The aim of this study was to explore suitable species and concentrations of antibiotics for Cunninghamia lanceolata during the establishment of agrobacterium-mediated genetic transformation system，and to provide a theoretical basis for construction of genetic transformation system of C.lanceolata.【Method】The effects of three different antibiotics(cephalosporin，hygromycin and kanamycin)on stem and shoot growth of tissue-culture seedlings of C.lanceolata and their antibacterial responses to GV3101 were investigated.【Results】When the concentrations of hygromycin were 40 mg/L and 60 mg/L，the survival rates of shoots and stems on 42 days were 8.78%，13.97%，7.05%and 5.93%，respectively.Their growths were totally inhibited when hygromycin concentration was 100 mg/L.In addition，the survival rates of shoots and stems on 80 days were 75.04%and 80.37%，respectively，when kanamycin concentration of was 100 mg/L.300 mg/L antibacterial agent of cephalosporin effectively inhibited the growth of GV3101，and the proliferation of shoots and stems were the best under this concentration.【Conclusion】Taken together，in the transgenic transformation system that shoots and stems of C.lanceolata wereusedasacceptormaterials，40～60mg/Land60～80mg/Lofhygromycinconcentrationcouldbe used as a selection pressure for second screening of resistance seedlings of C.lanceolata and 300 mg/L cephalosporin could be used as an optimal antibacterial concentration for agrobacterium GV3101.

Cunninghamia lanceolata Hook；genetic transformation；antibiotics；agrobacterium

S791.27 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1000-2650（2017）02-0227-07

10.16036/j.issn.1000-2650.2017.02.014

2017-02-24

中央財(cái)政支持地方專項(xiàng)（6213c0111）。

薛爽，碩士生。*責(zé)任作者：許珊珊，碩士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事林木遺傳育種研究，shi_xu_1987@163.com。。

（本文審稿：張 健；責(zé)任編輯：鞏艷紅；英文編輯：徐振鋒）