β-C對(duì)急性胰腺炎大鼠血清上皮型鈣黏素E水平變化的影響①

卓 越，宋君杰，田 樺，張雪梅，程 開，武榮國

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化科，黑龍江 佳木斯 154003)

β-C對(duì)急性胰腺炎大鼠血清上皮型鈣黏素E水平變化的影響①

卓 越，宋君杰，田 樺，張雪梅，程 開，武榮國

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化科，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：觀察β-胡蘿卜素(β- Carotenoids，β-C)對(duì)急性胰腺炎(Acute pancreatitis，AP)模型大鼠血清中上皮型鈣黏素E蛋白(E-cadherin ，E-cad)水平的影響。方法：成年Wistar大鼠45只(體重：200～250g)，隨機(jī)分為3組: A組,急性壞死性胰腺炎非處理組(n=15)；B組, β-C處理組(n=15)；C組,假手術(shù)組(n=15)。造模前7d開始對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行干預(yù):其中，B組大鼠每日給予無菌大豆油稀釋的β-C油劑(濃度為10mg/ml,以 40mg/kg.d 劑量)灌胃一次；A、C兩組以等劑量大豆油代替。各組自由飲用食水，但飼料中均不含有維生素A(vitamin A),術(shù)前12h禁食水。采用Aho方法建立ANP大鼠模型,測(cè)定各組1h、3h、6h的血清淀粉酶(Serum amylase，AMS)及E-cad蛋白濃度。結(jié)果：A、B組血清AMS水平較C組顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A、B組大鼠血清E-cad蛋白水平明顯高于C組；并且，β-C處理組大鼠血清E-cad蛋白水平較A組顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：急性胰腺炎大鼠血清中E-cad濃度顯著升高,經(jīng)β-C干預(yù)可以有效降低血清E-cad水平，提示β-C可能通過穩(wěn)定細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)減清AP時(shí)的胰腺細(xì)胞損傷。

β-胡羅卜素；急性胰腺炎；上皮型鈣黏素E蛋白；酶聯(lián)免疫法

急性胰腺炎(Acutepancreatitis，AP)發(fā)生時(shí)，胰腺細(xì)胞出現(xiàn)的分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)、胞吐等生物學(xué)功能紊亂與細(xì)胞骨架受損密切相關(guān)[1]。肌動(dòng)蛋白微絲(Actin Filaments，F(xiàn)-actin)是細(xì)胞骨架的重要組成部分，E-cad的胞內(nèi)區(qū)通過連接素(catenins)與F-actin相連[2]。AP時(shí)F-actin解聚普遍存在，導(dǎo)致胰腺細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)受損，勢(shì)必引起血清E-cad水平的改變。本研究旨在通過觀測(cè)β-C對(duì)AP大鼠血清E-cad水平變化的影響，初步探究β-C在AP過程中對(duì)大鼠胰腺細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

雄性Wistar大鼠45只 (體重200 ～250g,購于大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)；20%天然β-C油劑(購于武漢星辰現(xiàn)代生物工程有限公司)、牛磺膽酸鈉(Sigma 公司)；淀粉酶(AMS)檢測(cè)盒 (購于上海復(fù)興長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司)；大鼠上皮型鈣黏蛋白(E-Cad)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(德國，購于上海江萊科技有限公司)；10%水合氯醛, 75%乙醇(由佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)；Heidolph DIAX600勻漿器(德國)；顯微手術(shù)器械 (上海)；J -35型離心機(jī)(美國)；7220分光光度儀(上海)；811自動(dòng)生化分析儀(日立公司) 。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及飼養(yǎng):健康成年雄性Wistar大鼠54只, 隨機(jī)分為3組：急性壞死性胰腺炎(ANP)非處理組(A組)；β-C處理組(B組)；假手術(shù)組( C組)。其中，B組大鼠于實(shí)驗(yàn)前給予無菌大豆油稀釋的β-C油劑(濃度為10mg/mL)，以40mg·kg-1·d-1劑量每日灌胃1次, 連續(xù)7d ；A、C組以等劑量無菌大豆油替代。各組術(shù)前自由飲用食水, 但飼料中均不含有Vitamin A , 于術(shù)前12h禁食水 。

1.2.2 建立模型:誘導(dǎo)ANP:麻醉大鼠后剖腹,在手術(shù)顯微鏡下進(jìn)行牛磺膽酸鈉膽胰管逆行注射(5%?；悄懰徕c0.1mL/100g，注射速度0.1mL/min)[3]。假手術(shù)組僅翻動(dòng)胰腺。各組動(dòng)物分別在1、3、6h處死(每時(shí)點(diǎn)n=5)取腹主動(dòng)脈血, 離心(3500r/min 、15min 、4℃) , 取上清保存于-40℃待測(cè)AMS及E-Cad蛋白濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

A、B組血清AMS水平較C組顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示ANP造模成功，見表1。A、B組大鼠血清E-cad蛋白水平明顯高于C組；并且，β-C處理組大鼠血清E-cad蛋白水平較對(duì)照組顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表1 三組AMS水平的比較

*P<0.05,組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 三組E-cad水平的比較

*P<0.05,組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

上皮型鈣黏蛋白E(E-cadherin，E-cad)是I型鈣黏素超家族中的單鏈跨膜糖蛋白分子，其基因定位于人體的第16號(hào)染色體上(即CDHI：16q22.1，含16個(gè)外顯子,15個(gè)內(nèi)含子,全長4.8kb)，表達(dá)于大多數(shù)上皮細(xì)胞的膜表面，在調(diào)節(jié)胚胎形態(tài)發(fā)育、確保上皮細(xì)胞間有序緊密的連接和維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整與極性等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

E-cad在結(jié)構(gòu)上可分為細(xì)胞外區(qū)(由一個(gè)信號(hào)肽與一個(gè)細(xì)胞外段構(gòu)成)，跨膜區(qū)以及細(xì)胞質(zhì)區(qū)。其中，胞內(nèi)段通過連環(huán)蛋白與細(xì)胞骨架相連接；跨膜區(qū)由32個(gè)氨基酸組成，主要起到“膜錨定”作用；胞外區(qū)由5個(gè)重復(fù)串聯(lián)的單元結(jié)構(gòu)組成，是E-cad的主要功能區(qū)域。同種上皮細(xì)胞依賴E-cad胞外區(qū)內(nèi)第一個(gè)重復(fù)序列中的His-Ala-Val序列結(jié)構(gòu)域之間的相互作用，以實(shí)現(xiàn)彼此之間的有效黏附，在特定條件下(如AP時(shí)引起的胰腺細(xì)胞骨架受損[4]),胞外區(qū)可以被多種蛋白酶所降解，形成80kd左右的片斷而釋放入血,即為血清可溶性E-cad(sE-cadherin，sE-cad)。

業(yè)已證實(shí)，E-cad功能失活的機(jī)制主要包括編碼基因的突變、等位基因缺失、基因啟動(dòng)子的超甲基化、以及基因表達(dá)調(diào)控的異常，其數(shù)量的減少或缺失與許多惡性腫瘤的分化及侵襲能力密切相關(guān)。E-cad表達(dá)的下調(diào)，使腫瘤細(xì)胞喪失接觸抑制而無限增殖,失去分化；細(xì)胞連接松散,擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移的能力增強(qiáng)。較早的研究表明，sE-Cad在全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)患者中顯著升高，并與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)[5]。在SAP導(dǎo)致的SIRS反應(yīng)中，機(jī)體內(nèi)多種蛋白酶被激活，包括基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)、激肽釋放酶7、 纖溶酶和胰蛋白酶等[6]，它們作用于胰腺細(xì)胞膜E-Cad細(xì)胞外肽段，導(dǎo)致血清sE-Cad濃度升高，其中MMPs的作用最為顯著。陳海川[7]等研究顯示，SAP患者血清中的sE-cad水平較MAP和其他腹部炎癥患者顯著升高，并證實(shí)sE-cad的高濃度與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。

本研究顯示，A、B組E-cad濃度較C組顯著升高，與臨床研究結(jié)果相同[8]。同時(shí)，在本研究中通過使用β-C對(duì)大鼠進(jìn)行保護(hù)性預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)其可以有效的降低AP大鼠血清中E-cad的濃度。

β-胡蘿卜素(β- Carotenoids，β-C)是體內(nèi)維生素A主要的生成來源，發(fā)揮重要的生物學(xué)功效，而且已被廣泛的應(yīng)用于維生素A缺乏癥、夜盲、心血管病、皮膚角化等疾病的預(yù)防及治療。研究發(fā)現(xiàn)，β-C在清除氧自由基、猝滅單線態(tài)氧和抗脂質(zhì)過氧化等生理過程中依然發(fā)揮了重要作用，是抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫、抗氧化[8]等方面重要的研究目標(biāo)。較早的研究已表明[9]，β-C可以通過緩解脂質(zhì)過氧化減輕AP時(shí)的細(xì)胞受損；而此次研究的結(jié)果還顯示，β-C可能在維持大鼠ANP時(shí)胰腺細(xì)胞骨架穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用。

綜上所述，β-C可以有效降低ANP大鼠血清中E-cad的水平，提示β-C可能通過穩(wěn)定細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)以減輕AP時(shí)的胰腺細(xì)胞損傷，但確切的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

[1]Jungermann J，Lereh MM，Weidenbach H，et al.Disassembly of the rat pancreatic acinar cytoskeleton during supramaximal secretagogue stimulation[J]. Am J Physiol，1995，268：328-338

[2]Neneill H，Ozawa W，Kemler，et al.Novel function of the cell adhesion molecule uvomorulin as an inducer of cell surface polarity [J].Cell，1990，62：309-315

[3]Aho H J , Koskensalo S M, Neralainen T J .Experimental pancreatitis in the rat: Sodium taurocholate -induced acute haemorrhagic pancreatitis[J]. Scand J Gastroenterol,1980,15(4):411

[4]Schmitt MD，Konowski PHD，Eekert M，et al. Disruption of paracellular sealing is an early event in acute caerulein-Pancreatitis[J].Pancreas，2004，28(2) ：181-190

[5]Pittard AJ, Banks RE, Galley HF, et al. Soluble E-cadherin oncentrations in patients with systemic inflammatory response syndrome and multiorgan dysfunction syndrome[J]. Brit J Anaesth, 1996, 76(5):629-631

[6]Johnson SK, Ramani VC, Hennings L, et al. Kallikrein 7 enhances pancreatic cancer cell invasion by shedding E-cadherin[J]. Cancer, 2007, 109(9): 1811-1820

[7]陳海川，徐雪琴，俞海波. E-Cadherin在急性胰腺炎中的檢測(cè)及其意義[J].肝膽胰外科雜志，2013，25(6):471-473

[8]王夢(mèng)亮，楊依廉，郭小青等.硒化類胡蘿卜素抗氧化作用的研究[J].藥物生物技術(shù)，1998，15(5) ：109-111

[9]田樺，王燁，卓越等. β-C在急性出血壞死性胰腺炎中對(duì)GSH及MDA的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2007，30(3):11

1.黑龍江省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目，編號(hào)：H2015072；2.黑龍江省教育廳科技項(xiàng)目，編號(hào)：12531695。

卓越 (1964～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，教授，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。

宋君杰(1988～)男，黑龍江佳木斯人，在讀碩士研究生。E-mail:158286030@qq.com。

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1008-0104(2017)06-0088-02

2017-09-12)