t-PA負(fù)向調(diào)控p75NRT改變血管外膜自主神經(jīng)重構(gòu)參與動(dòng)脈粥樣硬化*

張勁松,杜榮增,王中群,李光宇,張新茹,張梓桑

(江蘇大學(xué)附屬江濱醫(yī)院心內(nèi)科， 江蘇鎮(zhèn)江 212001)

論著·基礎(chǔ)研究

t-PA負(fù)向調(diào)控p75NRT改變血管外膜自主神經(jīng)重構(gòu)參與動(dòng)脈粥樣硬化*

張勁松,杜榮增△,王中群,李光宇,張新茹,張梓桑

(江蘇大學(xué)附屬江濱醫(yī)院心內(nèi)科， 江蘇鎮(zhèn)江 212001)

目的研究組織型纖溶酶原激活物(t-PA)對(duì)p75NTR、炎性反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激的作用，以及對(duì)內(nèi)膜增生的影響。方法對(duì)糖尿病兔給予頸動(dòng)脈外膜剝除建立動(dòng)物模型，然后進(jìn)行血管損傷處理，同時(shí)給予t-PA控釋微球后，免疫熒光染色分別觀察對(duì)照組和處理組神經(jīng)重構(gòu)的變化情況，同時(shí)檢測(cè)給予t-PA控釋微球?qū)σ阴Ｄ憠A和去甲腎上腺素釋放的影響。RT-PCR檢測(cè)t-PA釋控微球?qū)植垦芙M織的炎癥、免疫反應(yīng)和氧化應(yīng)激的影響。采用交感神經(jīng)元與平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)，之后給予乙二醛進(jìn)行處理作為動(dòng)脈粥樣硬化細(xì)胞模型，以t-PA處理組作為干預(yù)組，觀察t-PA對(duì)膽堿能神經(jīng)元數(shù)目，與平滑肌細(xì)胞之間的突觸連接數(shù)目、乙酰膽堿分泌的影響。RT-PCR檢測(cè)t-PA-MMP-p75NTR-NF-κB信號(hào)通路的改變。結(jié)果給予t-PA控釋微球能明顯增加膽堿能神經(jīng)元數(shù)目和神經(jīng)纖維(P<0.05)而不影響去甲腎上腺素能神經(jīng)元數(shù)目和神經(jīng)纖維(P>0.05)，并且導(dǎo)致乙酰膽堿釋放增多(P<0.05)，最終抑制內(nèi)膜增生(P<0.05)。離體交感神經(jīng)元與平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)，之后給予乙二醛處理作為動(dòng)脈粥樣硬化細(xì)胞模型中t-PA促進(jìn)膽堿能神經(jīng)元增殖、增加乙酰膽堿的分泌和促進(jìn)膽堿能神經(jīng)纖維的數(shù)目增多(P<0.05)。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)t-PA能夠激活MMPs，抑制p75NTR-NF-κB信號(hào)通路(P<0.05)。結(jié)論t-PA激活MMPs反饋抑制p75NTR-NF-κB信號(hào)通路增加血管外膜自主神經(jīng)重構(gòu)延緩動(dòng)脈粥樣硬化疾病的發(fā)生發(fā)展。

自主神經(jīng)重構(gòu);纖溶酶原激活劑;p75NTR;動(dòng)脈粥樣硬化;血管外膜

血管外膜自主神經(jīng)重構(gòu)障礙可導(dǎo)致血管的結(jié)構(gòu)、功能及機(jī)體的炎性反應(yīng)和代謝狀態(tài)紊亂，參與動(dòng)脈粥樣硬化疾病的發(fā)生發(fā)展[1-3]。血管外膜自主神經(jīng)主要由分布在動(dòng)脈內(nèi)膜/外膜交界區(qū)域的膽堿能神經(jīng)纖維，和位于動(dòng)脈外膜區(qū)域的去甲腎上腺素能神經(jīng)纖維構(gòu)成[4-5]。組織型纖溶酶原激活物(tissue plasminogen activator,t-PA)是除了尿激酶以外主要已知的可有效降解動(dòng)脈壁細(xì)胞外基質(zhì)的神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)物。p75NTR作為神經(jīng)元的負(fù)向調(diào)控受體即凋亡相關(guān)受體，其對(duì)中樞膽堿能神經(jīng)元具有選擇性抑制作用，基因敲除p75NTR可增加中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膽堿能神經(jīng)元數(shù)目、調(diào)節(jié)細(xì)胞大小并抑制細(xì)胞的凋亡，其表現(xiàn)類似神經(jīng)重構(gòu)，但在外周神經(jīng)中是否同樣存在類似作用還缺乏研究。在乳腺轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞中，p75NTR負(fù)向調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和組織金屬蛋白酶抑制劑11(TIMP11)，這一調(diào)控通路提示神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子系統(tǒng)與血管外膜的局部纖溶系統(tǒng)可能存在某種相關(guān)性，如t-PA可能通過(guò)激活MMP反饋抑制p75NTR，隨后有下游的核因子κB(NF-κB)和JNK介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而影響神經(jīng)細(xì)胞軸突的延伸及外周神經(jīng)的神經(jīng)重構(gòu)等，有必要進(jìn)行深入研究。本實(shí)驗(yàn)主要研究t-PA通過(guò)激活MMP反饋抑制p75NTR，促進(jìn)局部膽堿能神經(jīng)纖維再生，抑制局部血管神經(jīng)重構(gòu)，使局部血管的交感/副交感神經(jīng)比例傾向于副交感，使過(guò)多的膽堿能神經(jīng)纖維末梢釋放的乙酰膽堿等物質(zhì)發(fā)揮抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化應(yīng)激作用，最終抑制內(nèi)膜增生。本實(shí)驗(yàn)不但有利于進(jìn)一步闡明動(dòng)脈粥樣硬化新的調(diào)控機(jī)制，豐富動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的新理論，而且將會(huì)為研制消退動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的新型藥物打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要材料 t-PA購(gòu)自美國(guó)R&D公司；雌性新西蘭兔購(gòu)自濟(jì)南金豐實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；高糖、高脂飼料(10%豬油、37%白蔗糖混合53%基礎(chǔ)飼料)由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供;蘇木素購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；伊紅購(gòu)自上海試劑三廠；重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)購(gòu)自美國(guó)R&D公司;兔乙酰膽堿和去甲腎上腺素ELISA試劑盒購(gòu)自上海瀘鼎生物科技有限公司；膽堿轉(zhuǎn)移酶和酪氨酸羥化酶一抗購(gòu)自上海碩博生物有限公司； 反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)試劑盒購(gòu)自碧云天生物科技有限公司;引物由上海生工生物科技有限公司合成；熒光倒置光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；體視顯微鏡(中國(guó)江南儀器有限公司)；顯微手術(shù)器械(上海手術(shù)器械廠)；病理包埋機(jī)(中國(guó)派斯杰公司)；病理石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；-80 ℃低溫冰箱(日本Sanyo公司)；RT-PCR儀(美國(guó)ABI公司)。

1.2糖尿病兔頸動(dòng)脈外膜剝除血管損傷模型的建立 60只6個(gè)月體質(zhì)量均在3.5 kg左右的雌性新西蘭兔給予高糖、高脂飼料單籠喂養(yǎng)誘發(fā)糖尿病，通過(guò)代謝指標(biāo)(血糖、血脂、糖化血紅蛋白等)篩選出成功建立模型的42只糖尿病兔。暴露兔的頸動(dòng)脈，采用膠原酶結(jié)合物理方法剝除外膜制成血管損傷動(dòng)物模型備用，在手術(shù)后放置t-PA控釋微球在剝離外膜血管與未剝離的交界處做為處理組，對(duì)照組在相同位置放入介質(zhì)微球，在潔凈環(huán)境下繼續(xù)高脂喂養(yǎng)14 d后處死動(dòng)物并取材。

1.3免疫熒光染色和蘇木精-伊紅(HE)染色 戊巴比妥鈉腹腔注射(50 mg/kg)麻醉后，4%多聚甲醛灌注新西蘭兔，在顯微鏡下分離血管放入4%多聚甲醛固定， 4 ℃保存。取下的標(biāo)本石蠟包埋前測(cè)量動(dòng)脈瘤的頸寬、瘤高。之后10%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色和光鏡檢查。另一部分標(biāo)本進(jìn)行熒光染色，OTC包埋動(dòng)脈樣品常規(guī)5 μm切片，切片脫蠟，水化，3%甲醇-過(guò)氧化氫孵育10 min，PBS 洗 10 min×3次，0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH為6.0)抗原修復(fù)98 ℃持續(xù)20 min，自然冷卻至室溫， PBS常規(guī)漂洗，用Triton-X100 BSA封閉37 ℃ 2 h，加一抗分別使用膽堿轉(zhuǎn)移酶(choline acetyltransferase,ChAT)抗體標(biāo)記膽堿能神經(jīng)纖維、絡(luò)氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)抗體標(biāo)記去甲腎上腺素能神經(jīng)纖維，4 ℃過(guò)夜，第2天PBS常規(guī)漂洗，熒光二抗37 ℃孵育2 h，PBS常規(guī)漂洗甘油封片。顯微鏡觀察拍照。HE染色圖片和免疫熒光圖片采用萊卡RX250/QWN進(jìn)行圖像采集，內(nèi)膜的增生以新生內(nèi)膜與中膜的比例(I/M)評(píng)價(jià)新生內(nèi)膜厚度。IPP軟件用于細(xì)胞數(shù)目的統(tǒng)計(jì)。

1.4交感神經(jīng)元與平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng) 平滑肌細(xì)胞和交感神經(jīng)元的分離：取新西蘭兔血管組織,充分剪碎后用0.25%的胰酶消化的方法獲得單細(xì)胞懸液,在含有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中差速貼壁1 h,取上清離心,以去除成纖維細(xì)胞。收集未貼壁細(xì)胞,其中主要為平滑肌細(xì)胞。找到交感神經(jīng)干(兔子的迷走神經(jīng)和交感神經(jīng)是分開(kāi)行走的，不像反芻動(dòng)物在頸部是迷走神經(jīng)、交感神經(jīng)干向前行走的)，然后順交感干向前至顱底腹側(cè)，找到頸前神經(jīng)節(jié)，用眼科剪準(zhǔn)確地夾住頸前神經(jīng)節(jié)的前端，取出頸前神經(jīng)節(jié)，用注射器和小濾器過(guò)濾到一個(gè)15 mL無(wú)菌的離心管中，加上分離神經(jīng)節(jié)組織。置培養(yǎng)箱中用0.25%的胰酶消化液消化18 min，然后加10 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于組織中作用1～2 min，終止消化。離心后，吸除上清中的細(xì)胞碎片，將沉淀用含5% FBS的DMEM重懸，然后將分離的新生兔平滑肌(濃度為1.0×106個(gè)mL)與分離的平滑肌細(xì)胞細(xì)胞(濃度為2×105個(gè)mL)混合,加入預(yù)先包被的12孔板中,加2 mL含胎牛血清的培養(yǎng)基,50 ng/mL NGF,5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中,進(jìn)行共培養(yǎng)，第2天換液1次[6-7]。

1.5ELISA檢測(cè)乙酰膽堿和去甲腎上腺素 根據(jù)乙酰膽堿和去甲腎上腺素ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)剝離外膜段血管內(nèi)膜的乙酰膽堿和去甲腎上腺素的水平。

1.6RT-PCR 分別隨機(jī)抽取8只處理組新西蘭兔，用Trizol沉淀法提取總 RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。所得 cDNA用于后續(xù)NF-κB、MMP-2、MMP-9、p75NTR的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR反應(yīng)。將GAPDH作為內(nèi)參基因。同時(shí)將 PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序以及做熔解曲線,以保證以上 PCR反應(yīng)產(chǎn)物良好的特異性。計(jì)算△Ct值用來(lái)比較給藥前后mRNA的表達(dá)變化。每個(gè)PCR反應(yīng)都設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。引物序列如下，NF-κB正向引物：5′-GGT GCC TTT TGC GAG CAG TAT C-3′；反向引物：5′-CGT ATG GAC CAG AAT GTG ACG G-3′。MMP-2正向引物：5′-CTG GCT GTG CAA TAC CTG AA-3′；反向引物：5′-CAG GGT CCA TAG CTC ATC GT-3′。MMP-9正向引物：5′-ATC TTC CTG GGC AAG CAG TA-3′；反向引物：5′-CTG GCA CCG ATG AAT GAT CT-3′。p75NTR正向引物：5′-AGG CAC CAC CGA CAA CCT C-3′；反向引物：5′-CAC AAG GCC CAC AAC CAC A-3′。GAAPDH正向引物：5′-ACC ACC ATG GAG AAG GCT GG-3′；反向引物：5′-CTC AGT GTA GCC CAG GAT GC-3′。

2 結(jié) 果

2.1t-PA控釋微球后明顯增加膽堿能神經(jīng)元數(shù)目而不影響去甲腎上腺素能神經(jīng)元 糖尿病兔頸動(dòng)脈外膜剝除血管損傷模型建立后給予t-PA控釋微球，筆者通過(guò)對(duì)臨近剝離外膜的一段仍完整的血管進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)膽堿能神經(jīng)元數(shù)目和去甲腎上腺素能神經(jīng)元。結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理組膽堿能神經(jīng)元的數(shù)目較對(duì)照組明顯增加(P<0.05)，但去甲腎上腺素能神經(jīng)元未受影響(P>0.05),見(jiàn)圖1。

2.2t-PA控釋微球后明顯增加膽堿能神經(jīng)纖維而不影響去甲腎上腺素能神經(jīng)纖維 通過(guò)觀察剝除血管外膜段的單純內(nèi)膜膽堿能神經(jīng)纖維和外膜及內(nèi)膜處去甲腎上腺素能神經(jīng)纖維的變化情況，筆者發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)元數(shù)目結(jié)果一致，處理組膽堿能神經(jīng)纖維較對(duì)照組明顯增加(P<0.05)；而去甲腎上腺素能神經(jīng)纖維未受影響(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

A：免疫熒光圖；B:熒光定量分析圖；a:P<0.05，與對(duì)照組比較

圖1 t-PA對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型兔交感神經(jīng)中膽堿能神經(jīng)元及去甲腎上腺素能神經(jīng)元的影響

A:組織免疫熒光圖；B:熒光定量分析圖；a:P<0.05,對(duì)照組比較

圖2 t-PA控釋微球?qū)δ憠A能神經(jīng)纖維及去甲

腎上腺素能神經(jīng)纖維的影響

A:乙酰膽堿；B：去甲腎上腺素；a:P<0.05，與對(duì)照組比較

圖3兩組大鼠乙酰膽堿和去甲腎上腺素水平比較

2.3t-PA控釋微球后明顯增加膽堿能神經(jīng)纖維末梢釋放的乙酰膽堿而不影響去甲腎上腺素水平不變 通過(guò)ELISA檢測(cè)剝除血管外膜段的單純內(nèi)膜乙酰膽堿、去甲腎上腺素水平發(fā)現(xiàn)處理組膽堿能神經(jīng)纖維末梢釋放的乙酰膽堿較對(duì)照組明顯增加(P<0.05)，去甲腎上腺素水平不變，見(jiàn)圖3。

A:HE染色圖；B:HE染色分析圖；a:P<0.05，與對(duì)照組比較

圖4 t-PA控釋微球?qū)ρ軆?nèi)膜的影響

2.4t-PA控釋微球后明顯降低血管內(nèi)膜的增生 HE染色發(fā)現(xiàn)t-PA控釋微球明顯降低血管內(nèi)膜的增生(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

2.5離體t-PA促進(jìn)膽堿能神經(jīng)元突觸形成，增加乙酰膽堿的分泌和促進(jìn)膽堿能神經(jīng)纖維的數(shù)目 筆者通過(guò)VAChT染色檢測(cè)膽堿能神經(jīng)元突觸形成、膽堿能神經(jīng)纖維的數(shù)目發(fā)現(xiàn)，在離體細(xì)胞中t-PA促進(jìn)膽堿能神經(jīng)元突觸形成，增加乙酰膽堿的分泌和促進(jìn)膽堿能神經(jīng)纖維的數(shù)目增加(均P<0.05)，見(jiàn)圖5。

2.6t-PA能夠激活MMPs反饋抑制p75NTR-NF-κB信號(hào)通路 為了進(jìn)一步探討t-PA影響膽堿能神經(jīng)元的機(jī)制，筆者用RT-PCR檢測(cè)MMP-2，MMP-9，p75NTR和NF-κB的表達(dá)的情況。發(fā)現(xiàn)在離體培養(yǎng)的交感神經(jīng)元中t-PA能夠增加MMP-2和MMP-9的表達(dá)，抑制p75NTR的表達(dá)(均P<0.05)，抑制NF-κB的表達(dá)見(jiàn)圖6。

A:膽堿能神經(jīng)元突觸；B:乙醇膽堿；C：膽堿能神經(jīng)纖維；a：P<0.05，與對(duì)照組比較

圖5兩組大鼠膽堿能神經(jīng)元突觸、乙醇膽堿、膽堿能神經(jīng)纖維比較

A：MMP-2；B:MMP-9；C：p75NTR；D:NF-κB；a：P<0.05，與對(duì)照組比較

圖6兩組大鼠MMP-2、MMP-9、p75NTR、NF-κB水平比較

3 討 論

血管外膜自主神經(jīng)重構(gòu)障礙可導(dǎo)致血管的結(jié)構(gòu)、功能及機(jī)體的炎性反應(yīng)和代謝紊亂，參與動(dòng)脈粥樣硬化疾病的發(fā)生發(fā)展[1-3]。目前的基礎(chǔ)研究表明，除血管內(nèi)膜損傷可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化病變之外，外膜病變也可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化而且其起病時(shí)間還早于內(nèi)膜病變。研究提示若早期對(duì)外膜實(shí)施一定的干預(yù)措施可能延緩或中止AS病變的進(jìn)程，因此近年來(lái)動(dòng)脈粥樣硬化疾病的基礎(chǔ)研究重點(diǎn)已由血管內(nèi)膜和中層轉(zhuǎn)向外膜[8]。血管周圍分布有大量的神經(jīng)纖維，這些神經(jīng)纖維除了含有傳統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素和乙酰膽堿之外，還含有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(如BDNF、NGF、NT-3和CDNF等)及t-PA等。神經(jīng)末梢中的t-PA與外膜其他細(xì)胞分泌的PAI-1構(gòu)成局部纖溶系統(tǒng)，t-PA是除了尿激酶以外已知主要的可有效降解動(dòng)脈壁細(xì)胞外基質(zhì)的神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)物。在移植的靜脈血管周圍通過(guò)控釋給予t-PA(血管周圍放置微球，控釋t-PA)在細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生趨化性梯度能夠引導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞從血管腔中遷移出來(lái)，Okdama等[9]的研究發(fā)現(xiàn)術(shù)后7 d t-PA處理組的血管平滑肌細(xì)胞大多分布于血管外周，其內(nèi)膜/中層比值明顯降低，并抑制新生內(nèi)膜的增生。但t-PA抑制新生內(nèi)膜增生和防止術(shù)后再狹窄的作用，目前仍有爭(zhēng)論。Kodama等[10]通過(guò)反轉(zhuǎn)錄病毒載體將t-PA和一氧化氮合酶(eNOS)基因分別轉(zhuǎn)染平滑肌細(xì)胞，再將細(xì)胞種植至聚四氟乙烯編織的移植物中，隨后將血管移植物置入兔的主動(dòng)脈內(nèi)，在術(shù)后30 d和100 d后分別檢查移植物內(nèi)的血栓形成和內(nèi)膜增生情況，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)基因工程修飾的表達(dá)t-PA的血管平滑肌(SMC)盡管有助于抑制移植物腔內(nèi)血栓的形成，但卻導(dǎo)致內(nèi)膜顯著增生，而僅有在種植細(xì)胞內(nèi)表達(dá)eNOS才可抑制新生內(nèi)膜的增生。本研究發(fā)現(xiàn)給予t-PA控釋微球后明顯增加膽堿能神經(jīng)纖維而不影響去甲腎上腺素能神經(jīng)纖維，乙酰膽堿釋放增多，炎性反應(yīng)被抑制，最終抑制內(nèi)膜增生。離體交感神經(jīng)元與平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)，之后給予乙二醛處理體外培養(yǎng)的交感神經(jīng)元作為動(dòng)脈粥樣硬化細(xì)胞模型中，t-PA促進(jìn)膽堿能神經(jīng)元增殖、增加乙酰膽堿的分泌和促進(jìn)膽堿能神經(jīng)纖維的數(shù)目，而不影響去甲腎上腺素能神經(jīng)元。

神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中主要有BDNF、NGF、絡(luò)氨酸激酶受體(tyrosine kinase receptor,Trk)和p75NTR,在動(dòng)脈粥樣硬化病變中BDNF和p75NTR高表達(dá)，而NGF低表達(dá)，且其表達(dá)程度與病變的嚴(yán)重程度顯著相關(guān)。 NGF、BDNF、正向調(diào)控的Trk及負(fù)向調(diào)控的p75NTR構(gòu)成局部神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子系統(tǒng)。p75NTR作為神經(jīng)元的負(fù)向調(diào)控受體即凋亡相關(guān)受體，其對(duì)中樞膽堿能神經(jīng)元具有選擇性抑制作用，基因敲除p75NTR可增加中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膽堿能神經(jīng)元數(shù)目、細(xì)胞大小并抑制細(xì)胞的凋亡，其表現(xiàn)類似神經(jīng)重構(gòu)，但在外周神經(jīng)中是否同樣存在還缺乏研究[11]。t-PA可能通過(guò)激活MMPs反饋抑制p75NTR，隨后有下游的NF-κB和JNK介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)， 在乳腺轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞中，p75NTR負(fù)向調(diào)節(jié)MMP和TIMP11，這一調(diào)控通路提示神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子系統(tǒng)與血管外膜的局部纖溶系統(tǒng)可能存在某種相關(guān)性[12-13]。本研究結(jié)果表明t-PA能夠增加MMP-2和MMP-9的表達(dá)，抑制p75NTR的表達(dá)，抑制NF-κB的表達(dá)。綜上所述t-PA通過(guò)激活MMPs反饋抑制p57NTR，促進(jìn)局部膽堿能神經(jīng)纖維再生，抑制局部血管神經(jīng)重構(gòu)，使局部血管的交感/副交感神經(jīng)比例傾向于副交感，使過(guò)多的膽堿能神經(jīng)纖維末梢釋放的乙酰膽堿等物質(zhì)發(fā)揮抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化應(yīng)激作用，最終抑制內(nèi)膜增生，延緩動(dòng)脈粥樣硬化疾病的發(fā)生發(fā)展。

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t-PAnegativelyregulatingp75NRTforinvolvinginatherosclerosisbychangingreconstructionofvascularoutermembraneautonomicnerve*

ZhangJingsong,DuRongzeng△，WangZhongqun,LiGuangyu,ZhangXinru,ZhangZisang

(DepartmentofCardiology,AffiliatedJiangbinHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang,Jiangsu212001,China)

ObjectiveTo study the effect of tissue plasminogen activator (t-PA) on p57NTR,inflammatory reaction,immune regulation and oxidative stress and its effect on intimal hyperplasia.MethodsThe vascular injury treatment was performed in the diabetic rabbit model with carotid arterial adventitia stripping,meanwhile t-PA controlled release microspheres were given,the nerve distribution in the local blood vessels was observed by immunohistochemical staining.The change of nerve remodeling in the control group and treatment group was observed,meanwhile the effect of giving t-PA controlled release microspheres on the release of acetylcholine and norepinephrine was detected.RT-PCR was used to detect local vascular tissue inflammation,immune effects and oxidative stress.The sympathetic neurons and smooth muscle cell co-culture was adopted,then giving glyoxal treatment as the atherosclerosis cell model.With the t-PA treatment group as the intervention group,the effect of t-PA on the number of cholinergic neuron,and synaptic connections between the smooth muscle cells and acetylcholine secretion was observed.The change of t-PA-MMP-p75NTR and NF-kappa B signaling pathway were detected by RT-PCR.ResultsThe vascular injury treatment was performed in the diabetic rabbit model with carotid arterial adventitia stripping,meanwhile t-PA controlled release microspheres were given,the nerve distribution in the local blood vessels was observed by immunohistochemical staining.The change of nerve remodeling in the control group and treatment group was observed,meanwhile the effect of giving t-PA controlled release microspheres on the release of acetylcholine and norepinephrine was detected.RT-PCR was used to detect local vascular tissue inflammation,immune effects and oxidative stress.The sympathetic neurons and smooth muscle cell co-culture was adopted,then giving glyoxal treatment as the atherosclerosis cell model.With the t-PA treatment group as the intervention group,the effect of t-PA on the number of cholinergic neuron,and synaptic connections between the smooth muscle cells and acetylcholine secretion was observed.The change of t-PA-MMP-p75NTR and NF-kappa B signaling pathway were detected by RT-PCR.Conclusiont-PA activates MMPs and feedback inhibits p75NTR-NF-kappa B signaling pathway to increase vascular adventitia autonomic nerve reconstruction and delay the occurrence and development of atherosclerosis disease.

] autonomic nerve reconstruction；plasminogen activators；p75NTR;atherosclerosis；vascular adventitia

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.36.006

2015年江蘇省鎮(zhèn)江市課題(SH2015036)。

張勁松(1976-)，碩士，主治醫(yī)師，主要從事動(dòng)脈粥樣硬化研究。△

，E-mail:dubingchen001@foxmai1.com。

R541.4

A

1671-8348(2017)36-5055-04

2017-08-20

2017-09-28)