氯化鋰通過抑制糖原合酶激酶3β維持缺氧心肌的縫隙連接

周 洋，劉凌曦，趙 飛，唐仕海，肖穎彬，彭華利

(1.四川省樂山市人民醫(yī)院胸心外科 614000；2.第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院心血管外科，重慶 400037)

氯化鋰通過抑制糖原合酶激酶3β維持缺氧心肌的縫隙連接

周 洋1，劉凌曦1，趙 飛1，唐仕海1，肖穎彬2，彭華利△

(1.四川省樂山市人民醫(yī)院胸心外科 614000；2.第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院心血管外科，重慶 400037)

目的在心肌慢性缺氧環(huán)境下，研究氯化鋰對(duì)心肌間縫隙連接的影響。方法將25只C57BL/6J小鼠分為常氧組、缺氧組、常氧對(duì)照組、缺氧+生理鹽水組和缺氧+氯化鋰組。缺氧組采用10%氧濃度缺氧4周。缺氧+生理鹽水組和缺氧+氯化鋰組分別腹腔注射生理鹽水和氯化鋰。用電生理和心導(dǎo)管檢查，評(píng)價(jià)心律失常情況、心率和射血分?jǐn)?shù)。用免疫熒光觀察連接蛋白43(Cx43)的分布情況，蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)Cx43、磷酸化糖原合酶激酶3β(p-GSK-3β)和糖原合酶激酶3β(GSK-3β)的水平。結(jié)果與常氧組比，缺氧組小鼠心率較快[(448±18)次/minvs. (401±13)次/min，P<0.05]，左心室射血分?jǐn)?shù)降低[(56±5)%vs. (73±4)%，P<0.05]，心律失常評(píng)分增加[(3.4±0.5)分vs. (0.6±0.5)分，P<0.05]，Cx43表達(dá)減少。與缺氧+生理鹽水組比，缺氧+氯化鋰組的小鼠心率降低[(412±11)次/minvs. (454±18)次/min，P<0.05]，射血分?jǐn)?shù)增加[(69±3)%vs. (55±4)%，P<0.05]，心律失常評(píng)分減少[(1.8±0.4)%vs. (3.0±0.7)%，P<0.05]，Cx43增加，p-GSK-3β與總GSK-3β的比值增加。結(jié)論在心肌慢性缺氧中，氯化鋰能通過抑制GSK-3β信號(hào)，維持縫隙連接，降低心律失常發(fā)生率。

連接蛋白43；氯化鋰；糖原合酶激酶3β；缺氧

心肌間縫隙連接是由連接蛋白構(gòu)成的參與心臟電活動(dòng)的結(jié)構(gòu)。連接蛋白43(connexin 43，Cx43)是參與心室肌細(xì)胞間縫隙連接的主要結(jié)構(gòu)蛋白[1]。研究表明，心肌間Cx43功能與心律失常的發(fā)生密切相關(guān)[2]。而心肌慢性缺氧是發(fā)生心律失常的重要原因之一[3-4]。目前心律失常的研究多集中在心肌梗死后心律失常，而缺氧誘導(dǎo)的室性心律失常研究較少。氯化鋰是一種糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)的抑制劑。最近的研究已經(jīng)證實(shí)氯化鋰(LiCl)在心肌梗死模型中具有抗心律失常的作用[5]。而LiCl對(duì)缺氧誘導(dǎo)的心律失常的作用效果不清楚。因此，本研究通過建立缺氧誘導(dǎo)心律失常的動(dòng)物和細(xì)胞模型和氯化鋰藥物干預(yù)模型，觀察GSK-3β通路和縫隙連接的Cx43的變化，為缺氧心律失常的治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與試劑 從第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買20只C57BL/6J小鼠，8周齡，體質(zhì)量20～25 g，雄性，分為常氧組、缺氧組、常氧對(duì)照組、缺氧+生理鹽水組、缺氧+氯化鋰組(n=5)。主要試劑：LiCl，Cx43抗體(Abcam公司，1∶500)，GSK-3β抗體(CST公司,1∶1 000)，磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)抗體(CST,1∶500)。

1.2方法

1.2.1小鼠慢性缺氧模型 將缺氧組的5只小鼠放入缺氧倉(Ruskinn′s Invivo2-1000)中(氧含量為10%，溫度為25 ℃)，常氧組5只小鼠放入溫度為25 ℃的空氣(氧含量為21%)中培養(yǎng)。缺氧組小鼠自由進(jìn)食和飲水，測(cè)量每天進(jìn)食和進(jìn)水量。按照缺氧組小鼠每天進(jìn)食和進(jìn)水量控制常氧組小鼠食物和水，保證兩組間的每天進(jìn)食量與進(jìn)水量一致。缺氧組和常氧組小鼠均于實(shí)驗(yàn)第4周末取出，進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。通過血紅蛋白水平驗(yàn)證缺氧模型是否構(gòu)建成功。

1.2.2小鼠干預(yù)模型 將缺氧+生理鹽水組5只小鼠和缺氧+氯化鋰組5只小鼠均放入氧含量為10%的缺氧倉中4周，建立慢性缺氧動(dòng)物模型，分為兩組：缺氧+生理鹽水組和缺氧+氯化鋰組，于缺氧第1天開始，每天每只腹腔注射生理鹽水或氯化鋰(90 mg/kg)，直至第4周末。缺氧第4周末，測(cè)定小鼠心功能和取血測(cè)定血紅蛋白后，斷頸處死取心臟，錫箔紙包裹，液氮保存。

1.2.3在體電生理研究 將小鼠麻醉，建立人工通氣和左側(cè)開胸，用電熱毯維持小鼠體溫37 ℃。將電極縫在右室流出道心外膜上，用Bloom刺激器(Fischer Imaging Corporation)生成電刺激脈沖，來誘導(dǎo)室性心律失常。室性心律失常包括室性心動(dòng)過速和心室顫動(dòng)。對(duì)于電脈沖刺激，首先給予150 ms的S1起搏刺激，刺激8個(gè)起搏跳動(dòng)，然后在很短的時(shí)間間隔內(nèi)給予S2，S3，S4 3個(gè)額外刺激。心律失常評(píng)分體系如下：0分，無誘導(dǎo)出室性心律失常；1分，在3個(gè)額外刺激內(nèi)出現(xiàn)非持續(xù)性快速心律失常(持續(xù)時(shí)間小于或等于15次搏動(dòng))；2分，在3個(gè)額外刺激內(nèi)出現(xiàn)持續(xù)性快速心律失常(持續(xù)時(shí)間大于15次搏動(dòng))；3分，在2個(gè)額外刺激內(nèi)出現(xiàn)非持續(xù)性快速心律失常；4分，在2個(gè)額外刺激內(nèi)出現(xiàn)持續(xù)性快速心律失常；5分,在1個(gè)額外刺激內(nèi)出現(xiàn)非持續(xù)性快速心律失常；6分，在1個(gè)額外刺激內(nèi)出現(xiàn)持續(xù)性快速心律失常；7分，在8個(gè)起搏跳動(dòng)內(nèi)出現(xiàn)快速心律失常；8分，在起搏刺激之前心臟停跳。一個(gè)心臟發(fā)生多種形式的心律失常，采用最高的心律失常評(píng)分。

1.2.4免疫熒光觀察Cx43表達(dá) 取4%多聚甲醛固定好的心肌切片，0.1%Triton X-100破膜15 min，山羊血清封閉37 ℃，30 min。加入Cx43一抗，4 ℃過夜，PBS漂洗5×5 min。加入熒光二抗37 ℃孵育1 h，PBS漂洗5×5 min。加入4，6-二脒基-2-苯基吲哚DAPI 37 ℃孵育10 min，PBS漂洗5×5 min。用熒光顯微鏡采圖。

1.2.5蛋白免疫印跡法(Western blot)測(cè)定Cx43，GSK-3β和p-GSK-3β的表達(dá) 取心肌組織用液氮研磨制成粉末。用碧云天蛋白提取試劑盒，提取總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。按照4∶1比例加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液(5×)，混勻并于100 ℃煮沸5 min后，取等量樣本進(jìn)行SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，BSA封閉1 h，Cx43，GSK-3β和p-GSK-3β一抗4 ℃孵育過夜，以β-actin為內(nèi)參。TBST漂洗3次，每次10 min。再加入相應(yīng)的二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，每次10 min，化學(xué)發(fā)光顯影，凝膠成像系統(tǒng)采集圖片。圖像用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)定目的條帶和內(nèi)參條帶的灰度值。

1.2.6心導(dǎo)管檢測(cè)左心室射血分?jǐn)?shù)和心率 用異氟烷麻醉小鼠，氣管切開，插管建立人工通氣，分離小鼠右側(cè)頸動(dòng)脈，經(jīng)小鼠頸動(dòng)脈置入心導(dǎo)管(Millar Instruments Inc)，進(jìn)入左心室，記錄相關(guān)血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)。注射30%高滲鹽水5 μL進(jìn)行鹽水校正，取血進(jìn)行放入定標(biāo)比色皿(Millar Instruments Inc)進(jìn)行容積校正，利用PowerLab 4/30數(shù)據(jù)采集軟件(AD Instruments Inc)計(jì)算射血分?jǐn)?shù)和心率。

2 結(jié) 果

2.1各組室性心律失常情況和左心功能變化 與常氧組相比，缺氧組的心率明顯加快(P<0.05)，左心室射血分?jǐn)?shù)明顯降低(P<0.05)，心律失常評(píng)分明顯增加(P<0.05)。結(jié)果見圖1。

A：心率分析圖；B：射血分?jǐn)?shù)分析圖；C：心律失常評(píng)分分析圖。a:P<0.05，與常氧組比較

圖1兩組心率、左心室射血分?jǐn)?shù)和心律失常評(píng)分情況

A：常氧組(免疫熒光×400)；B：缺氧組(免疫熒光×400)；C：Western blot及其分析圖。a：P<0.05，與常氧組比較

圖2兩組Cx43的分布和表達(dá)情況

A：心率分析圖；B：射血分?jǐn)?shù)分析圖；C：心律失常評(píng)分分析圖；1：常氧組；2：缺氧+生理鹽水組；3：缺氧+氯化鋰組。a：P<0.05，與缺氧+生理鹽水組比較；b：P<0.05，與常氧組比較

圖3 3組心率、左心室射血分?jǐn)?shù)和心律失常評(píng)分情況

2.2缺氧小鼠模型Cx43細(xì)胞分布和表達(dá)變化 缺氧組的Cx43在縫隙連接處的水平低于常氧組(P<0.05)，且蛋白表達(dá)水平低于常氧組(P<0.05)，見圖2。

A：常氧組；B:缺氧+生理鹽水組;C：缺氧+氯化鋰組

圖4 3組Cx43的分布情況(免疫熒光×400)

2.3氯化鋰對(duì)缺氧誘導(dǎo)的心律失常和左心功能的影響 缺氧+氯化鋰組的小鼠心率、左心室射血分?jǐn)?shù)和心律失常評(píng)分與缺氧+生理鹽水組比較，均有明顯變化(P<0.05)，見圖3。缺氧+氯化鋰組的心率、左心室射血分?jǐn)?shù)與常氧組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而心律失常評(píng)分仍較常氧組高(P<0.05)。

2.4氯化鋰對(duì)缺氧小鼠模型中Cx43的分布影響 缺氧+氯化鋰組的小鼠Cx43在縫隙連接處的水平較缺氧+生理鹽水組有顯著改變。而缺氧+氯化鋰組與常氧組比較變化無明顯變化，見圖4。

2.5氯化鋰對(duì)缺氧小鼠模型中Cx43和GSK3β的蛋白水平影響 與缺氧+生理鹽水組相比，缺氧+氯化鋰組的小鼠心肌中Cx43明顯增加(P<0.05)，且p-GSK-3β的水平也明顯增加(P<0.05)，見圖5。

1：常氧組；2：缺氧+生理鹽水組；C：缺氧+氯化鋰組；a：P<0.05，與缺氧+生理鹽水組比較；b：P<0.05，與常氧組比較

圖5 3組的Cx43、p-GSK-3β和GSK-3β的蛋白表達(dá)情況

3 討 論

縫隙連接是一類能介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞信號(hào)和傳導(dǎo)電信號(hào)，并允許離子和第二信使等小分子交換的細(xì)胞間半通道(連接子)。每一個(gè)連接子由6個(gè)四聚體的連接蛋白組成。連接蛋白43(connexin 43，Cx43)是心室肌縫隙連接主要結(jié)構(gòu)蛋白，也是心肌電活動(dòng)的主要決定因素[1]。心肌細(xì)胞的Cx43功能失調(diào)會(huì)導(dǎo)致病理性室性心律失常。在豬的前壁心肌梗死模型中，轉(zhuǎn)染Cx43將減少愈合疤痕邊緣的室性心律失常的發(fā)生率[2]。慢性缺氧是大部分心血管疾病共有的病理生理過程，例如紫紺型先天性心臟病[6]，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病[7]等。而心肌的慢性缺氧常常會(huì)影響心電活動(dòng)，增加室性心律失常發(fā)生率[3]。29.8%矯正的法絡(luò)四聯(lián)征患者會(huì)發(fā)生不同程度的心律失常[4]。對(duì)于合并器質(zhì)性心臟病的患者，室性心律失常的發(fā)生易引起猝死等嚴(yán)重后果。關(guān)于缺氧誘導(dǎo)的心律失常，相比于其他類型的心律失常，研究較少，機(jī)制也不清楚。

氯化鋰長期被用來治療雙向心境障礙癥，具有抑制GSK-3β和模擬經(jīng)典Wnt-1信號(hào)引起β-鏈蛋白在細(xì)胞核中積累的作用[8]。相關(guān)研究證實(shí)氯化鋰具有抗心律失常的作用。氯化鋰能通過激活轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2)/血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)信號(hào)誘導(dǎo)抗氧化反應(yīng)，減弱神經(jīng)生長因子(NGF)介導(dǎo)的交感再神經(jīng)化，發(fā)揮抗心律失常作用[5]。氯化鋰能通過降低心肌梗死后心律失常發(fā)生率[5]。除此之外，鋰離子還能與鈉離子競(jìng)爭(zhēng)鈉通道[9]，或作為鈉通道的阻斷劑[10]，來調(diào)節(jié)心律失常。

本研究通過建立缺氧誘導(dǎo)心律失常的模型，證實(shí)了缺氧具有明顯的致心律失常的作用。同時(shí)通過藥物干預(yù)，發(fā)現(xiàn)氯化鋰能對(duì)缺氧誘導(dǎo)的心律失常具有一定的保護(hù)作用。并且研究進(jìn)一步證實(shí)了氯化鋰通過激活GSK-3β信號(hào)調(diào)節(jié)縫隙連接的Cx43的水平變化，發(fā)揮抗心律失常作用。這些結(jié)果為臨床治療心律失常提供了新的藥物研究靶點(diǎn)，同時(shí)提示在治療心律失常時(shí)注意對(duì)心肌缺氧的預(yù)防。

最近研究發(fā)現(xiàn)，氯化鋰調(diào)節(jié)連接蛋白Cx43，不僅僅通過GSK-3β信號(hào)促進(jìn)Cx43基因的轉(zhuǎn)錄，還能增加Cx43的磷酸化，增加Cx43蛋白的穩(wěn)定性[8]。同時(shí)，氯化鋰不僅能抑制GSK-3β，還能通過磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)信號(hào)依賴的方式參與調(diào)節(jié)交感再神經(jīng)化，參與抗心律失常的作用[5]。除此之外，鋰離子還能激活蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)來調(diào)節(jié)GSK-3β信號(hào)，來調(diào)節(jié)Cx43表達(dá)[11-12]。另外，氯化鋰還增加縫隙連接的功能，加強(qiáng)細(xì)胞間通訊的效率和細(xì)胞同步化[8，12]。因此，氯化鋰的抗心律失常作用的研究，將有利于闡明不同原因引起的心律失常的具體機(jī)制。特別是，缺氧引起的心律失常是目前研究較少的方向。加強(qiáng)缺氧心律失常的重視程度，將有利于臨床上對(duì)心律失常的預(yù)防和治療，減少相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生。

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Lithiumchloridemaintainsthegapjunctionofhypoxicmyocardiumbyinhibitingglycogensynthasekinase3β

ZhouYang1,LiuLingxi1,ZhaoFei1,TangShihai1,XiaoYingbin2,PengHuali1△

(1.DepartmentofCardiothoracicSurgery,thePeople′sHospitalofLeshancity,Leshan,Sichuan614000,China;2.DepartmentofCardiovascularSurgery，XinqiaoHospital,theThirdMilitaryMedicalUniversity，Chongqing400037，China)

ObjectiveTo study the effect of lithium chloride on the gap junction in the myocardium under chronic hypoxia.MethodsTwenty-five C57BL/6J mice were randomly divided into normoxia group,hypoxia group,normoxic control group,hypoxia + saline group and hypoxia + lithium chloride group.Hypoxia group was treated with 10% oxygen concentration for 4 weeks.Hypoxia + saline group and hypoxia + lithium chloride group were intraperitoneal injection of saline and lithium chloride.Electrophysiology and cardiac catheterization were used to assess arrhythmias,heart rate and ejection fraction.The expression of Cx43,phosphorylated glycogen synthase kinase 3β(p-GSK-3β) and glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) were detected by Western blot.ResultsCompared with the normoxia group,the hypoxia group had a faster heart rate [(448 ± 18) bpmvs. (401 ± 13) bpm,P<0.05),and the ejection fraction was decreased [(56±5)%vs. 73±4)%,P<0.05],arrhythmia score increased [(3.4±0.5)%vs. (0.6±0.5)%,P<0.05],Cx43 expression was decreased.Compared to hypoxia + normal saline group,the heart rate decreased[(412±11)bpmvs. (454±18)bpm，P<0.05],ejection fraction increased[(69±3)%vs. (55±4)%,P<0.05],the score of arrhythmia decreased [(1.8±0.4)%vs. (3.0±0.7)%,P<0.05] in hypoxia + lithium chloride group,the expression of Cx43 and the rate of p-GSK-3β to GSK-3β were increased.ConclusionDuring the chronic hypoxia,lithium chloride can sustain the gap junction through inhibition of GSK-3β signaling way,which can also reduce the rate of arrhythmia.

Connexin 43;lithium chloride;glycogen synthase kinase-3β;hypoxia

周洋(1980-)，主治醫(yī)師，博士，主要從事心肌慢性缺氧的研究。△

，E-mail:PengHL08@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.34.007

R541.7

A

1671-8348(2017)34-4777-03

2017-08-05

2017-09-07)