富血小板血漿聯(lián)合右歸飲對骨質(zhì)疏松模型大鼠的實驗研究

高國衛(wèi) 趙立來 童培建

[摘要] 目的 研究富血小板血漿（PRP）聯(lián)合右歸飲對大鼠骨質(zhì)疏松性骨折的影響。 方法 8月齡SPF級SD雌性大鼠148只，隨機分為4 組：空白模型組（K組）、右歸飲組（Y組）、PRP組（P組）、聯(lián)合組（L組）。K組不做處理，其中P組和L組于骨折造模術(shù)前眼眶采血，制備PRP，在骨折模型建立術(shù)中將PRP凝膠注入骨折端；Y組及L組給予右歸飲灌胃。觀察骨折端影像學以及病理組織學變化，比較四組骨折愈合情況。 結(jié)果 從Micro-CT的骨痂圖可見Y組、P組及L組在骨折后同一時間點骨痂的骨量較K組高。定量分析得出，每個時間點都是L組BV及BV/TV最高。組織病理學觀察可見各實驗組較K組的骨痂生長有明顯改善。免疫組織化學觀察結(jié)果：Col2a1在L組和P組在骨折術(shù)后1周表現(xiàn)為中度陽性，術(shù)后2周為強陽性，術(shù)后4周與6周為弱陽性。Y組骨折術(shù)后1周、2周均表現(xiàn)為中度陽性，術(shù)后4周與6周為弱陽性，K組術(shù)后1周表現(xiàn)為中度陽性，2周和4周時表現(xiàn)為弱陽性，6周時表現(xiàn)為陰性。 結(jié)論 L組治療大鼠骨質(zhì)疏松性骨折較單純的P組和Y組治療效果更佳，能顯著提高大鼠骨質(zhì)疏松性骨折愈合質(zhì)量，明顯縮短骨折愈合周期。

[關(guān)鍵詞] 骨質(zhì)疏松；骨折愈合；右歸飲；富血小板血漿

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）28-0042-05

[Abstract] Objective To study the effect of platelet-rich plasma（PRP） combined with Youguiyin on osteoporotic fractures in rats. Methods 148 8-month SPF female SD rats were randomly divided into four groups： blank model group （group K）， Youguiyin group （group Y）， PRP group （group P）， and combination group （group L）. No treatment was performed in group K. The blood of group P and group L was collected from the eyelids before fracture surgery to prepare PRP， and PRP gel was injected into the fracture end during the establishment of fracture model. Group Y and group L were given Youguiyin by gavage. The changes in imaging and histopathology at the fracture end were observed and the fracture healing of the four groups was compared. Results The osteotomy map of Micro-CT showed that bone mass of bone callus was higher in group Y， group P， and group L than that in group K at the same time after fracture. Quantitative analysis showed that the BV and BV/TV of group L was the highest at each time point. Histopathological observation showed that the growth of bone callus in the experimental group was significantly better than that in the group K. immunohistochemistry results showed that Col2a1 was moderate positive in the group L and P at 1 week after fracture， strong positive at 2 weeks and weak positive at 4 and 6 weeks after operation. Col2a1 in group Y was moderate positive at 1 and 2 weeks postoperatively and weak positive at 4 and 6 weeks postoperatively. Col2a1 in group K was moderate positive at 1 week postoperatively and weak positive at 2 and 4 weeks postoperatively， and negative at 6 weeks after surgery. Conclusion The treatment of osteoporotic fractures in group L is better than that in group P and Y in the treatment of osteoporotic fractures. It can significantly improve the quality of osteoporotic fracture healing in rats and significantly shorten the period of fracture healing.

[Key words] Osteoporosis； Fracture healing； Youguiyin； Platelet-rich plasma

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是以低骨量和骨微細結(jié)構(gòu)破壞為特征從而導致骨脆性和骨折風險增加的一種全身骨骼性疾病，骨微結(jié)構(gòu)破壞是骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)生的直接原因[1]。富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）可釋放多種生長因子，在細胞增殖、細胞分化、趨化作用和血管形成方面發(fā)揮重要作用，可促進干細胞向成骨細胞誘導分化，加速骨折愈合，目前已廣泛應(yīng)用于骨缺損、骨折不愈合及軟組織疾病的治療和研究[2-6]。右歸飲作為溫補腎陽的代表方劑，有學者[7]研究認為可調(diào)整內(nèi)環(huán)境，減少骨吸收，促進骨形成，促使成骨-破骨耦聯(lián)向成骨方向轉(zhuǎn)化，從而增加骨容積，治療骨質(zhì)疏松癥臨床效果已得到學者認可。本實驗將富血小板血漿聯(lián)合右歸飲作用于骨質(zhì)疏松模型大鼠，并觀察二者在大鼠骨質(zhì)疏松性骨折愈合過程中的協(xié)同治療作用，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物

右歸飲按照《景岳全書》方藥組成：熟地9 g、山藥6 g、山茱萸3 g、枸杞6 g、制附子9 g、肉桂3 g、甘草3 g、杜仲6 g。用傳統(tǒng)方法先煎附子20 min，后加入其余藥。由浙江省中醫(yī)院中藥制劑室提供。

1.2 實驗動物

8月齡SPF級SD雌性大鼠148只，體質(zhì)量（250±30）g，購買并飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心，控制室溫在25℃，濕度52%，標準大鼠飼料及飲用純凈水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，造模后給藥（實驗時間2016年8月～2018年2月）。

1.3 富血小板血漿制備

PRP組和聯(lián)合組大鼠于骨折造模術(shù)前眼眶采血3 mL，注入含有枸櫞酸鈉溶液的離心管中，采用Landsberg法[8]制備PRP。

1.4 分組與造模

1.4.1 分組 K組：空白模型組；Y組：右歸飲組；P組：富血小板血漿（PRP）組；L組：右歸飲聯(lián)合PRP組。所有大鼠按照隨機數(shù)字表法排序并平均分配于4個組內(nèi)，每組37只，每個組分骨折術(shù)后2、4、6周3個時間點，每個時間點3只大鼠，剩余每組28只，每個組分4個時間點，分別是骨質(zhì)疏松性骨折模型建立術(shù)后1、2、4、6周，每個時間點各7只。

1.4.2 去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松模型 腹腔注射氯胺酮（60 mg/kg）麻醉，經(jīng)背側(cè)正中切口，行雙側(cè)卵巢切除并結(jié)扎相應(yīng)營養(yǎng)血管，逐層縫合，術(shù)后給予肌肉注射青霉素針10萬U/只，每日2次，連續(xù)3 d。

1.4.3 脛骨開放性骨折模型[9] 去卵巢術(shù)后3個月再次腹腔注射氯胺酮麻醉，取大鼠雙側(cè)脛骨前方備皮，大鼠仰臥位，用10號圓刀片在雙側(cè)脛骨結(jié)節(jié)皮膚沿縱軸做一長約1.5 cm 皮膚切口，顯露脛骨結(jié)節(jié)及其遠端脛骨，距脛骨結(jié)節(jié)下方5 mm處，取1 mmφ克氏針交叉鉆孔，組織剪銳性離斷，用1 mmφ克氏針在斷端髓腔內(nèi)逆行內(nèi)固定，逐層縫合。手術(shù)均在嚴格無菌條件下進行，常規(guī)肌肉注射青霉素針10萬U/只，每日2次，連續(xù)3 d。

1.4.4 標本采集 大鼠斷頸處死后，沿原切口顯露脛骨及骨折部位，延長切口上至膝關(guān)節(jié)，下至踝關(guān)節(jié)。在踝、膝關(guān)節(jié)間隙平面橫行剪斷，完整取出脛骨標本，輕柔拔除克氏針。標本放入10%中性福爾馬林溶液中浸泡3 d固定。

1.5 給藥方法

1.5.1 右歸飲給藥 Y組及L組大鼠骨折造模術(shù)后給予右歸飲灌胃，灌胃劑量根據(jù)體表面積換算公式A=k·W2/3，以60 kg 成人用藥量及體表面積為參考標準，計算出動物用藥劑量作為給藥劑量。

1.5.2 富血小板血漿干預 根據(jù)分組情況，在大鼠雙側(cè)脛骨近端骨折模型建立術(shù)中將預先制備好的PRP凝膠注入骨折端。

1.6 觀察指標與方法

1.6.1 Micro-CT 掃描及三維重建分析[10] 將術(shù)后1、2、4周的脛骨骨折標本行骨痂局部micro-CT 掃描及骨折部位與周邊骨三維重建分析。每組圖片在同一條件下進行3-D重建，并用μCT系統(tǒng)的評估軟件進行形態(tài)計量學分析，著重測量骨性骨痂體積（BV）和骨性骨痂體積百分比（BV/TV %）。

1.6.2組織形態(tài)學觀察[11] ①蘇木精-伊紅染色（hematoxylin & eosin stain，HE染色）雙側(cè)脛骨骨折標本放入10%NBF中浸泡3 d予充分固定。固定后用去離子水沖洗3～5次，然后用14%EDTA溶液脫鈣處理6～8周，每隔2～3 d換液。脫鈣完成后，同樣用去離子水沖洗3～5次，然后經(jīng)硬化全自動脫水處理后用石蠟包埋。切片時，骨折線與刀片呈水平位，以3 μm厚度切片。烤片后進行染色。在光學顯微鏡下觀察。②Col2a1免疫組化觀察（Stre-ptavidin-peroxidaseconjugtate-method，S-P染色）標本均經(jīng)中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋、切片。按S-P 免疫組化試劑盒說明書進行操作。顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行處理，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用配對t檢驗。每組數(shù)據(jù)均進行正態(tài)分布檢驗，數(shù)據(jù)有效性檢驗均采用雙側(cè)檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1 Micro-CT 分析結(jié)果

從Micro-CT的骨痂見封三圖8～10，Y組、P組及L組大鼠在骨折后不同周期骨痂的骨量較K組高，第4周時P組及L組骨痂骨量明顯高于K組和Y組。Micro-CT軟件的定量分析結(jié)果中可見，L組、P組、Y組骨性骨痂體積（BV）及骨性骨痂和總骨量的體積比（BV/TV）在術(shù)后第1、2、4周均高于K組，每個時間點L組BV均最高，其中術(shù)后第1、2、4周組間兩兩比較有統(tǒng)計學差異（P<0.05），見表1～2。

2.2組織形態(tài)學結(jié)果

HE染色結(jié)果見封三圖11。（1）骨折術(shù)后1周，由于骨折創(chuàng)傷刺激，吸引了大量細胞聚集在斷端周圍形成纖維骨痂，可見間充質(zhì)細胞、成纖維細胞和炎性細胞；同時，有大量新生毛細血管出現(xiàn)；斷端附近骨外膜下可見間充質(zhì)細胞增殖，開始分化為軟骨細胞，L組骨外膜可見分化較少的成骨細胞，形成原始小梁狀骨，Y組、P組骨外膜下以軟骨細胞為主，P組較Y組稍多，K組纖維性骨痂稀疏，毛細血管較少，斷端血腫機化遲緩，骨外膜下軟骨細胞數(shù)量最少。（2）骨折術(shù)后2周，軟骨性骨痂形成以取代纖維骨痂，軟骨痂周邊部軟骨細胞肥大，部分變性壞死，可見少量原始小梁狀骨，L組原始小梁狀骨表面可見大量排列整齊的成骨細胞，軟骨痂周邊開始出現(xiàn)網(wǎng)織骨，P組原始小梁狀骨表面成骨細胞數(shù)量較多，排列相對整齊，而Y組成骨細胞數(shù)量較少，排列雜亂，原始骨小梁間為結(jié)締組織；K組見毛細血管數(shù)量增多，骨外膜下間充質(zhì)細胞增殖分化為較多的軟骨細胞和較少的成骨細胞。（3）骨折術(shù)后4周，L組軟骨痂周邊逐漸被網(wǎng)織骨取代，軟骨性骨痂轉(zhuǎn)變?yōu)楣切怨丘?，早期形成的原始小梁狀骨?nèi)軟骨細胞逐漸分化為骨細胞；與此同時，表面出現(xiàn)的破骨細胞與成骨細胞“耦合”，原始骨小梁逐漸改建為成熟骨小梁。與L組相比，P組成熟骨小梁數(shù)量少，軟骨細胞較多，Y組小梁狀骨吸收快，骨小梁間距增寬，K組原始小梁狀骨表面成骨細胞數(shù)量較多，排列相對整齊，軟骨痂周邊開始出現(xiàn)網(wǎng)織骨。（4）骨折術(shù)后6周，K組軟骨性骨痂已逐漸被骨性骨痂取代。L組骨性骨痂繼續(xù)經(jīng)破骨細胞和成骨細胞相關(guān)作用，在主應(yīng)力方向上形成更多的網(wǎng)織骨，在應(yīng)力軸線以外，破骨細胞相對活躍，多余的骨痂逐漸被吸收、清除，髓腔重新貫通，與L組相比，P組、Y組骨痂塑形相對較慢。

Col2a1免疫組化結(jié)果見封三圖12。（1）Col2al 位于細胞漿中，胞漿染色呈棕黃色為陽性細胞，無陽性細胞或陽性細胞比例<10%為陰性，陽性細胞比例10%～30%為弱陽性，陽性細胞比例30%～60%為中度陽性，陽性細胞數(shù)>60%為強陽性[12]。（2）四組大鼠骨痂標本在骨折術(shù)后第1、2周均比第4、6周有高表達，其中L組和P組在骨折術(shù)后1周表現(xiàn)為中度陽性，術(shù)后2周為強陽性，術(shù)后4周與6周為弱陽性。Y組骨折術(shù)后1周、2周均表現(xiàn)為中度陽性，但2周時單個視野陽性細胞計數(shù)要高于第1周，術(shù)后4周與6周為弱陽性，6周時單個視野陽性細胞計數(shù)低于4周，相比P組和L組同一時間節(jié)點，Y組單個視野陽性細胞計數(shù)較低。K組術(shù)后1周表現(xiàn)為中度陽性，2周和4周時表現(xiàn)為弱陽性，6周時表現(xiàn)為陰性，但1周及2周時單個視野陽性細胞計數(shù)要低于Y組、P組和L組。

3討論

目前對骨質(zhì)疏松性骨折愈合是否與青壯年骨折愈合的機制一樣尚不清楚，所以臨床上治療骨質(zhì)疏松性骨折均采用與一般性骨折相同的方法與原則，常忽視其骨質(zhì)疏松的病理特點，這樣不但療效難以提高，而且易發(fā)生骨折愈合不良或再次骨折[13]。由此，學者們開始探索骨質(zhì)疏松性骨折的愈合特點，梁祖建等[14]認為，骨折早期，骨愈合的啟動過程與青壯年骨折相同，8～12周時骨質(zhì)疏松性骨折骨吸收仍較旺盛，骨礦化相對較少，膠原纖維形成不足，骨痂成熟及骨形成遲緩。其形態(tài)學特征是軟骨內(nèi)成骨與膜內(nèi)成骨共同參與了骨質(zhì)疏松性骨折的修復[15]，且以軟骨內(nèi)成骨為主，但軟骨內(nèi)成骨過程較慢，板層骨形成遲緩，膠原排列紊亂，骨小梁纖細，破骨細胞活躍，軟骨性骨痂發(fā)育為成熟骨痂遲緩，骨痂質(zhì)量差。閆景龍等[16]以卵巢摘除大鼠和老年大鼠作為雌激素缺乏型和增齡型兩種骨質(zhì)疏松的動物模型，從組織形態(tài)學等多方面對骨質(zhì)疏松性骨折愈合的特點進行分析，提出軟骨內(nèi)成骨延緩是骨質(zhì)疏松性骨折愈合的共同本質(zhì)特征，同時發(fā)現(xiàn)外源性生長激素對骨折愈合具有明顯的促進作用。本實驗希望通過富血小板血漿聯(lián)合右歸飲促進骨質(zhì)疏松性骨折愈合，并能縮短愈合周期及提供愈合質(zhì)量。

富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）通過離心獲得，高于生理濃度數(shù)倍的血小板血漿，通過釋放多種生長因子，發(fā)揮修復作用。PRP促進骨再生的作用在許多骨缺損的動物模型和臨床應(yīng)用上得到了驗證[17-19]。創(chuàng)傷修復過程就是炎癥細胞和修復細胞以有規(guī)律而又協(xié)調(diào)的方式參與愈合過程[20]。主要的炎癥細胞包括中性粒細胞、單核-巨噬細胞、淋巴細胞等，修復細胞包括成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞、表皮細胞等，PRP含有的各種生長因子通過趨化作用、合成分泌作用和分化增殖作用來發(fā)揮生物學效應(yīng)，來促進這些細胞的增殖、分化[21]。不同的細胞對不同的因子起反應(yīng)，使各種細胞具有各自的修復過程[22]。PRP中最主要的成分是血小板、白細胞和纖維蛋白。PRP在使用中可以是液態(tài)的，便于注射，如膝關(guān)節(jié)腔注射、網(wǎng)球肘痛點注射等；也可以與凝血酶原合用，激活后成凝膠狀，便于粘合骨塊、填塞創(chuàng)腔、覆蓋創(chuàng)面和防止生長因子流失。如與凝血酶合用，血小板會迅速被激活，10 min內(nèi)即開始釋放生長因子，1 h內(nèi)能釋放出95%的生長因子[23]。這些生長因子與周圍修復細胞上的受體結(jié)合，經(jīng)過信號通路傳至細胞核，刺激細胞分化和增殖。不過，由于血小板激活后釋放的生長因子種類較多，生長因子的作用方式，特別是生長因子之間如何相互作用，有待進一步深入研究。雖然PRP促進骨折愈合的作用在動物和臨床研究中得到了認可，但并未發(fā)現(xiàn)學者將PRP應(yīng)用于骨質(zhì)疏松性骨折愈合方面的實驗和臨床研究，可能是認為骨質(zhì)疏松性骨折與一般成人骨折愈合過程相同。本實驗結(jié)果顯示：①Micro-CT的骨痂圖中可見P組大鼠在骨折后不同周期骨痂的骨量較K組高，第4周時P組骨痂骨量明顯高于K組和Y組。Micro-CT軟件的定量分析結(jié)果中可見，P組骨性骨痂體積（BV）及骨性骨痂和總骨量的體積比（BV/TV）在術(shù)后第1、2、4周均比K組高。CT定量分析與影像學表現(xiàn)相符。②HE染色結(jié)果：骨折術(shù)后1周，P組骨外膜下以軟骨細胞為主，P組較Y組稍多；骨折術(shù)后2周，P組原始小梁狀骨表面成骨細胞數(shù)量較多，排列相對整齊，而Y組成骨細胞數(shù)量較少，排列雜亂，原始骨小梁間為結(jié)締組織；骨折術(shù)后4周，與L組相比，P組成熟骨小梁數(shù)量少，軟骨細胞較多；骨折術(shù)后6周，與L組相比，P組骨痂塑形相對較慢。③Col2a1免疫組化結(jié)果：P組大鼠骨痂標本在骨折術(shù)后第1、2周均比第4、6周有高表達，P組在骨折術(shù)后1周表現(xiàn)為中度陽性，術(shù)后2周為強陽性，術(shù)后4周與6周為弱陽性。

右歸飲作為溫補腎陽的代表方劑，最早載于張景岳的《景岳全書》。近年來學者對其治療骨質(zhì)疏松的機制和臨床療效進行了深入研究，童培建等[24]認為右歸飲能調(diào)整骨生存內(nèi)環(huán)境，能促進成骨細胞增殖，可增加骨容積。周華[25]認為右歸飲能明顯增強BMP-2的表達，增加成骨細胞數(shù)量，從而加速骨形成，具有治療骨質(zhì)疏松的作用。錢康[26]研究得出右歸飲可以提高血清堿性磷酸酶和雌二醇水平，提示右歸飲可能通過拮抗雌激素降低和促進成骨細胞增殖改善骨質(zhì)疏松。羅漢文等[27]認為，右歸丸能有效調(diào)節(jié)去卵巢大鼠垂體-腎上腺軸的功能狀態(tài)和病理變化，從而促進骨生成，抑制骨吸收，達到治療骨質(zhì)疏松的目的。因此本實驗選擇右歸飲作為實驗對照組（Y組）：①從Micro-CT的骨痂圖中可見，Y組大鼠在骨折后不同周期骨痂的骨量較K組高，定量分析結(jié)果中可見，Y組BV和BV/TV%在術(shù)后第1、2、4周均比K組高。②HE染色結(jié)果：骨折術(shù)后1周，Y組骨外膜下以軟骨細胞為主；骨折術(shù)后2周，Y組成骨細胞數(shù)量較少，排列雜亂，原始骨小梁間為結(jié)締組織；骨折術(shù)后4周，Y組小梁狀骨吸收快，骨小梁間距增寬；骨折術(shù)后6周，與L組相比，Y組骨痂塑形相對較慢。③Col2a1免疫組化結(jié)果：Y組骨折術(shù)后1周、2周均表現(xiàn)為中度陽性，但2周時單個視野陽性細胞計數(shù)要高于第1周，術(shù)后4周與6周為弱陽性，6周時單個視野陽性細胞計數(shù)低于4周，相比P組和L組同一時間節(jié)點，Y組單個視野陽性細胞計數(shù)較低。

本實驗聯(lián)合富血小板血漿與右歸飲作用于大鼠骨質(zhì)疏松性骨折，實驗結(jié)果顯示：①Micro-CT的骨痂圖中可見，在骨折術(shù)后不同階段，L組均較K組、Y組骨折愈合快，骨痂生長及塑形好；CT定量分析L組、P組、Y組骨性骨痂體積（BV）和骨性骨痂和總骨量的體積比（BV/TV%）在術(shù)后第1、2、4周均比K組高，每個時間點都是L組BV最高，其中術(shù)后第1、2、4周組間兩兩比較有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。②組織形態(tài)學結(jié)果提示L組在骨折術(shù)后相同時間節(jié)點，軟骨細胞數(shù)量較P組、Y組、K組多，原始小梁狀骨及網(wǎng)織骨出現(xiàn)早，骨痂塑形好，髓腔貫通。③軟骨及成骨、破骨細胞相關(guān)的基因表達，軟骨分化標準基因Col2a1在L組大鼠中骨折術(shù)后第1、2周的表達水平均比其他三組明顯增高，第1周時達到峰值，成骨相關(guān)的標志基因Runx2、BMP2 和Osteocalcin，在骨折愈合后期階段（術(shù)后4～6周），L組明顯高于其他三組。破骨細胞相關(guān)基因Rankl和Opg基因的表達水平在術(shù)后2、4周時，L組較K組高，但與P組、Y組相比差異不明顯，到術(shù)后第6周時破骨細胞相關(guān)基因表達水平明顯高于其他三組。提示L組軟骨內(nèi)骨化出現(xiàn)早，且骨化質(zhì)量高，在骨折后期骨性骨痂生成最多，同樣在骨折愈合后期骨痂塑形最為滿意，與組織形態(tài)學結(jié)果相符。以上實驗結(jié)果證實PRP聯(lián)合右歸飲治療的療效較單純的右歸飲及單純的PRP治療效果更佳，提示聯(lián)合治療能顯著提高大鼠骨質(zhì)疏松性骨折愈合質(zhì)量，明顯縮短骨折愈合周期，充分驗證了PRP聯(lián)合右歸飲在治療骨質(zhì)疏松性骨折愈合過程中的協(xié)同作用。

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（收稿日期：2018-05-09）