陳景震,何小芳,唐 竑,夏 栗,李培旺
(1. 湖南省林業(yè)科學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410004; 2. 新余市林業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展管理局,江西 新余 338000;3. 湖南省農(nóng)林工業(yè)勘察設(shè)計(jì)研究總院,湖南 長(zhǎng)沙 410007)
美國(guó)梾木引種栽培果實(shí)落果生理生化分析研究
陳景震1,何小芳2,唐 竑2,夏 栗3,李培旺1
(1. 湖南省林業(yè)科學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410004; 2. 新余市林業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展管理局,江西 新余 338000;3. 湖南省農(nóng)林工業(yè)勘察設(shè)計(jì)研究總院,湖南 長(zhǎng)沙 410007)
為了探明美國(guó)梾木引種栽培果實(shí)落果致敗誘因,以不同發(fā)育階段美國(guó)梾木果實(shí)為對(duì)象,采用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)化學(xué)成分分析法、紫外分光光度法及色譜分析法等技術(shù)手段對(duì)果實(shí)發(fā)育過(guò)程各生理生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明:在逆境或衰老條件下,果實(shí)內(nèi)可溶性糖含量是持續(xù)增長(zhǎng)的,遞增量 0.67 mg/g,蛋白質(zhì)含量在果實(shí)發(fā)育初期遞增明顯,平均遞增量為 0.6 mg/g,6 月初開(kāi)始下降呈拋物線變化后趨于穩(wěn)定保持在 1.14 mg/g,還原糖由于可能出現(xiàn)的呼吸驟變,含量持續(xù)增加,遞增量為 8.63 mg/g,淀粉含量在發(fā)育初期達(dá)到 2.28 mg/g 后急劇下降,從在 6 月初至落果前保持穩(wěn)定,最終含量保持在 1.96 mg/g;果實(shí)中過(guò)氧化氫活性在發(fā)育初期最強(qiáng),達(dá)到 0.018△OD/min·mg,6 月底至 7 月初活性降至最低點(diǎn),6 月至 7 月突然出現(xiàn)的高溫高濕氣候?qū)е鹿麑?shí)發(fā)育受到影響,表現(xiàn)為對(duì)逆境的不適應(yīng)過(guò)氧化氫酶活性;果實(shí)內(nèi)源激素中細(xì)胞分裂素(ZT)和生長(zhǎng)素(IAA)一直持續(xù)下降,降幅分別為 109.68 μg/g和 38.97 μg/g,赤霉素(GA)呈現(xiàn)拋物線變化,平均遞減幅度 5.89 μg/g,落果前呈小幅度的增長(zhǎng),平均遞增量 3.79 μg/g,脫落酸(ABA)含量急劇降低持續(xù)到 6 月中上旬,平均遞減量 3.06 μg/g,在落果之前脫落酸(ABA)含量基本趨于穩(wěn)定,ABA/ZT 變化穩(wěn)定,ABA/GA 變化呈整體下降趨勢(shì),ABA/IAA 變化呈緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì),脫落酸(ABA)占據(jù)主導(dǎo)地位導(dǎo)致落果;通過(guò)相關(guān)性分析,可溶性糖變化與還原糖變化呈極顯著相關(guān),與生長(zhǎng)素(IAA)變化呈負(fù)極顯著相關(guān),可溶性糖含量增加,果實(shí)生長(zhǎng)變慢,能耗過(guò)快,成為果實(shí)落果的誘因。
美國(guó)梾木;落果;內(nèi)含物;過(guò)氧化氫酶活性;內(nèi)源激素
美國(guó)梾木(Cornus spp.),山茱萸科梾木屬,為落葉灌木或小喬木,原產(chǎn)美國(guó)馬薩諸塞州至佛羅里達(dá)州、堪薩斯州,墨西哥也有分布。單葉對(duì)生,橢圓形,花黃綠色,頭狀花序,白色總苞片 4 個(gè),花期 4-5 月,核果,卵圓形,長(zhǎng)度0.8 cm-1.3 cm,成熟期 9-10 月[1]。由于美國(guó)梾木經(jīng)濟(jì)性狀表現(xiàn)優(yōu)良(灌木或小喬木,果實(shí)較大等),為了豐富湖南省梾木屬植物種類多樣性,引種到湖南省長(zhǎng)沙市,在引種栽培過(guò)程中,果實(shí)發(fā)育周期短,并早出現(xiàn)果實(shí)脫落現(xiàn)象。果實(shí)脫落是發(fā)育調(diào)控的過(guò)程[2-3],脫落常伴隨著與細(xì)胞壁相關(guān)的基因和酶的活化[4],果實(shí)成熟過(guò)程中若遇到干旱、營(yíng)養(yǎng)過(guò)低、氣候極端、機(jī)械傷害、授精不良等都會(huì)促進(jìn)細(xì)胞壁分解導(dǎo)致脫落[5-8],植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、脫落酸、赤霉素等激素的作用也會(huì)加速果實(shí)脫落[9]。林木引種適應(yīng)性包括它在新生境的生長(zhǎng)發(fā)育情況和繁殖能力[10-11],本文通過(guò)對(duì)美國(guó)梾木在引種栽培生長(zhǎng)周期內(nèi)果實(shí)生理生化變化進(jìn)行研究,包括果實(shí)內(nèi)含物含量變化、酶活性變化以及內(nèi)源激素含量變化研究,探索導(dǎo)致美國(guó)梾木落果致敗的原因,為美國(guó)梾木引種栽培研究提供參考依據(jù)。
試驗(yàn)地位于湖南省林業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)林場(chǎng)內(nèi)(113°00' E、28°11' N),該區(qū)氣候?qū)賮啛釒Ъ撅L(fēng)濕潤(rùn)氣候,年平均氣溫 16.8 ℃,年日照時(shí)數(shù) 1 496~1 850 h,年無(wú)霜期 274 天,平均降雨量 1 400~1 900 mm,雨量主要集中在春、夏兩季,土壤為黃棕壤[12]。
美國(guó)梾木(Cornus spp.)于 2010 年通過(guò)嫁接方式從美國(guó)引種到湖南省林業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)林場(chǎng),砧木為光皮樹(shù)實(shí)生苗,試驗(yàn)面積約為 0.1 公頃 hm2,2012 年開(kāi)始結(jié)果,通過(guò)連續(xù) 3 年觀察,美國(guó)梾木果實(shí)具有落果現(xiàn)象而且普遍存在。2016 年5 月,選擇生長(zhǎng)健壯、結(jié)果正常的美國(guó)梾木植株作為研究對(duì)象,對(duì)其果實(shí)各項(xiàng)生理生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。
選定目標(biāo)樹(shù)種后并于果實(shí)開(kāi)始形成時(shí)(5 月中下旬)每隔 10 天采集1次帶回實(shí)驗(yàn)室,測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。
2.2.1 果實(shí)內(nèi)含物測(cè)定 果實(shí)可溶性糖和淀粉含量測(cè)定采用蒽酮比色法[13];還原糖測(cè)定采用二硝基水楊酸法(DNS)[14];蛋白質(zhì)測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[15]。
2.2.2 過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定 采用紫外分光光度法[16]。取 5.0 g 洗凈的果實(shí)鮮樣,切碎,放入研缽中,加 5 mL 的磷酸緩沖液研磨成勻漿。將勻漿全部轉(zhuǎn)入離心管中,于 3 000 r/min 離心 10 min,上清液轉(zhuǎn)入 25 ml 容量瓶中。沉淀再提取兩次,合并上清液于容量瓶中定容。在試管中加 pH 為 7.0 的磷酸緩沖液(0.05 M)2.2 ml,愈創(chuàng)木酚(0.2%)0.5 ml,濃度為 0.15% 的 H2O20.5 ml,取 0.3 ml 的酶提取液加入到試管中,空白以緩沖液代替。在470 nm 下測(cè)定其吸光度,加入酶液時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí),每隔 30 s 讀數(shù)一次,記錄 5 分鐘。以每分鐘內(nèi)A470 變化 0.01 為 1 個(gè)酶活性單位(u)。
酶活力(u)=(ΔA×V)/0.01×Δt×μ×W其中:ΔA——吸光度的差值;Δt——反應(yīng)的時(shí)間差(min);W——樣品的鮮重(g);V——反應(yīng)液的體積(ml);μ——加入反應(yīng)液的體積(ml)。
2.2.3 內(nèi)源激素測(cè)定 采用高效液相色譜(HPLC)法[17]。稱取梾木果實(shí) 0.7~1 g 用液氮研磨成粉于離心管中,加入 20 mL 的預(yù)冷甲醇(80%),加入少量抗氧化劑并搖勻,在 4 ℃ 下避光浸提 10 h。將浸提的樣品進(jìn)行 3 000 r/min 4 ℃離心 20 min,收集上清液。殘?jiān)俅斡?20 mL 的預(yù)冷甲醇(80%)浸提 10 h,3 500 r/min 4 ℃ 離心 15 min,合并上清液。上清液在 38 ℃ 下旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā),除去甲醇。濃縮液用等體積的三氯甲烷萃取兩次,加入適量 PVP,3 000 r/min 在 4 ℃ 下離心 5 min,棄下層溶液,合并上層溶液,并且調(diào)節(jié) pH 至 2.8~3。再用等體積的乙酸乙酯萃取兩次,合并酯相,然后在 35 ℃ 的烘箱中干燥。殘留物用 3 mL 甲醇:0.8% 冰醋酸=45 : 55 混合液溶解,過(guò) 0.45 μm 的微孔濾膜后進(jìn)行 HPLC 分析。
Agilent 1200 高效液相色譜儀(包括色譜柱、紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器,四元低壓梯度泵,真空脫氣機(jī)), 色譜柱為 Eclipse XDB-C18,直徑 4.6 mm,尺寸 5.0 mm。色譜條件:流速 0.6 mL/min,紫外檢測(cè)波長(zhǎng) 254 nm,流動(dòng)相為甲醇:0.8% 的冰醋酸=45 : 55,進(jìn)樣量:20 uL。
美國(guó)梾木果實(shí)發(fā)育過(guò)程中可溶性糖與還原糖的含量變化趨勢(shì)相同(見(jiàn)圖 1 和圖 2),7 月初之前可溶性糖與還原糖含量是緩慢增長(zhǎng)的,平均遞增量分別為 0.05 mg/g 和 1.1 mg/g,至落果前進(jìn)入快速增長(zhǎng)階段,平均遞增量達(dá)到 0.45 mg/g 和 6.09 mg/g,增加比較明顯;蛋白質(zhì)含量在果實(shí)發(fā)育初期遞增明顯(見(jiàn)圖 3),平均遞增量為 0. 6 mg/g,6 月初蛋白質(zhì)含量開(kāi)始下降,并持續(xù)到 6 月底呈拋物線曲折變化后趨于穩(wěn)定,最終含量保持在 1.14 mg/g;果實(shí)淀粉含量在始果期含量最高(見(jiàn)圖 4),達(dá)到 2.28 mg/g,后急劇下降,6 月初達(dá)到最小值 1.53 mg/g 后緩慢增長(zhǎng),最終含量保持在 1.96 mg/g。
圖1 果實(shí)內(nèi)可溶性糖含量變化Fig.1 Changes of soluble sugar content in fruits
圖2 果實(shí)內(nèi)還原糖含量變化Fig.2 Changes of reducing sugar content in fruits
圖3 果實(shí)內(nèi)蛋白質(zhì)含量變化Fig.3 Changes of protein content in fruits
圖4 果實(shí)內(nèi)淀粉含量變化Fig.4 Changes of starch content in fruits
過(guò)氧化氫酶活性與植物的抗逆性有關(guān),當(dāng)植物在逆境或衰老過(guò)程中,體內(nèi)活性氧代謝加強(qiáng)促使 H2O2積累,H2O2可以直接或間接氧化細(xì)胞內(nèi)核苷酸、蛋白質(zhì)等生物大分子,并使細(xì)胞膜遭受損害,從而加速細(xì)胞衰老和解體[18-19]。過(guò)氧化氫酶可以清除 H2O2,是植物體內(nèi)重要的酶促防御系統(tǒng)之一,活性越高,體內(nèi)積累 H2O2就越少,細(xì)胞的活性就越強(qiáng),抗性就越強(qiáng)[20]。由圖 5 可知,過(guò)氧化氫酶活性在果實(shí)發(fā)育初期活性較強(qiáng),6 月初活性最強(qiáng),達(dá)到 0.018△OD/min·mg,主要原因是發(fā)育初期細(xì)胞分裂加速,細(xì)胞活性強(qiáng),抗性強(qiáng),之后過(guò)氧化氫酶活性開(kāi)始下降,并在 6 月底下降到最小值 0.011△OD/min·mg,這一過(guò)程表現(xiàn)出抗性下降的趨勢(shì),表現(xiàn)為對(duì)環(huán)境不適應(yīng),呈現(xiàn)衰老跡象,雖然之后至落果前有所提高,是由于果實(shí)內(nèi)對(duì)逆境生理調(diào)控引起的,但面對(duì)環(huán)境劇烈變化美國(guó)梾木果實(shí)逆境生理調(diào)控難以達(dá)到正常水平,導(dǎo)致落果。
圖5 果實(shí)內(nèi)過(guò)氧化氫酶活性變化Fig.5 Changes of catalase activity in fruits
美國(guó)梾木果實(shí)發(fā)育初期,果實(shí)內(nèi)各項(xiàng)生理活動(dòng)都處于較高水平,所以果實(shí)內(nèi)的細(xì)胞分裂素(ZT)、赤霉素(GA)、生長(zhǎng)素(IAA)和脫落酸(ABA)含量都較高,分別是 208 μg/g,11 μg/g,51 μg/g 和 7 μg/g。在果實(shí)發(fā)育初期,果實(shí)內(nèi)細(xì)胞分裂素(ZT)、生長(zhǎng)素(IAA)和脫落酸(ABA)含量變化(見(jiàn)圖 6,圖 8,圖 9)較為緩和,而赤霉素(GA)含量一直到 6 月中上旬產(chǎn)生劇烈變化(見(jiàn)圖 7),平均遞減幅度 5.89 μg/g,在落果前表現(xiàn)為持續(xù)增長(zhǎng)狀態(tài),平均遞增量 3.79 μg/g;5 月底開(kāi)始,細(xì)胞分裂素(ZT)和生長(zhǎng)素(IAA)急劇下降并持續(xù)到 6 月底,平均遞減量分別為 135.89 μg/g和 37.20 μg/g,而脫落酸(ABA)含量急劇降低持續(xù)到 6 月中上旬,平均遞減量 3.06 μg/g,在落果之前脫落酸(ABA)含量略有增長(zhǎng)。
圖6 果實(shí)內(nèi)ZT含量變化Fig.6 Changes of ZT content in fruits
圖7 果實(shí)內(nèi)GA含量變化Fig.7 Changes of GA content in fruits
圖8 果實(shí)內(nèi)IAA含量變化Fig.8 Changes of IAA content in fruits
圖9 果實(shí)內(nèi)ABA含量變化Fig.9 Changes of ABA content in fruits
果實(shí)落果最直接因素是內(nèi)源激素脫落酸(ABA)的含量變化,通過(guò)脫落酸(ABA)與其他各內(nèi)源激素含量比值可直觀的分析落果原因(見(jiàn)圖 10),在整個(gè)果實(shí)發(fā)育過(guò)程中,ABA/ZT 保持穩(wěn)定,說(shuō)明落果前果肉細(xì)胞一直處于持續(xù)分裂狀態(tài);ABA/GA 變化呈現(xiàn)整體下降趨勢(shì),美國(guó)梾木通過(guò)樹(shù)體生理調(diào)控機(jī)制來(lái)適應(yīng)逆境條件,赤霉素(GA)含量持續(xù)增加是強(qiáng)化適應(yīng)逆境的表現(xiàn);ABA/IAA 呈現(xiàn)緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì),落果前果實(shí)一直處于生長(zhǎng)狀態(tài),但是脫落酸(ABA)含量持續(xù)增加打破了兩者之間的平衡,導(dǎo)致果實(shí)脫落。
圖10 果實(shí)內(nèi)脫落酸(ABA)占有比例Fig.1 0 The percentage of ABA in fruit
由表 1 可知,美國(guó)梾木果實(shí)內(nèi)各項(xiàng)生理生化指標(biāo)中,酶活性變化與蛋白質(zhì)變化呈極顯著相關(guān),細(xì)胞分裂素(ZT)變化與生長(zhǎng)素(IAA)變化和脫落酸(ABA)變化顯著相關(guān),可溶性糖含量變化與還原糖含量變化呈極顯著相關(guān),與生長(zhǎng)素(IAA)變化呈負(fù)極顯著相關(guān),可溶性糖含量增加卻促進(jìn)了還原糖含量增加,生長(zhǎng)素(IAA)含量減小,果實(shí)生長(zhǎng)變慢,能量消耗加快,成為果實(shí)落果的誘因。
表1 美國(guó)梾木果實(shí)生理生化指標(biāo)相關(guān)性分析Tab.1 Correlation analysis of physiological and biochemical indexes of Cornus spp.fruit
一般來(lái)講,植物引種馴化的過(guò)程也是一種逆境脅迫,植物在逆境脅迫條件下,內(nèi)含物發(fā)生急劇變化,可溶性糖和蛋白質(zhì)變化尤為重要,可溶性糖是植物逆境條件下體內(nèi)參與脅迫調(diào)節(jié)的有效物質(zhì)[21],蛋白質(zhì)是植物逆境條件下重要的調(diào)節(jié)物質(zhì)[22],果實(shí)可溶性糖含量的增加說(shuō)明美國(guó)梾木適應(yīng)本地區(qū)環(huán)境的一種表現(xiàn),蛋白質(zhì)變化是美國(guó)梾木為了提高適應(yīng)性,加速合成氨基酸,為果實(shí)提供生長(zhǎng)動(dòng)力,促進(jìn)了蛋白質(zhì)的合成,還原糖含量增加是植物加速衰老的表現(xiàn)[23],在美國(guó)梾木果實(shí)脫落前,可能出現(xiàn)呼吸驟變的過(guò)程,加速了固形物或干物質(zhì)的損耗,所以淀粉含量減小,與分析結(jié)果相似。結(jié)合過(guò)氧化氫酶活性變化以及內(nèi)源激素變化得出以下結(jié)論:
(1)果實(shí)內(nèi)通過(guò)可溶性糖含量的增長(zhǎng)來(lái)應(yīng)對(duì)逆境或衰老的變化,但是隨著蛋白質(zhì)的合成變慢,果實(shí)內(nèi)能量提供變慢,可能出現(xiàn)的呼吸驟變現(xiàn)象,導(dǎo)致還原糖含量增加,加劇了果實(shí)能量消耗,而固形物淀粉含量沒(méi)有增加,經(jīng)過(guò)急劇降低后趨于穩(wěn)定,難以滿足果實(shí)生長(zhǎng)需求,導(dǎo)致落果。
(2)由于發(fā)育初期細(xì)胞分裂加速,細(xì)胞活性強(qiáng),過(guò)氧化氫酶活性最強(qiáng),果實(shí)內(nèi)部生理調(diào)控占據(jù)主導(dǎo)地位,隨著果實(shí)發(fā)育過(guò)氧化氫酶活性降低并在落果前保持穩(wěn)定,果實(shí)內(nèi)部生理調(diào)控難以達(dá)到逆境或衰老影響的水平導(dǎo)致落果。
(3)果實(shí)內(nèi)細(xì)胞分裂素(ZT)和生長(zhǎng)素(IAA)一直是持續(xù)下降的,赤霉素(GA)呈現(xiàn)拋物線變化,落果前呈小幅度的增長(zhǎng),而脫落酸(ABA)含量急劇下降后在落果前基本趨于穩(wěn)定,通過(guò) ABA/ZT,ABA/GA 和 ABA/IAA 變化分析,果實(shí)內(nèi)部生理調(diào)控雖然緩解了逆境或衰老造成的不利影響,但是隨著其它植物調(diào)節(jié)劑的劇烈變化使得脫落酸(ABA)逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位導(dǎo)致果實(shí)脫落。
(4)通過(guò)相關(guān)性分析,雖然酶活性變化與蛋白質(zhì)的變化呈極顯著相關(guān),細(xì)胞分裂素(ZT)與生長(zhǎng)素(IAA)和脫落酸(ABA)顯著相關(guān),難以分析果實(shí)落果現(xiàn)象,但是可溶性糖變化與還原糖變化呈極顯著相關(guān),可溶性糖變化與生長(zhǎng)素(IAA)變化呈負(fù)極顯著相關(guān),可溶性糖含量增加卻促進(jìn)了還原糖含量增加,生長(zhǎng)素(IAA)含量減小,果實(shí)生長(zhǎng)變慢,能量消耗加快,成為果實(shí)落果的誘因。
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Physiological and biochemical analysis on introduction and cultivation of the Cornus spp.fruit
CHEN Jingzhen1,HE Xiaofang2,TANG Hong2,XIA Li3,LI Peiwang1
(1. Hunan Academy of Forestry,Changsha 410004,China;2. Xinyu Forestry Industry Development Administration,Xinyu 338000,China;3. Hunan Prospecting Designing & Research General Institute for Agriculture,F(xiàn)orestry & Industry,Changsha 410007,China)
In order to find out fruit dropping reason of Cornus spp.from America,we study on the physiological and biochemical indexes of fruit development process by conventional chemical composition analysis in the laboratory,UV spectrophotometry and chromatography techniques.The results showed that:in adversity or senescence,the content of soluble sugar in fruit is continuously increasing, incremental quantity 0.67 mg/g.The content of protein was increased
significantly in the early fruit development,the average increment was 0.6 mg/g,began to decline as parabola at early June then tends to be stable in 1.14mg/g.The content of reducing sugar continued to increase due to respiratory climacteric,increasing amount of 8.63 mg/g.The content of starch reached 2.28 mg/g in the initial development stage then a sharp decline,from the stable in early June to drop before the final content maintained at 1.96 mg/g.The activity of catalase in the fruit continued to increase at the beginning of the fruit development, reached 0.018△OD/min·mg at the beginning of June and dropped to the minimum value of 0.011△OD/min·mg at the end of June.Although there was an improvement before the fall,it was modest.The content of cytokinin(ZT)and auxin(IAA)has been a continuous decline in the fruit,decline were 109.68 μg/g and 38.97 μg/g.The content change of gibberellin(GA)showed parabola change,the average decline was 5.89 μg/g,which had a small increase before dropping, the average increment was 3.79 μg/g.The content of abscisic acid(ABA)decreased sharply until early June,the average decline was 3.06 μg/g,then tended to be stable before dropping.The change of ABA/ZT was stability,ABA/GA showed a decreasing trend,the change of ABA/IAA showed a slow growth trend,abscisic acid(ABA)can lead to dominant fruit.Soluble sugar and reducing sugar were significantly correlated,soluble sugar and growth hormone(IAA)were significantly related to negative changes.The fruit grows slower and consumes too much energy if the content of soluble sugar increased.It is the reason of fruit dropping.
Cornus spp.;fruit drop;inclusion;hydrogen peroxide activity;endogenous hormones
S 793.9
A
1003-5710(2017)05-0006 -06
10.3969 / j.issn. 1003-5710.2017.05.002
2017-03-25
陳景震(1982-),男,山東省泗水縣人,副研究員,碩士,研究方向:能源植物及經(jīng)濟(jì)林栽培育種
“十二五”國(guó)家科技支撐項(xiàng)目“新型油料能源植物選育及栽培示范”(2015BAD15B02);湖南省林業(yè)科學(xué)院青年科研創(chuàng)新基金“美國(guó)梾木果實(shí)發(fā)育影響因子及機(jī)理研究”(2013LQJ12)
(文字編校:龔玉子)