脫除赭曲霉毒素A的枯草芽孢桿菌CW14搖床培養(yǎng)條件優(yōu)化

章雨馨，葉婉瓊，孫正陽，梁志宏

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

脫除赭曲霉毒素A的枯草芽孢桿菌CW14搖床培養(yǎng)條件優(yōu)化

章雨馨，葉婉瓊，孫正陽，梁志宏*

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

以一株具有降解赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)能力的枯草芽孢桿菌BacillussubtilisCW14為材料，采用單因素試驗和正交試驗，對其發(fā)酵初始pH值、培養(yǎng)基配比、培養(yǎng)溫度和轉(zhuǎn)速等4個因素進(jìn)行優(yōu)化。試驗結(jié)果表明，B.subtilisCW14搖床培養(yǎng)的最佳條件是：初始pH值為7.0，培養(yǎng)基胰蛋白胨與酵母浸粉配比為10∶5，發(fā)酵溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為200 r·min-1。在此條件下培養(yǎng)，其菌體密度最大可達(dá)1.56×108cfu·mL-1，OTA脫除率達(dá)83.91%。

枯草芽孢桿菌； 單因素試驗； 正交試驗； 優(yōu)化

真菌毒素是真菌在生長過程中所產(chǎn)生的一些次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于谷物和飼料中，對人畜健康危害極大。常見的真菌毒素有黃曲霉毒素(aflotoxins)、赭曲霉毒素(Ochratoxins，OTs)、玉米赤霉烯酮(zearalenone)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol)、T-2毒素(trichothecenes)、伏馬菌素(fumonisin)等。

赭曲霉毒素OTs是L-β-苯基丙氨酸與異香豆素的聯(lián)合，有A、B、C、D 4種化合物，此外還有赭曲霉毒素A的一些代謝產(chǎn)物，如4-R-羥化赭曲霉毒素、4-S-羥化赭曲霉毒素、10-羥化赭曲霉毒素，以及赭曲霉毒素B的代謝產(chǎn)物赭曲霉毒素β等，都是結(jié)構(gòu)類似的化合物。這些物質(zhì)在化學(xué)結(jié)構(gòu)上只有細(xì)微差異，但在毒理學(xué)方面卻差別很大。其中，以赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)分布最普遍，毒性最強(qiáng)，并且最易檢出[1]。OTA屬于腎毒性真菌毒素，可導(dǎo)致人和動物的腎疾病。1993年國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)將OTA定為“可能的人類致癌物”，即2B類致癌物。OTA被認(rèn)為是巴爾干地方性腎炎與慢性間質(zhì)性腎病這2種慢性疾病的病因，甚至?xí)l(fā)人類腎腫瘤[2]。此外，該毒素還具有肝毒性、致畸性，以及抑制免疫系統(tǒng)的毒性，其中致畸性具有物種選擇性[3]。

近年來，國內(nèi)外有關(guān)OTA脫毒的研究很多。有的研究OTA合成的影響因素，例如環(huán)境、營養(yǎng)基質(zhì)等。有研究表明，精氨酸(Arg)能抑制OTA的生物合成[4]。但更多的研究集中于OTA的脫除。OTA的脫毒方法主要有化學(xué)脫毒、物理吸附和生物脫毒，且目前比較成熟的技術(shù)主要為化學(xué)脫毒和物理吸附。但化學(xué)脫毒和物理吸附因存在副作用、費(fèi)用較高、影響食品的風(fēng)味和營養(yǎng)等原因不利于推廣應(yīng)用。生物脫毒利用微生物作用去除毒素毒性，副作用小，環(huán)境友好，是一種較為理想的脫毒方法，現(xiàn)已成為世界各國競相研究的熱點(diǎn)。

芽孢桿菌(Bacillusspp.)具有對OTA的脫毒能力，但報道的菌株相對較少，而且脫毒能力不盡相同。有研究報道從新鮮的麋鹿糞便中分離到一株枯草芽孢桿菌CW14，對OTA有較強(qiáng)脫除效果[5]。我國農(nóng)業(yè)部允許將枯草芽孢桿菌用作飼料添加劑，并重點(diǎn)應(yīng)用于微生物制劑方面。本研究采用單因素試驗和正交試驗對功能菌株B.subtilisCW14搖床培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得脫毒菌株最優(yōu)培養(yǎng)條件，為今后進(jìn)一步研究此菌的脫毒機(jī)理以及工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)獲得脫毒制劑提供材料和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌種

從新鮮的麋鹿糞便中分離到的枯草芽孢桿菌CW14(B.subtilisCW14)，于本實(shí)驗室鑒定與保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

LB培養(yǎng)基：酵母浸粉5.0 g·L-1，NaCl 10.0 g·L-1，胰蛋白胨10.0 g·L-1，pH 7.0。固體培養(yǎng)基加1.5%的瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

鹽酸，分析純；氫氧化鈉，分析純。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

HZQ-X160全振蕩培養(yǎng)箱，江蘇太倉市實(shí)驗設(shè)備廠；MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋，北京天林恒泰科技有限公司；超凈工作臺，北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠；PHX型智能生化培養(yǎng)箱，寧波萊?？萍加邢薰荆?001-1669全波長掃描酶標(biāo)儀，Thermo Fisher Scientific Oy(芬蘭)。

1.2 菌種活化

-80 ℃甘油保存的B.subtilisCW14，取1 mL接種到100 mL LB液體培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱，37 ℃，200 r·min-1培養(yǎng)24 h活化。

配制LB液體培養(yǎng)基與LB固體培養(yǎng)基，利用平板菌落計數(shù)法得到培養(yǎng)后的菌體濃度，同時測定樣本的D600值，制得B.subtilisCW14菌液濃度與D600值的對應(yīng)關(guān)系曲線。調(diào)整初始接種濃度達(dá)到106cfu·mL-1。

1.3 單因素試驗

1.3.1 搖床發(fā)酵溫度對菌體數(shù)量的影響

設(shè)置搖床發(fā)酵溫度分別為32、37、42 ℃，在初始pH值7.0、裝液量100 mL·250 mL-1、接種量1%、轉(zhuǎn)速200 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)24 h，每組設(shè)置2個重復(fù)，測定D600值。

1.3.2 搖床轉(zhuǎn)速對菌體數(shù)量的影響

設(shè)置搖床轉(zhuǎn)速分別為180、200、220 r·min-1，在初始pH值7.0、裝液量100 mL·250 mL-1、接種量1%、溫度37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)24 h，每組設(shè)置2個重復(fù)，測定D600值。

1.3.3 搖床初始pH值對菌體數(shù)量的影響

將LB培養(yǎng)基的初始pH值使用1 mol·L-1HCl或1 mol·L-1NaOH溶液分別調(diào)至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，121 ℃高壓滅菌20 min后，在裝液量100 mL·250 mL-1、接種量1%、轉(zhuǎn)速200 r·min-1、溫度37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)24 h，每組設(shè)置2個重復(fù)，測定D600值。

1.3.4 培養(yǎng)基成分配比對菌體數(shù)量的影響

配制胰蛋白胨與酵母浸粉配比分別為8∶7、9∶6、10∶5、11∶4、12∶3的液體培養(yǎng)基，121 ℃高壓滅菌20 min后，在裝液量100 mL·250 mL-1、接種量1%、轉(zhuǎn)速200 r·min-1、溫度37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)24 h，每組設(shè)置2個重復(fù)，測定D600值。

1.4 搖床培養(yǎng)條件的正交試驗優(yōu)化

在搖床單因素試驗培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，適當(dāng)縮小各個因素的范圍，根據(jù)正交試驗表L9(34)進(jìn)行4因素3水平的正交試驗，培養(yǎng)24 h。具體地：發(fā)酵溫度(A)的3個水平分別為35 ℃(A1)、37 ℃(A2)、39 ℃(A3)，轉(zhuǎn)速(B)的3個水平分別為180 r·min-1(B1)、200 r·min-1(B2)、220 r·min-1(B3)，初始pH值(C)的3個水平分別為6.5(C1)、7.0(C2)、7.5(C3)，培養(yǎng)基配比(胰蛋白胨與酵母浸粉配比，D)的3個水平分別為9∶6(D1)、10∶5(D2)、11∶4(D3)。每組試驗設(shè)置3個重復(fù)，測定發(fā)酵培養(yǎng)液的D600值。

1.5 搖床培養(yǎng)優(yōu)化條件下菌濃測定以及優(yōu)化發(fā)酵液脫除OTA的研究

在最優(yōu)培養(yǎng)條件下測定D600，并使用高效液相色譜(HPLC)對最優(yōu)條件下OTA脫毒效果進(jìn)行檢測。具體地：三氯甲烷樣用氮吹儀吹干(55 ℃)，加等量甲醇溶解，流動相為乙腈∶水∶乙酸(體積比)=100∶100∶1，流速1 mL·min-1，上樣量20 μL(如果出現(xiàn)平峰，等倍稀釋樣品和對照)，檢出限0.02 ng。

OTA降解率的計算：降解率=(1-對照峰面積/樣品峰面積)×100。

1.6 統(tǒng)計分析

每組試驗結(jié)果重復(fù)3次，采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵溫度對培養(yǎng)液菌體數(shù)量的影響

統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，37 ℃組與32 ℃、42 ℃組均表現(xiàn)出顯著差異(P<0.05)，說明CW14菌株對溫度比較敏感，最適溫度區(qū)域較窄，溫度過高或過低都會使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)及酶的活性受到抑制。根據(jù)單因素試驗結(jié)果(圖1)，發(fā)酵溫度以37 ℃為宜。

柱上無相同字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖2～4同圖1 不同發(fā)酵溫度對枯草芽孢桿菌CW14培養(yǎng)液菌體數(shù)量的影響

2.2 搖床轉(zhuǎn)速對培養(yǎng)液菌體數(shù)量的影響

如圖2所示：轉(zhuǎn)速較低時，菌體數(shù)量隨轉(zhuǎn)速的增大而增大，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到200 r·min-1時，菌體數(shù)量最大，之后隨轉(zhuǎn)速增大而略有減小。這是因為，低轉(zhuǎn)速條件下，提高轉(zhuǎn)速能增大培養(yǎng)基與氧氣的接觸面積，加快物質(zhì)交換速率，延長細(xì)小氣泡在發(fā)酵液中的滯留時間，提高供氧能力，從而加快菌體生長繁殖；而在較高轉(zhuǎn)速條件下，溶氧系數(shù)降低，供氧能力降低，而且伴隨明顯的剪切力，促使菌體自溶，菌體數(shù)量降低[6]?？紤]到生產(chǎn)工藝、能耗及高轉(zhuǎn)速對設(shè)備磨損的影響等因素，CW14菌株的搖床轉(zhuǎn)速以200 r·min-1為宜。

圖2 不同搖床轉(zhuǎn)速對枯草芽孢桿菌CW14培養(yǎng)液菌體數(shù)量的影響

2.3 搖床初始pH值對培養(yǎng)液菌體數(shù)量的影響

培養(yǎng)基pH值會通過影響細(xì)胞代謝相關(guān)酶活性和細(xì)胞中物質(zhì)的離子化程度，進(jìn)而影響微生物的生長代謝[7]。如圖3所示：當(dāng)pH≤7時，菌體數(shù)量隨pH值的增大而增大，但處理間無顯著差異；當(dāng)pH>7時，菌體數(shù)量驟減，且顯著(P<0.05)低于pH<7時各處理的菌體數(shù)量。pH=7時，菌體數(shù)量最大，而且無論是從菌體培養(yǎng)獲得生物量的角度，還是從發(fā)酵獲得代謝物，以及后期的分離純化等角度考慮，中性條件都具有很好的操作優(yōu)勢；因此，CW14菌株培養(yǎng)時初始pH值宜選擇為7。

圖3 不同初始pH值對枯草芽孢桿菌CW14培養(yǎng)液菌體數(shù)量的影響

2.4 培養(yǎng)基成分配比對培養(yǎng)液菌體數(shù)量的影響

如圖4所示，胰蛋白胨與酵母浸粉配比為9∶6與10∶5組的培養(yǎng)液菌體數(shù)量最大，顯著(P<0.05)高于其他處理?？傮w來看，當(dāng)酵母浸粉的比重過低時，會影響菌的生長。這是因為，酵母浸粉中含有豐富的氨基酸、水溶性維生素以及多糖，雖然胰蛋白胨中也含有部分氨基酸，但是缺乏半胱氨酸、甲硫氨酸等含硫氨基酸，因此胰蛋白胨與酵母浸粉需要配合使用，以二者配比10∶5效果最佳。

圖4 不同培養(yǎng)基成分配比對枯草芽孢桿菌CW14培養(yǎng)液菌體數(shù)量的影響

2.5 搖床培養(yǎng)條件的正交試驗優(yōu)化

正交試驗結(jié)果(表1)顯示，各因子對菌體生長的影響依次為初始pH值(C)>培養(yǎng)基配比(D)>搖床轉(zhuǎn)速(B)>發(fā)酵溫度(A)。菌體生長的最佳培養(yǎng)條件組合是A2B2C2D2，即發(fā)酵溫度37 ℃、搖床轉(zhuǎn)速200 r·min-1、初始pH值7.0、培養(yǎng)基配比10∶5。試驗顯示，在此條件下培養(yǎng)，菌液D600達(dá)0.854，即菌體密度達(dá)1.56×108cfu·mL-1。對最優(yōu)條件下OTA脫除效果進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)脫毒能力達(dá)到83.91%，證明經(jīng)過培養(yǎng)條件優(yōu)化后的枯草芽孢桿菌對OTA依然保有很強(qiáng)的脫除活性。

表1 正交試驗設(shè)計及結(jié)果分析

3 小結(jié)與討論

CW14是一株具有脫除OTA能力的功能菌株。本研究將其作為試驗材料，對影響其生長的因素進(jìn)行探索，正交試驗結(jié)果顯示，CW14的最佳搖床培養(yǎng)條件為：溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速200 r·min-1，培養(yǎng)液初始pH值7.0，胰蛋白胨與酵母浸粉配比10∶5。各因子對菌體生長影響的權(quán)重依次為初始pH值>培養(yǎng)基配比>轉(zhuǎn)速>發(fā)酵溫度。在后期的應(yīng)用研究或發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)階段，應(yīng)優(yōu)先關(guān)注培養(yǎng)液初始pH值的調(diào)整。

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2017-09-19

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項資金(2015SP005)

章雨馨(1996—)，女，安徽黃山人，本科生，研究方向為食品微生物，E-mail：zhangyuxin@cau.edu.cn。

梁志宏(1969—)，女，內(nèi)蒙古呼和浩特人，副教授，博士，從事微生物與食品安全方面的研究工作，E-mail：lzh105@cau.edu.cn。

文獻(xiàn)著錄格式：章雨馨，葉婉瓊，孫正陽，等. 脫除赭曲霉毒素A的枯草芽孢桿菌CW14搖床培養(yǎng)條件優(yōu)化[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(12)：2242-2245.

10.16178/j.issn.0528-9017.20171250

TS201.3

A

0528-9017(2017)12-2242-04

高 峻)