陳文娟,陳建福,吳麗敏,莊遠(yuǎn)紅
(1.漳州城市職業(yè)學(xué)院食品工程系,福建漳州 363000;2.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系,福建漳州 363000;3.福建省精細(xì)化工應(yīng)用技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心,福建漳州 363000;4.閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,福建漳州 363000)
超聲波輔助纖維素酶提取掃帚菜多糖及其抗氧化研究
陳文娟1,陳建福2,3*,吳麗敏4,莊遠(yuǎn)紅4
(1.漳州城市職業(yè)學(xué)院食品工程系,福建漳州 363000;2.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系,福建漳州 363000;3.福建省精細(xì)化工應(yīng)用技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心,福建漳州 363000;4.閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,福建漳州 363000)
【目的】通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助纖維素酶提取掃帚菜多糖的工藝,評(píng)價(jià)多糖的抗氧化活性?!痉椒ā吭趩我蛩卦囼?yàn)的基礎(chǔ)上,以多糖提取率為響應(yīng)值,選擇酶用量、超聲溫度、超聲時(shí)間和液料比進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì),研究了各工藝條件及其交互作用對(duì)掃帚菜多糖提取率的影響,得到了二次多項(xiàng)式回歸方程模型,并以豬油的抗氧化性能來(lái)評(píng)價(jià)多糖的抗氧化活性。【結(jié)果】掃帚菜多糖的最佳提取工藝條件為:酶用量2.1%、超聲溫度51℃、超聲時(shí)間20 min、液料比25 mL/g,該條件下掃帚菜多糖的提取率為65.93 mg/g,與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.21%。掃帚菜多糖對(duì)豬油有一定的抗氧化能力。【結(jié)論】利用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助纖維素酶提取掃帚菜多糖的工藝有效、可靠,掃帚菜多糖能有效提高豬油產(chǎn)品的貨架期。
超聲輔助;纖維素酶;掃帚菜;多糖;抗氧化
掃帚菜(Kochia scoparia(Linn.)Schrad),又名地膚、地麥、落帚,為藜科一年生草本植物,在我國(guó)各處的荒地、路旁、田邊、村落及庭院內(nèi)均有分布,資源十分豐富[1]。掃帚菜含有多種天然有效成分如黃酮、多酚、多糖等,具有清熱解毒、養(yǎng)心安神等功效,是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的“藥食同源”的保健性野菜[2]。然而目前對(duì)掃帚菜多糖的提取工藝研究的報(bào)道還較少。掃帚菜多糖主要存在于掃帚菜的組織細(xì)胞內(nèi),難于溶出,纖維素酶可以有效地水解掃帚菜細(xì)胞壁上的纖維素,增加細(xì)胞內(nèi)容物進(jìn)出細(xì)胞壁的通透性,且纖維素酶水解過(guò)程無(wú)毒,反應(yīng)條件溫和、催化活力可調(diào)控,是一種高效的輔助提取方法[3]。超聲波是利用空化、機(jī)械和熱效應(yīng)等來(lái)產(chǎn)生擴(kuò)散、攪拌等作用來(lái)提高溶劑進(jìn)出細(xì)胞壁的穿透性,從而避免高溫對(duì)提取物生物活性的破壞[4]。因此,采用超聲波輔助纖維酶法提取,可以在低溫環(huán)境下加速掃帚菜多糖的溶出,具有提取率高且省時(shí)、節(jié)能的特點(diǎn)。本文對(duì)超聲波輔助纖維素酶法提取掃帚菜多糖的工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化,建立掃帚菜多糖提取的新方法,并研究其掃帚菜多糖對(duì)豬油的抗氧化能力,以期為掃帚菜多糖資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與利用提供技術(shù)支持。
掃帚菜:采于漳州市馬鞍山;纖維素酶,食品級(jí)(5萬(wàn)U/g),鄭州萬(wàn)搏化工產(chǎn)品有限公司,其他試劑均為分析純。
KQ-100DE型超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;LGJ10-C型冷凍干燥機(jī),北京四環(huán)科學(xué)儀器廠;UV-1800PC-DS2型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),上海美譜達(dá)儀器有限公司。
將采摘的新鮮掃帚菜嫩葉洗凈,并進(jìn)行冷凍干燥,粉碎,備用。后取1 g樣品按文獻(xiàn)[5]進(jìn)行脫脂脫色干燥,后置于燒瓶中,加入0.02 g的纖維素酶,25 mL的蒸餾水,在50℃的超聲波清洗器中超聲回流20 min,回流結(jié)束后,按文獻(xiàn)[5]進(jìn)行除蛋白及定容,測(cè)試,含量測(cè)完后,進(jìn)行醇沉,烘干,得掃帚菜多糖。
掃帚菜多糖含量按文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)行測(cè)定,多糖的提取率由下式計(jì)算:
在6個(gè)150 mL的燒杯中,各加入50 g的豬油,再分別加入 0、0.01%、0.02%、0.05%、0.10%的掃帚菜多糖和0.05%的特丁基對(duì)苯二酚(TBHQ),按文獻(xiàn)[6]方法進(jìn)行抗氧化能力測(cè)試。
掃帚菜多糖的提取主要考察5個(gè)單因素(加酶量、超聲溫度、超聲時(shí)間、超聲功率和液料比對(duì)多糖提取率的影響,每個(gè)因素做3次平行實(shí)驗(yàn),取平均值。
響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以掃帚菜多糖提取率為指標(biāo),設(shè)計(jì)酶用量(A)、超聲溫度(B)、超聲時(shí)間(C)和液料比(D)4因素3水平共29個(gè)實(shí)驗(yàn),各因素與水平編碼如表1。
表1 因素與水平編碼表Table 1 Code table of factors and levels'
固定超聲溫度50℃,超聲時(shí)間20 min,超聲功率90 W,液料比25 mL/g,考察酶用量分別1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%時(shí)對(duì)多糖提取率的影響,如圖1所示。由圖1可知,在酶用量為2.0%時(shí),掃帚菜多糖提取率達(dá)到最大值65.89 mg/g。這是由于酶用量的增加,促進(jìn)了纖維素酶與底物的接觸,使得掃帚菜顆粒細(xì)胞壁的破損,增加了細(xì)胞膜的通透性,使得多糖更容易溶出,而當(dāng)酶用量過(guò)大時(shí),會(huì)造成掃帚菜顆粒被包裹在纖維素酶里面[7-8],而無(wú)法使得多糖進(jìn)入溶劑中,造成了多糖提取率的下降,因此酶用量選擇為2.0%。
圖1 酶用量對(duì)多糖提取率的影響Figure 1 Effects of cellulase amount on extraction yield of polysaccharides
固定酶用量2.0%,超聲時(shí)間20 min,超聲功率90 W,液料比25 mL/g,考察超聲溫度分別為40、45、50、55、60、65、70、75、80 ℃時(shí)對(duì)多糖提取率的影響,如圖2所示。由圖2可知,在超聲溫度為50℃時(shí),掃帚菜多糖提取率達(dá)到最大值65.89 mg/g,超聲溫度大于50℃時(shí),掃帚菜多糖提取率又開(kāi)始下降,而超聲溫度超過(guò)60℃后,提取率又開(kāi)始增加,在70℃時(shí)出現(xiàn)了極大值57.24 mg/g。這是由于隨著溫度的升高,纖維素酶的活力增加,加快了酶與底物的作用,使得多糖更容易地溶出。而當(dāng)溫度超過(guò)50℃時(shí),纖維素酶活力下降,而使得多糖提取率下降。但當(dāng)超聲溫度超過(guò)60℃時(shí),隨著溫度的升高,加快溶劑與掃帚菜顆粒的碰撞與破壞,促進(jìn)了多糖的溶出[9],而超聲溫度超過(guò)70℃,溫度太高,部分耐熱性差的多糖會(huì)發(fā)生分解[10],使得多糖提取率下降,因此超聲溫度選擇為50℃。
圖2 超聲溫度對(duì)多糖提取率的影響Figure 2 Effects of ultrasonic temperature on extraction yield of polysaccharides
固定酶用量2.0%,超聲溫度50℃,超聲功率90 W,液料比 25 mL/g,考察超聲時(shí)間分別 10、15、20、25、30 min時(shí)對(duì)多糖提取率的影響,如圖3所示。由圖3可知,在超聲時(shí)間為20 min時(shí),掃帚菜多糖提取率達(dá)到最大值65.89 mg/g。這是由于超聲時(shí)間的增加,增加了掃帚菜顆粒與溶劑的作用時(shí)間,使得多糖溶出更加充分,而超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí),部分多糖結(jié)構(gòu)會(huì)受到破壞[11],使得多糖提取率下降。因此超聲時(shí)間選擇為20 min。
圖3 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Figure 3 Effects of ultrasonic time on extraction yield of polysaccharides
固定酶用量2.0%,超聲溫度50℃,超聲時(shí)間20 min,液料比 25 mL/g,考察超聲功率分別 60、70、80、90、100 W時(shí)對(duì)多糖提取率的影響,如圖4所示。由圖4可知,在超聲功率90 W時(shí),掃帚菜多糖提取率達(dá)到最大值65.89 mg/g。這是由于超聲功率的增加,增大了超聲的空化及機(jī)械攪拌作用,促進(jìn)了多糖的溶出,而超聲功率過(guò)大時(shí),容易造成提取系統(tǒng)局部瞬時(shí)過(guò)熱,從而造成多糖分子鏈的斷裂,因此超聲功率選擇為90 W。
圖4 超聲功率對(duì)多糖提取率的影響Figure 4 Effects of ultrasonic power on extraction yield of polysaccharides
固定酶用量2.0%,超聲溫度50℃,超聲時(shí)間20 min,超聲功率90 W,考察液料比分別15、20、25、30、35 mL/g時(shí)對(duì)多糖提取率的影響,如圖5所示。由圖5可知,在液料比為25 mL/g時(shí),掃帚菜多糖提取率達(dá)到最大值65.89 mg/g。這是由于液料比的增大,增加了提取體系的溶劑量,使得掃帚菜顆粒與多糖間的濃度梯度增加,促進(jìn)了多糖的溶出,而當(dāng)溶劑量過(guò)大時(shí),掃帚菜顆粒會(huì)溶出更多的雜質(zhì)參與多糖溶出競(jìng)爭(zhēng)[12],使得多糖提取率的下降,因此液料比選擇為25 mL/g。
圖5 液料比對(duì)多糖提取率的影響Figure 5 Effects of liquid-material ratio on extraction yield of polysaccharides
根據(jù)DesignExpert8.05b軟件中的Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,在單因素的基礎(chǔ)上,以掃帚菜多糖提取率為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)了酶用量(A)、超聲溫度(B)、超聲時(shí)間(C)和液料比(D)四因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。具體實(shí)驗(yàn)方案如表2所示,分析結(jié)果如表3所示。
表2 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Benhnken design and result
續(xù)表(2)
表3 回歸模型的分析結(jié)果Table 3 Analysis results of regression
根據(jù)表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,進(jìn)行分析,得到酶用量(A)、超聲溫度(B)、超聲時(shí)間(C)和液料比(D)對(duì)掃帚菜多糖提取率(Y)的四元二次回歸方程:
從回歸模型的方差分析結(jié)果(表3)中可以看出,該回歸方程F=15.33,P<0.000 1,回歸方程極顯著;回歸模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.938 8,說(shuō)明有93%以上的數(shù)據(jù)可以用該模型來(lái)描述響應(yīng)值的變化。而失擬項(xiàng) F=5.07,P=0.065 7>0.05,不顯著,說(shuō)明該回歸方程對(duì)實(shí)驗(yàn)的真實(shí)值擬合情況好,綜上分析,利用該模型方程來(lái)對(duì)實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)進(jìn)行分析與預(yù)測(cè)是可靠的。回歸方程中一次項(xiàng) A、B、D,交互項(xiàng) BC、BD,二次項(xiàng) A2、B2、C2、D2對(duì)多糖提取率影響極顯著;一次項(xiàng)C,對(duì)多糖提取率影響顯著;交互項(xiàng)AB、AC、AD、CD對(duì)多糖提取率影響不顯著,說(shuō)明酶用量、超聲溫度、超聲時(shí)間和液料比等工藝與多糖提取率之間不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。方差分析表中的F值及P值可以看出,影響掃帚菜多糖提取率的因子主次順序?yàn)椋築>D>A>C,即超聲溫度>液料比>酶用量>超聲時(shí)間。
通過(guò)Design-Expert 8.05b軟件繪制了響應(yīng)面和等高線圖,如圖6~圖11所示。圖中反映了酶用量、超聲溫度、超聲時(shí)間和液料比4個(gè)因素中任意2個(gè)因素取零水平時(shí),剩下兩因素之間的交互作用對(duì)掃帚菜多糖提取率的影響程度。
由圖6可知,酶用量和超聲溫度交互作用不顯著,掃帚菜多糖隨著酶用量的增加和超聲溫度的升高均出現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。
由圖7可知,液料比和超聲溫度交互作用不顯著,掃帚菜多糖提取率隨著液料比的增加和超聲溫度的升高均出現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。
由圖8可知,酶用量和液料比的交互作用不顯著,掃帚菜多糖提取率隨著酶用量的增加和液料比的增大均出現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)。
由圖9可知,超聲溫度和超聲時(shí)間交互作用顯著,表現(xiàn)為當(dāng)超聲溫度較小時(shí),超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響較大,最初隨著超聲溫度的升高,掃帚菜多糖提取率迅速增大,而后隨著超聲溫度的升高反而又開(kāi)始下降。
由圖10可知,超聲溫度和液料比交互作用顯著,表現(xiàn)為當(dāng)超聲溫度較小時(shí),液料比對(duì)掃帚菜多糖的提取率影響較大,最初隨著超聲溫度的升高,掃帚菜多糖提取率迅速增大,而后隨著超聲溫度的升高反而又開(kāi)始下降。
由圖11可知,超聲時(shí)間和液料比交互作用不顯著,掃帚菜多糖提取率隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)和液料比的增大均出現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)。
圖6 酶用量和超聲溫度對(duì)多糖提取率的影響Figure 6 Effects of cellulase amount and ultrasonic temperature on extraction yield of polysaccharides
圖7 酶用量和超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Figure 7 Effects of cellulase amount and ultrasonic time on extraction yield of polysaccharides
圖8 酶用量和液料比對(duì)多糖提取率的影響Figure 8 Effects of cellulase amount and liquid-material ratio on extraction yield of polysaccharides
圖9 超聲溫度和超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Figure 9 Effects of ultrasonic temperature and time on extraction yield of polysaccharides
圖10 超聲溫度和液料比對(duì)多糖提取率的影響Figure 10 Effects of ultrasonic temperature and liquid-material ratio on extraction yield of polysaccharides
根據(jù)Design Expert 8.05b軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析,得到超聲波輔助纖維素酶提取掃帚菜多糖的最佳工藝條件為:酶用量2.11%,超聲溫度50.81℃、超聲時(shí)間20.47 min和液料比25.55 mL/g,此時(shí)掃帚菜多糖的預(yù)測(cè)提取率為66.07 mg/g。考慮到實(shí)驗(yàn)的易操作性,將工藝條件修正為:酶用量2.1%、超聲溫度51℃、超聲時(shí)間20 min、液料比25 mL/g,在修正后的工藝條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得到掃帚菜多糖提取率的平均值為65.93 mg/g,與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.21%,說(shuō)明該模型有效,準(zhǔn)確性好,因此利用響應(yīng)面對(duì)掃帚菜多糖的提取工藝進(jìn)行預(yù)測(cè)與分析具有一定的應(yīng)用意義。
考察了不同濃度的掃帚菜多糖和TBHQ對(duì)豬油的抗氧化作用如圖12所示,從圖中可以看出,隨著強(qiáng)行氧化時(shí)間的增加,豬油的過(guò)氧化值逐漸增大,與空白樣品相比,掃帚多糖和TBHQ對(duì)豬油均表現(xiàn)出一定的抗氧化作用,并且隨著掃帚菜多糖用量的增加,抗氧化能力增強(qiáng),當(dāng)掃帚菜多糖添加量為0.05%時(shí),其抗氧化能力略小于添加量為0.05%的TBHQ的抗氧化能力,繼續(xù)增加掃帚菜多糖的用量到0.10%時(shí),其抗氧化能力超過(guò)了添加量為0.05%的TBHQ的抗氧化能力,說(shuō)明掃帚菜多糖能有效地提高豬油產(chǎn)品的貨架期。
圖12 多糖對(duì)豬油的抗氧化作用Figure 12 Antioxidation of polysaccharide on lard
植物多糖提取的常用方法有溶劑提取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法、超臨界流體法和酶輔助提取法。不同的提取方法均有各自的優(yōu)缺點(diǎn),另外由于植物的種類(lèi)或植物體的不同部位,導(dǎo)致在實(shí)際的多糖提取操作中,需要根據(jù)具體的情況來(lái)采用不同工藝或不同的工藝參數(shù)。徐珂等[13]利用超聲波和纖維素酶進(jìn)行協(xié)同提取杏鮑菇多糖,研究發(fā)現(xiàn)該方法的多糖提取率是傳統(tǒng)的水提法的1.92倍;黎英等[14]利用超聲波輔助復(fù)合酶法對(duì)紅腰豆多糖的工藝進(jìn)行了優(yōu)化,研究發(fā)現(xiàn)該方法的多糖提取率比采用傳統(tǒng)熱水醇沉法提取率增加了111.5%,且提取時(shí)間縮短了31.1%,提取溫度降低了20℃??梢?jiàn)采用超聲波輔助纖維酶法提取,可以在較低溫環(huán)境下加速掃帚菜多糖的溶出,具有提取率高且省時(shí)、高效、節(jié)能、環(huán)保的特點(diǎn)[15]。本文利用超聲波輔助纖維素酶提取掃帚菜多糖,在單因素的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化,建立了掃帚菜多糖提取的四元二次方程,經(jīng)三次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該方程的有效、準(zhǔn)確,能夠較好地預(yù)測(cè)掃帚菜多糖的提取率。超聲波輔助纖維素酶提取掃帚菜多糖的最佳工藝為:酶用量2.1%、超聲溫度51℃、超聲時(shí)間20 min和液料比25 mL/g,該條件下多糖的提取率為65.93 mg/g,與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.21%,說(shuō)明該模型有效,準(zhǔn)確性好。掃帚菜對(duì)豬油具有良好的抗氧化能力,當(dāng)掃帚菜多糖添加量為0.05%時(shí),其抗氧化能力略小于添加量為0.05%的TBHQ的抗氧化能力,掃帚菜多糖能有效地提高豬油產(chǎn)品的貨架期,該研究為掃帚菜的開(kāi)發(fā)與利用提供應(yīng)用基礎(chǔ)。
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Optimization of Ultrasonic-assisted Cellulase Extraction and Antioxidant Activity on Polysaccharides from Kochia Scoparia(Linn.)Schrad
CHEN Wen-juan1,CHEN Jian-fu2,3*,WU Li-min4,ZHUANG Yuan-hong4
(1.Department of Food Engineering,Zhangzhou City University,Zhangzhou 363000,F(xiàn)ujian,China;2.Department of Food and Biology Engineering,Zhangzhou Institute of Technology,Zhangzhou 363000,F(xiàn)ujian,China;3.Collaborative Innovation Center of Fine Chemicals in Fujian Province,Zhangzhou 363000,F(xiàn)ujian,China;4.Department of Biological Science and Technology,Minnan Normal University,Zhangzhou 363000,F(xiàn)ujian,China)
【Objective】The aim of the study was to optimize the ultrasonic-assisted cellulase extracting technology of polysaccharides from Kochia Scoparia(Linn.)Schradbyresponsesurfacemethodologyand to evaluate the antioxidative activity of polysaccharides.【Method】Based on a single factor experiment,a quadratic polynomial regression model was established about the dependent variable(extraction yield of polysaccharide)and independent variables(cellulase amount,ultrasonic temperature,ultrasonic time and liquid-material ratio),using Box-Benhnken design and response surface methodology.The antioxidant properties of lard were used to evaluate the antioxidative activity of polysaccharides.【Results】The optimum process parameters of ultrasonic-assisted cellulase extraction of polysaccharides from Kochia Scoparia(Linn.)Schrad were shown as followed,cellulase amount 2.1%,ultrasonic temperature 51℃,ultrasonic time 20 min and liquid-material ratio 25 mL/g.Under the optimal process conditions,the yield of polysaccharide was 65.93 mg/g and the relative error was 0.21%compared to the predictive value,indicating that the feasible model fitted well with the experimental data.The polysaccharides had a certain antioxidant capacity on the lard.【Conclusion】The ultrasonic-assisted cellulase extracting technology of polysaccharides from Kochia Scoparia(Linn.)Schrad by response surface methodology was effective and reliable.The polysaccharides could effectively improve the shelf life of lard.
ultrasonic-assisted;cellulase;Kochia Scoparia(Linn.)Schrad;polysaccharides;antioxidant activity
TS202;TQ91;S647 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1000-2650(2017)02-0172-08
10.16036/j.issn.1000-2650.2017.02.006
2017-01-05
福建省中青年教師教育科研項(xiàng)目(JAT160915);福建省高校杰出青年科研人才培育計(jì)劃(閩教科[2015]54號(hào))。
陳文娟,講師,碩士。*責(zé)任作者:陳建福,副教授,博士,研究方向:天然產(chǎn)物化學(xué)工藝,E-mail:qjf1996@163.com。
(本文審稿:鮑立寧;責(zé)任編輯:鞏艷紅;英文編輯:徐振鋒)