烤煙品系LY1306在PEG干旱脅迫下的生理響應及轉錄組學分析

周炎，丁松爽，趙莉，趙世民，史宏志，楊惠娟

1 河南農業(yè)大學 國家煙草栽培生理生化基地，河南 鄭州 450002；2 河南省煙草公司 洛陽市公司，河南 洛陽 471026

隨著全球的氣候變暖，人類及動植物所面臨的生態(tài)問題愈加嚴峻。對于作物生長來說，水資源短缺導致的干旱問題正是亟待解決的問題之一[1]。干旱導致植物失水，體內活性氧積累，對組織造成傷害，造成巨大的經濟損失。煙草是我國重要的經濟作物，也是常用的模式植物。研究煙草對干旱脅迫的生理響應可為培育煙草耐旱品種提供理論依據，也可為其他作物的抗旱研究提供思路。轉錄組測序技術近年來在多領域均有廣泛應用，植物的干旱脅迫也是較為熱門的研究領域，但目前以煙草為對象，以轉錄組測序為手段研究其對干旱脅迫信號響應的文章尚不多見。

LY1306是由系統(tǒng)選育的G80變異株系依次與K326、89112雜交育成的適應性強、抗性好、易烘烤的烤煙品系，該品系較適應丘陵山區(qū)的氣候條件，在干旱少雨、灌溉不充分的地區(qū)生長較好，表現(xiàn)出明顯的抗旱特性[2]。對LY1306品系的抗旱機理的研究可以深入了解該品系的抗旱特性。本文通過PEG模擬干旱條件并結合轉錄組分析，闡述了干旱脅迫條件下LY1306品系煙葉的生理變化及應激響應基因表達組學特征，繼而為煙草抗旱育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

實驗于2015年至2016年于河南農業(yè)大學國家煙草栽培生理生化基地實施， 供試品系為LY1306，設置3個處理，分別是15%PEG-6000處理0 h、16 h、24 h，每個處理3個重復。運用漂浮育苗培育LY1306 46 d，煙草幼苗長至4片葉后移栽至珍珠石中，以MS培養(yǎng)基（不含糖，不含瓊脂）為營養(yǎng)物質培養(yǎng)。移栽后23 d，選取長勢相同的煙株進行處理。分別在移入15%PEG-6000前和移入后16 h、24 h時，選取煙草葉片（統(tǒng)一選取大于5 cm葉片，從上往下數(shù)第4和第5片葉子），液氮速凍后，保存于-70℃ 冰箱。并將3個重復樣品等量混合，提取RNA，對其進行后續(xù)的轉錄組測序分析。另外選取長勢相同的未處理煙苗作為對照組（CK），在每次取樣前分別拍照記錄實驗組和處理組的葉片狀態(tài)。

1.2 煙草生理指標測定

1.2.1 葉片水勢測定

采用小液流法測定葉片水勢。

1.2.2 抗氧化酶活性測定

超氧化物歧化酶（SOD），過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）的活性測定均采用蘇州科銘生物技術有限公司生產的相應微量法試劑盒。

1.2.3 丙二醛（MDA）和脯氨酸（PRO）含量測定

分別采用蘇州科銘生物技術有限公司的丙二醛(malondialdehyde，MDA)微量法試劑盒和脯氨酸（PRO）微量法試劑盒測定樣品中MDA和PRO含量。

1.3 煙草葉片RNA 提取及測序

樣品總RNA提取由上海歐易生物醫(yī)學科技有限公司進行。DNase消化DNA后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA；加入打斷試劑將mRNA打斷成短片段，以打斷后的mRNA為模板, 用六堿基隨機引物合成一鏈cDNA，二鏈合成反應體系合成二鏈cDNA，在cDNA二鏈合成時以dUTP代替dTTP，連接不同接頭，再利用UNG酶法將含有dUTP的一條鏈進行消化，只保留連接不同接頭的cDNA一鏈；采用試劑盒純化cDNA一鏈；純化的cDNA一鏈進行末端修復、加A尾并連接測序接頭，再進行片段大小選擇，最后進行PCR擴增；構建好的文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer質檢合格后，使用Illumina HiSeqTM 2500測序儀進行測序。

1.4 RNA-Seq 序列的分析

由Illumina HiSeqTM2500測序所得的數(shù)據經質控（QC）過濾得到clean reads，用tophat/bowtie2將clean reads比對到參考序列。再通過統(tǒng)計reads在參考序列上的分布情況及覆蓋度，判斷比對結果是否通過第二次質控(QC of alignment)。通過后進行一系列后續(xù)分析，依據DESeq[3]軟件包中的NB（負二項分布檢驗的方式）對reads數(shù)進行差異顯著性檢驗，并采用basemean值來估算表達量。并從基因表達結果中，篩選FC＞2，且P＜=0.05的基因為樣品間差異表達的基因。

1.5 差異表達基因的注釋及分析

對差異表達基因進行GO（Gene Ontology）富集分析，結合GO注釋結果對其功能進行描述。統(tǒng)計每個GO條目中所包括的差異基因個數(shù)，并用超幾何分布檢驗方法計算每個GO條目中差異基因富集的顯著性。利用KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據庫對差異基因進行Pathway分析，并用超幾何分布檢驗的方法計算每個Pathway條目中差異基因富集的顯著性。分析結果top20按照每個條目對應的-log10Pvalue排序，同時過濾掉包含差異基因數(shù)目小于3的條目。

2 結果與分析

2.1 15%PEG-6000處理前后烤煙LY1306品系葉片形態(tài)和水勢變化

經過對比可以看出（圖1），PEG處理16 h后，烤煙LY1306品系葉片出現(xiàn)少量失水癥狀，葉尖發(fā)軟。處理24 h后，葉尖葉緣出現(xiàn)失水萎蔫癥狀。但總體來說，與對照組相比萎蔫癥狀不明顯。

圖1 15%PEG-6000處理不同時間對烤煙LY1306品系葉片狀態(tài)的影響Fig.1 Influence of 15% PEG-6000 treatment of different duration on leaf status

在實驗中，葉片水勢隨著干旱處理時間的延長而降低，且前16 h水勢下降較多，比0 h下降了20.6%，16 h后水勢下降較少，24 h比0 h降低了26.5%（圖2）。

圖2 15%PEG-6000處理不同時間對烤煙LY1306品系葉片水勢的影響Fig.2 Influence of 15% PEG-6000 treatment of different duration on leaf water potential

2.2 15%PEG-6000模擬干旱脅迫對烤煙LY1306品系抗氧化酶活性的影響

實驗表明（圖3，圖4），隨干旱脅迫時間的延長，SOD和POD活性隨干旱脅迫時間的延長均呈現(xiàn)出上升趨勢，但上升速率不同。SOD活性前期上升緩慢，后期迅速上升，16 h與24 h時分別是0 h的1.13倍和2.75倍。POD活性隨干旱脅迫時間的延長逐漸增強，且前期上升速度與SOD相比更快。16 h、24 h時POD活性分別為0 h的2.56倍和4.2倍。與SOD、POD相反，CAT活性隨干旱脅迫時間的延長逐漸下降，且下降速度先慢后快（圖5）。16 h與24 h的CAT活性分別比0 h下降了4.7%和22.8%。

圖3 15%PEG-6000處理下LY1306葉片中SOD活性變化Fig.3 changes of SOD activity in LY1306 leaves under the treatment of 15%PEG-6000

圖4 15%PEG-6000處理下LY1306葉片中POD活性變化Fig.4 changes of POD activity in LY1306 leaves under the treatment of 15%PEG-6000

圖5 15%PEG-6000處理下LY1306葉片中CAT活性變化Fig.5 changes of CAT activity in LY1306 leaves under the treatment of 15%PEG-6000

2.3 15%PEG-6000模擬干旱脅迫對烤煙LY1306品系丙二醛和脯氨酸含量的影響

LY1306葉片中的丙二醛（MDA）含量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢（圖6），其峰值出現(xiàn)在16 h。葉片中脯氨酸含量隨著干旱處理時間的延長呈現(xiàn)出先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢（圖7）。具體表現(xiàn)為24 h＞16 h＞0 h。脯氨酸含量在干旱脅迫前16 h迅速增長，比0 h增加了2.8倍；16 h后增長緩慢，處理24 h葉片脯氨酸含量僅略高于16 h，這與葉片水勢的變化趨勢基本吻合。

圖6 15%PEG-6000處理下LY1306葉片中丙二醛（MDA）含量變化Fig.6 changes of MDA content in LY1306 leaves under the treatment of 15%PEG-6000

圖7 15%PEG-6000處理下LY1306葉片中脯氨酸（PRO）含量變化Fig.7 changes of PRO content in LY1306 leaves under the treatment of 15%PEG-6000

上述結果表明，15%PEG模擬的干旱脅迫下，烤煙品系LY1306葉片中POD和SOD升高較為明顯，但對干旱信號的響應速度不同；脯氨酸在干旱脅迫發(fā)生后迅速響應并大量積累。

2.4 15%PEG-6000處理后LY1306葉片轉錄組表達分析

3個樣本（15%PEG-6000處理0 h、16 h、24 h）經測序后分別得到原始序列52493886，53206758，53175198條，經質控過濾后分別得到干凈序列51423972，51969504，52153830條，其中比對上參考序列的分別有49135898，49576507，49257835條，占總干凈序列的百分比分別為95.55%，95.39%，94.44%，說明測序數(shù)據質量良好。

經差異表達分析，相比于0 h，15%PEG處理16 h的樣本共篩選出3547個差異表達基因，其中1589個基因表達上調，1958個基因表達下調；PEG處理24 h的樣本共篩選出3141個差異表達基因，其中1579個基因表達上調，1562個基因表達下調。

2.5 PEG處理后葉片差異表達基因的GO分析

差異表達基因GO分類，共對應到生物過程（Biological process，BP）、細胞組成（Cellular component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）3大類。15%PEG處理16 h樣本的差異基因中，上調基因共注釋到1331個條目（圖8）。其中注釋到生物過程、細胞組成和分子功能的條目數(shù)量分別為741、138和452個。15%PEG處理24 h的樣本中上調基因共注釋到1507個條目（圖9），其中注釋到生物過程、細胞組成、分子功能的條目數(shù)分別為839、189、479個。

從圖中可以看出，生物過程中的鹽脅迫響應（response to salt stress）、赤霉素響應（response to gibberellin），細胞成分中的細胞質核周區(qū)（perinuclear region of cytoplasm）和分子功能中的轉錄因子活性（transcription factor activity）在處理16 h和24 h樣本中均表現(xiàn)為上調。

2.6 PEG處理后葉片差異表達基因的KEGG代謝通路分析

經過KEGG代謝通路分析（圖10），15%PEG處理16 h的樣本中，差異表達基因被富集到184個代謝通路，其中112個通路發(fā)生上調，141個通路發(fā)生下調；顯著富集（P＜0.05）的通路為36個，其中28個上調，31個下調。PEG處理24 h的樣本差異表達基因被富集到164個通路，其中上調通路117個，下調通路128個；其中P＜0.05發(fā)生顯著富集的共有38個，30個上調通路，35個下調通路?？煽闯鲭S著干旱脅迫時間的延長，顯著富集的通路數(shù)目無論上調還是下調均有所增加。

圖8 15%PEG-6000處理16 h后烤煙LY1306品系相對于0 h上調表達基因GO分析Fig.8 GO analysis of up-regulated genes in LY1306 the flue-cured tobacco line under the treatment of 15%PEG-6000 for 16 h

圖9 15%PEG-6000處理24 h后烤煙LY1306品系相對于0 h上調表達基因GO分析Fig.9 GO analysis of up-regulated genes in LY1306 the flue-cured tobacco line under the treatment of 15%PEG-6000 for 24 h

經分析，15%PEG處理16 h的樣品中，苯丙烷生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis）、苯丙氨酸代謝（Phenylalanine metabolism）、亞油酸代謝（Linoleic acid metabolism）、萜類合成（Monoterpenoid biosynthesis）、植物激素信號轉導（Plant hormone signal transduction）、氮代謝（Nitrogen metabolism）和α-亞麻酸代謝（alpha-Linolenic acid metabolism）等通路上調。

苯丙烷生物合成（ko00940）和苯丙氨酸代謝（ko00360）通路中苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）、等發(fā)生上調。亞油酸代謝（ko00591）和α-亞麻酸代謝（ko00592）通路中，脂氧合酶（lipoxygenase，LOX2S）等基因表達上調。植物激素信號轉導（ko04075）中的脫落酸、乙烯、茉莉酸途徑均上調表達。氮代謝（ko00910）中碳酸酐酶（carbonic anhydrase，CA）基因表達上調。

15%PEG處理24 h的樣品中，發(fā)生上調的代謝通路為植物激素信號轉導（Plant hormone signal transduction）、抗原加工提呈（Antigen processing and presentation）、淀粉蔗糖代謝（Starch and sucrose metabolism）、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)（Phosphatidylinositol signaling system）和精氨酸脯氨酸代謝（Arginine and proline metabolism）等。

植物激素信號轉導（ko04075）中，脫落酸途徑明顯表達上調。生長素途徑中的生長素響應因子（auxin response factor,ARF）基因和茉莉酸途徑的MYC2轉錄因子基因表達上調?？乖庸ぬ岢剩╧o04612）通路中免疫系統(tǒng)的核轉錄因子（nuclear transcription factor Y，NFY）等表達上調。淀粉蔗糖代謝（ko00500）中6-磷酸海藻糖合成酶（trehalose 6-phosphate synthase，2.4.1.15，otsA）、α-淀粉酶（alpha-amylase ，amyA ）、β-淀粉酶（beta-amylase）等表達上調。精氨酸脯氨酸代謝（ko00330）中的谷氨酸-5-激酶（glutamate 5-kinase，proB）、δ-1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthetase，P5CS）、1-吡咯啉-5-羧酸脫氫酶（1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase）、脯氨酸脫氫酶（ proline dehydrogenase，putA）等基因表達上調。

圖10 15%PEG處理后烤煙LY1306品系相對于0 h上調表達基因KEGG代謝通路分析Fig.10 KEGG pathway analysis of up-regulated genes in LY1306 the flue-cured tobacco line under the treatment of 15%PEG-6000.

3 討論

3.1 15%PEG-6000模擬干旱脅迫下烤煙LY1306品系中SOD和POD是主要應激酶

當植物遭受干旱脅迫時，體內原有的氧化平衡被破壞，細胞膜脂發(fā)生強烈的過氧化作用，MDA大量積累，對細胞產生毒害，導致植株失水甚至死亡[4]，SOD、POD、CAT這幾種酶彼此協(xié)調作用，提高了植株對活性氧清除的能力[5]。SOD是活性氧清除的第一步,它將活性氧歧化成H2O2，再由POD和CAT進一步分解[6]。有研究表明，適度的干旱脅迫誘導能夠提高植物體內抗氧化酶活性，降低植物細胞膜脂過氧化程度[7-8]。

脯氨酸是植物體內最有效的一種滲透調節(jié)物質，有助于植物細胞和組織的持水和防止脫水。Kramble等最早在萎蔫的黑麥草葉片中發(fā)現(xiàn)脯氨酸大量積累。有研究表明，水稻幼苗在干旱脅迫下脯氨酸含量增加，并與丙二醛和質膜透性呈極顯著相關，脯氨酸還具有清除活性氧的作用[9-11]。

總的來說烤煙LY1306品系中POD、SOD是響應PEG模擬干旱的主要抗氧化酶。脯氨酸能迅速響應外界信號并大量積累，其產生機制受反饋調節(jié)，將葉片水勢維持在較低水平，防止大量失水并清除部分活性氧，減少細胞損傷。水勢的變化與脯氨酸變化基本吻合。

3.2 15%PEG-6000處理后烤煙LY1306品系有多條抗旱相關通路上調

15%PEG處理16 h的葉片中，影響光合作用放氧反應和固碳過程的半乳糖脂及碳酸酐酶（CA）表達上調，維持了干旱脅迫下光合速率的相對穩(wěn)定[12-13]。

L-苯丙氨酸代謝通路中上調的苯丙氨酸解氨酶（PAL）是連接初級代謝和苯丙烷類代謝、催化苯丙烷類代謝第一步反應的酶，也是苯丙氨酸代謝途徑的關鍵酶和限速酶[14]，還可以參與植保素的合成，包括酚類、異黃酮類和萜烯類，提高植物防御反應。許多植物激素如生長素、赤霉素和乙烯都可誘導植物PAL基因的表達。GO及KEGG分析顯示赤霉素等植物激素信號轉導途徑表達上調。研究擬南芥幼苗對滲透脅迫的耐受性發(fā)現(xiàn)，赤霉素可響應非生物脅迫信號，使植物生長停滯以增強脅迫耐受性[15-16]。

在亞油酸和α-亞麻酸代謝通路中上調表達的脂氧合酶（LOX）在響應干旱脅迫過程中有重要作用。在植物中，LOX主要以亞油酸、亞麻酸為底物，參與調控與生成一些抗性信號分子如ABA、茉莉酸（JA）及植物揮發(fā)性物質等[17-22]。JA不僅本身作為信號分子參與了對干旱脅迫的防御反應，還能誘導PAL等抗逆相關酶基因的表達，同時能提高植物體內PRO含量和SOD、POD等抗氧化酶活性，提高滲透調節(jié)能力[23-24]。

本實驗16 h處理中KEGG植物激素信號轉導中ABA途徑上調表達。ABA是干旱脅迫下植物體內主要的信號傳導物質，與JA相似的是，ABA也能夠促進PRO的積累，清除部分活性氧；同時，ABA能夠促使蔗糖轉化為葡萄糖和果糖,有利于提高植物的滲透調節(jié)能力[25-29]，也有研究表明，在非生物脅迫條件下，ABA可以促進碳水化合物的積累[30]，GO結果中上調的糖原（淀粉）合酶活性與之相符。此外ABA還可以通過促進氣孔關閉減少蒸騰失水。

PEG處理24 h樣本的轉錄組結果顯示，植物激素信號轉導通路中ABA、 JA、IAA等上調，與PEG處理16 h的樣本相似。此外，樣本上調表達通路還有脯氨酸代謝、糖類合成及代謝、轉錄因子調控等。

KEGG分析表明，精氨酸脯氨酸代謝通路中參與脯氨酸合成的谷氨酸激酶、δ-1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）和負責脯氨酸代謝為谷氨酸的1-吡咯啉-5-羧酸脫氫酶（P5CDH）、脯氨酸脫氫酶基因發(fā)生上調。谷氨酸途徑合成脯氨酸主要是通過谷氨酸激酶（GK）催化生成中間產物△1-吡咯啉-5-羧酸（P5C），再經由P5CS和P5CR催化生成脯氨酸[31]。合成途徑中的關鍵酶GK和P5CS受到脯氨酸的反饋調控，將脯氨酸濃度控制在適當水平[32]。脯氨酸代謝過程中，先經由脯氨酸脫氫酶催化為△1-二氫吡咯-5-羧酸（P5C），再由P5CDH催化下氧化為谷氨酸。同時Iyers等[33]研究發(fā)現(xiàn)，P5C等脯氨酸代謝中間產物可誘導水稻細胞中部分滲透調節(jié)基因的高效表達。

GO分類及KEGG代謝通路分析顯示，PEG處理24 h樣本中，糖類合成及代謝活性也發(fā)生上調。蔗糖合酶、6-磷酸海藻糖合成酶、β-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖6-磷酸異構酶（GPI）基因表達上調。蔗糖、海藻糖合成量升高，大分子淀粉、纖維素被降解為還原糖，參與植物的滲透調節(jié)。PEG處理16 h的樣本淀粉合酶活性在ABA誘導下上升，隨著干旱脅迫時間的延長，大分子糖類逐漸分解，作為滲調物質抵抗干旱脅迫。同時，GPI參與的糖酵解過程可為植株供能。

此外，GO分析顯示CCAAT-盒結合因子（CBF）的核轉錄因子NFY基因表達量上調。NFY廣泛存在于植物中，并可參與調節(jié)多種生理進程，如逆境脅迫、葉綠體發(fā)育和光合作用等[34]。有研究發(fā)現(xiàn)[35]，與野生型對照相比，遺傳轉化NF-Y家族轉錄因子TaNFYB3;1的轉基因煙草植株，在干旱和鹽分脅迫處理后，植株的形態(tài)和干物質重均顯著提高，葉綠素、可溶性蛋白含量明顯增加，SOD、POD活性顯著增強。

同時有研究表明[36-37]，一些植物激素如乙烯、赤霉素、脫落酸等也能誘導 SOD 、POD基因的表達, 其中 ABA對基因表達調控的作用尤為明顯；此外，轉錄因子對SOD、POD基因的表達調控作用也十分顯著。GO及KEGG分析表明，不同處理時間的LY1306葉片中植物激素及轉錄因子調控發(fā)生上調，與SOD，POD活性的上升趨勢相符。

綜上所述，植物激素轉導、糖類合成代謝、轉錄因子調控是兩個處理時間共同上調的代謝通路，直接或間接地調控了SOD、POD及脯氨酸等抗旱相關物質基因的表達。除此之外，15%PEG-6000處理16 h時，烤煙LY1306品系還主要通過脯氨酸生成和糖類合成調節(jié)滲透勢，亞油酸代謝和次生代謝來響應干旱脅迫；PEG處理24 h時，LY1306主要通過脯氨酸、磷脂、糖類代謝等途徑來響應干旱脅迫。可以看出，LY1306有多種應對干旱脅迫的方式，各通路互為補充，互相串聯(lián)，共同對抗不同程度的干旱脅迫。

4 結論

在15%PEG模擬的干旱脅迫條件下，烤煙LY1306品系能迅速通過植物激素信號轉導、亞油酸代謝和次生代謝等多種方式放大并傳遞脅迫信號，誘導SOD、POD和脯氨酸的表達，導致干旱脅迫下煙葉SOD、POD活性和脯氨酸含量大大增加。同時轉錄因子等途徑也被激活，對抵御干旱起到一定的作用。但烤煙LY1306品系的具體抗旱機制仍有待深入研究。

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