甲狀腺乳頭狀癌中FHL1基因的表達(dá)及臨床意義

權(quán)明明+++++++陳珍珍+++++++戴岳楚++++++梁勇

[摘要] 目的 研究FHL1蛋白和FHL1基因在甲狀腺癌中的表達(dá)及臨床意義。 方法 分別應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR、蛋白質(zhì)雜交檢測(cè)人甲狀腺乳頭狀癌組織標(biāo)本及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫標(biāo)本中FHL1基因和蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果 實(shí)時(shí)定量PCR提示FHL1基因在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫中高表達(dá)，在甲狀腺乳頭狀癌中低表達(dá)，相對(duì)表達(dá)量為（0.4538±0.0074），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；蛋白質(zhì)雜交提示FHL1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中低表達(dá)（0.4033±0.0296），在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫中高表達(dá)（0.8021±0.0269），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在PTC組中，女性FHL1的陽(yáng)性表達(dá)率為41.4%，男性FHL1的陽(yáng)性表達(dá)率為36.4%，有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的FHL1陽(yáng)性表達(dá)率為42.9%。 結(jié)論 FHL1蛋白和FHL1基因在甲狀腺乳頭狀癌中均低表達(dá)，提示在甲狀腺乳頭狀癌中FHL1可能起抑制癌細(xì)胞的作用。

[關(guān)鍵詞] 甲狀腺乳頭狀癌；FHL1基因；FHL1蛋白；抑癌基因

[中圖分類號(hào)] R736.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）32-0005-03

[Abstract] Objective To study the expression and clinical signifiance of FHL1 protein and FHL1 gene in thyroid carcinoma. Methods Real-time quantitative PCR and protein hybridization were used to detect the expression of FHL1 gene and protein in papillary thyroid carcinoma specimens and nodular goiter specimens. Results Real-time quantitative PCR indicated that FHL1 gene was highly expressed in nodular goiter， and lowly expressed in papillary thyroid carcinoma. The relative expression amount was（0.4538±0.0074）， which was significant from the statistical analysis（P<0.05）； protein hybridization suggested that FHL1 protein was lowly expressed in papillary thyroid carcinoma（0.4033±0.0296）， and was highly expressed in nodular goiter（0.8021±0.0269）， which was significant from the statistical analysis（P<0.05）. In PTC group， the positive expression rate of FHL1 was 41.4% in females， and the positive expression rate of FHL1 was 36.4% in males. The positive expression rate of FHL1 in cervical lymph node metastasis was 42.9%. Conclusion FHL1 protein and FHL1 gene are lowly expressed in papillary thyroid carcinoma， suggesting that FHL1 may play a role in inhibiting cancer cells in papillary thyroid carcinoma.

[Key words] Papillary thyroid carcinoma； FHL1 gene； FHL1 protein； Cancer suppressor gene

近年來(lái)，全球大宗臨床數(shù)據(jù)分析顯示甲狀腺癌尤其是甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）發(fā)病率逐年增高，其發(fā)病率占甲狀腺癌的90%以上，尤以女性發(fā)病率高最為常見(jiàn)，對(duì)其發(fā)病機(jī)理及機(jī)制研究也是目前研究的熱點(diǎn)之一。本研究旨在探討FHL1基因和甲狀腺乳頭狀癌發(fā)病的內(nèi)在機(jī)制，F(xiàn)HL1（four and half LIM domain protein 1）基因是近年人類發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，在Src和Cas信號(hào)通路下游特異性抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在多種惡性腫瘤如肝癌、肺癌、腎癌中均表達(dá)，并且表達(dá)是下降的，研究發(fā)現(xiàn)其在多種惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制中扮演抑癌基因角色。本文從基因和蛋白方面研究甲狀腺乳頭狀癌FHL1的表達(dá)情況，為甲狀腺乳頭狀癌的具體發(fā)病機(jī)制提供微觀生物學(xué)證據(jù)。

1資料與方法

1.1 一般資料

組織樣本：選自浙江省臺(tái)州市中心醫(yī)院腫瘤外科2016年1～12月期間的手術(shù)切除組織標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)組（PTC組）甲狀腺乳頭狀癌40例，男11例，女29例，年齡29～59歲，平均44.3歲。對(duì)照組為結(jié)節(jié)性甲狀腺腫40例，男10例，女30例，年齡32～62歲，平均45.2歲。標(biāo)本體積約5 mm×5 mm×5 mm，重約0.5 g，所有標(biāo)本病理均經(jīng)過(guò)病理學(xué)證實(shí)，并且取材經(jīng)過(guò)患者及其家屬同意，所有標(biāo)本留取后于30 min內(nèi)放置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑及儀器：垂直電泳槽及轉(zhuǎn)膜槽、RNA提取試劑盒、Quant cDNA合成試劑盒、兔抗人FHL1抗體、Real Master Mix（SYBR Green）試劑盒、DAB顯色試劑盒、Stepone PCR儀。endprint

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)定量PCR方法 PCR引物序列（FHL1基因）見(jiàn)表1。提取新鮮的甲狀腺乳頭狀癌及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫標(biāo)本各40例，每例樣本重約0.2 g，采用Trizol法提取組織中總的RNA，并且測(cè)定RNA提取的濃度及純度，證明提取的RNA完整。cDNA合成（20 μL反應(yīng)體系）：反應(yīng)采用20μL反應(yīng)體系，依據(jù)說(shuō)明書(shū)依次加入試劑，在37℃水浴中放置60 min。參照試劑盒說(shuō)明完成Real-time PCR。

1.2.2 Western-blotting方法 取出新鮮的甲狀腺乳頭狀癌和對(duì)照組標(biāo)本，每組均40例，每例約0.2 g，按照說(shuō)明書(shū)提取組織蛋白，然后測(cè)定總蛋白濃度，配置電泳所需的濃縮膠和分離膠，每個(gè)小孔的用量是50 μg，基準(zhǔn)Marker為5 μL，100 V電泳，繼續(xù)15 V電壓，經(jīng)過(guò)1 h后將膠移至硝基纖維膜上，然后脫脂奶粉脫脂2 h，滴加Ⅰ抗（FHL1抗體濃度1∶1000），置于4℃冰箱過(guò)夜，滴加Ⅱ抗（濃度為1∶5000）室溫靜置1.5 h，滴加發(fā)光液。

1.3 觀察指標(biāo)

實(shí)時(shí)定量PCR觀察指標(biāo)：收集溶解、擴(kuò)增曲線，然后計(jì)算相對(duì)表達(dá)量；Western-blotting方法觀察指標(biāo)：暗室內(nèi)進(jìn)行曝光顯影定影，最后軟件分析蛋白濃度灰度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS16.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 甲狀腺乳頭狀癌中FHL1基因的表達(dá)

FHL1基因與GAPDH的PCR擴(kuò)增曲線及溶解曲線提示無(wú)特異引物二聚體產(chǎn)生，單峰。使用該體系可以對(duì)FHL1基因在PTC組及對(duì)照組中的表達(dá)進(jìn)行定量分析：結(jié)果計(jì)算方法采用2-ΔΔCt，F(xiàn)HL1 mRNA在對(duì)照組及PTC組均有表達(dá)，F(xiàn)HL1 mRNA在PTC組中的表達(dá)為對(duì)照組的（0.4538±0.0074），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖1、2。

2.2甲狀腺乳頭狀癌中FHL1蛋白的表達(dá)結(jié)果（蛋白質(zhì)雜交）

FHL1蛋白在PTC組中相對(duì)表達(dá)量是（0.4033±0.0296），在對(duì)照組中蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量是（0.8021±0.0269），F(xiàn)HL1蛋白在PTC組低表達(dá)，在對(duì)照組高表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 FHL1蛋白表達(dá)與PTC臨床病理學(xué)參數(shù)

在PTC組中，年齡≥45歲的患者為30例，其中11例表達(dá)FHL1蛋白，陽(yáng)性率為36.7%，年齡<45歲10例，其中4例表達(dá)FHL1蛋白，陽(yáng)性率為40.0%；在PTC組中，男11例，其中4例表達(dá)FHL1蛋白，陽(yáng)性率為36.4%，女29例，其中12例表達(dá)FHL1蛋白，陽(yáng)性率為41.4%；頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例，其中9例表達(dá)FHL1蛋白，陽(yáng)性率為42.9%，無(wú)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例，其中8例表達(dá)FHL1蛋白，陽(yáng)性率為42.1%；臨床分期為Ⅰ、Ⅱ共35例，其中14例表達(dá)FHL1，陽(yáng)性率為40.0%，臨床分期為Ⅲ、Ⅳ共5例，其中2例表達(dá)FHL1蛋白，陽(yáng)性率為40.0%。

3討論

甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺癌最常見(jiàn)的病理類型之一，也是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤。近年來(lái)，其發(fā)病率逐年增高，對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究也日益成為熱點(diǎn)[1-4]。抑癌基因和原癌基因的表達(dá)比例失調(diào)目前認(rèn)為是惡性腫瘤發(fā)生的機(jī)制之一[5]。我國(guó)北京市甲狀腺癌發(fā)病率在1995年為1.6/10萬(wàn)，而在2010年為9.9/10萬(wàn)，增長(zhǎng)了518.8%[6]。同樣歐美國(guó)家的甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)病率也是逐年增加的[7，8]。

FHL1的大小為32 kD，其基因位于染色體Xq26.3，F(xiàn)HL1參與細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路和基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)，在骨骼肌、心血管系統(tǒng)的分化和發(fā)育中起重要作用[9]。FHL1由4個(gè)半LIM結(jié)構(gòu)域組成，LIM結(jié)構(gòu)域可以和多種蛋白交互作用并參與細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)錄[10]。現(xiàn)有研究表明，F(xiàn)HLI蛋白對(duì)多種核糖體蛋白基因具有調(diào)控作用，F(xiàn)HL1參與細(xì)胞增殖分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種細(xì)胞活動(dòng)，在多種腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[11，12]。FHL1還是轉(zhuǎn)錄抑制因子，同時(shí)顯示FHL1在多種組織中功能不同[13-15]。研究已證實(shí)FHL1在多種惡性腫瘤中存在表達(dá)，F(xiàn)HL1在多種惡性腫瘤中起抑癌基因的作用，是一種腫瘤抑制因子。FHL1在調(diào)節(jié)雌激素受體信號(hào)傳導(dǎo)和乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)中起很重要的作用，通過(guò)與雌激素受體相互作用抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)[16，17]。FHL1在絕大多數(shù)腺癌、肺癌組織中的表達(dá)明顯下調(diào)[18]。劉哲等[19]研究發(fā)現(xiàn)：FHL1蛋白在胰腺癌中低表達(dá)，并且這種低表達(dá)與胰腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。吳成利等[20]研究發(fā)現(xiàn)：FHL1在未分化胃癌中低表達(dá)，在高分化胃癌中高表達(dá)，并且隨著病理分期的增高其表達(dá)呈下降局勢(shì)，F(xiàn)HL1參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，是影響胃癌患者術(shù)后生存時(shí)間的獨(dú)立因子。

本研究結(jié)果證實(shí)PTC組中FHL1 mRNA的表達(dá)為對(duì)照組的（0.4538±0.0074），提示FHL1基因在PTC組低表達(dá)，在對(duì)照組中高表達(dá)。蛋白質(zhì)雜交結(jié)果證實(shí)FHL1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)是（0.4033±0.0296），明顯低于對(duì)照組的（0.8021±0.0269），以上的數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），從基因及蛋白層面本實(shí)驗(yàn)證實(shí)FHL1基因及其蛋白在甲狀腺乳頭狀癌均低表達(dá)，推測(cè)該基因在甲狀腺乳頭狀癌中起抑癌基因作用。多項(xiàng)研究證實(shí)FHL1在胰腺癌、肺癌、胃癌中均出現(xiàn)低表達(dá)，推測(cè)FHL1在這些惡性腫瘤中起抑癌基因作用，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對(duì)各種惡性腫瘤的研究已經(jīng)深入細(xì)胞、基因、蛋白層面，F(xiàn)HL1基因是一個(gè)近年發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，已證實(shí)FHL1與乳腺惡性腫瘤、肝腫瘤、肺惡性腫瘤、直腸癌等發(fā)生密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)FHL1在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展中起抑癌作用，其內(nèi)在的具體機(jī)制及其如何啟動(dòng)FHL1基因是值得我們進(jìn)一步研究的課題，深入探討甲狀腺乳頭狀癌中FHL1基因的表達(dá)情況，為后續(xù)甲狀腺其他病理類型腫瘤與該基因的研究指明方向。endprint

[參考文獻(xiàn)]

[1] Sipos JA，Mazzaferri EL. Thyroid cancer epidemiology and prognostic variables[J].Clin Oncol（Rcou Radiol），2010，22（6）：395-404.

[2] Enewold L，Zhu K，Ron E，et al.Rising thyroid cancer incidence in the United States by demographic and tumor characteristics，1980-2005[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2009，18（3）：784-791.

[3] Kweon SS，Shin MH，Chung U，et al.Thymid cancer is the most common cancer in women，based on the data from population-based cancer registries，south Korea[J].Jpn J Clin Oncol，2013，43（10）：1039-1046.

[4] WHO. GLOBOCAN2012：Estimated cancer incidence，mortality and prevalence in 2012[EB/OL].[2013-12-31].http：//globocan.iarc.fr/Pages/fac_sheets_population.aspx.

[5] 任立軍，楊廷芳，張成雷.甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移規(guī)律的臨床研究[J].中國(guó)普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2011，（4）：419-422.

[6] 楊雷，孫婷婷，袁延楠，等.1995-2010年北京城區(qū)甲狀腺癌發(fā)病趨勢(shì)及病理特征分析[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2013，47（2）：109-112.

[7] Davies L，Welch HG.Current thyroid cancer trends in the United States[J].JAMA Otolaryngol Head Neck Surg，2014，140（4）：317-322.

[8] Dal Maso L，Lise M，Zambon P，et al.Incidence of thyroid cancer in ltaly，1991-2005： Time trends and age-period-cohort effects[J].Ann Oncol，2011，22（4）：957-963.

[9] Mcgrath MJ，Cottle DL，Nguyen MA，et al.Four and a half LIM protein 1 binds myosin—binding protein C and regulates myosin filament fomaation and sarcomere assembly[J].J Biol Chem，2006，281（11）：7666-7783.

[10] Lin J，Ding L，Jin RJ，et al.Four and a half LIM domains 1（FHL1） and receptor interacting protein of 140kDa（RIP140） interact and cooperate in estrogen signaling[J].Int J Biochem Cell Biol，2009，41（7）：1613-1618.

[11] Rudra D，Zhao Y，Warner JR.Central role of the lfh1p-Fhl1p interaction in the synthesis of yeast ribosomal proteins[J].EMBO J，2005，24（3）：533-542.

[12] Shathasivam T，Kislinger T，Gramolini AO.Genes， proteins and complexes：The multifaceted nature of FHL family proteins in diverse tissues[J].J Cel1 Mol Med，2010，14（12）：2702-2720.

[13] 吳延升，張侖，王旭東，等.甲狀腺乳頭狀癌預(yù)后多因素分析[J].中國(guó)腫瘤臨床，2007，（22）：1294-1297.

[14] Martin DE，Soulard A，Hall MN.TOR regulates ribosomal protein gene expression via PKA and the Forkhead transcription factor FHL1[J].Cell，2004，119（7）：969-979.

[15] 李治，劉春萍，屈新才，等.乳頭狀甲狀腺癌的頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移規(guī)律與手術(shù)方式[J].中國(guó)普通外科雜志，2008，（11）：1051-1053.

[16] Shen YQ，Jia ZY，Nagele RG，et al.Srcuses Cas to suppress Fhl1 in order to promote nonanchored growth and migration of tumor cells[J].Cancer Res，2006，66（3）：1543-1552.

[17] Ding L，Niu C，Zheng Y，et al.FHLI interacts with estrogen receptors and regulates breast cancer cell growth[OL]. J Cell Mol Med，2009，Oct 16. [Epub ahead of print]

[18] Bonner AE，Lemon WJ，Devereux TR，et al.Molecular profiling of mouse lung tumors：Association with tumor progression，lung development，and human lung adenoeareinomas[J].Oncogene，2004，23（5）：1166-1176.

[19] 劉哲，許元鴻，龍錦，等.FHL1在人胰腺癌族中的表達(dá)及其與胰腺癌的侵襲及轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究[J].臨床與病理雜志，2015，35（3）：423-427.

[20] 吳成利，周洲，錢(qián)建新，等.FHL1在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義[J].臨床病理學(xué)雜志，2011，16（3）：228-231.

（收稿日期：2017-09-12）endprint