法舒地爾對(duì)缺氧缺血性腦損傷新生大鼠血腦屏障通透性的影響①

張雅麗，王顯鶴，鮑 勃，朱章龍

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒內(nèi)一科，黑龍江 佳木斯 154003)

法舒地爾對(duì)缺氧缺血性腦損傷新生大鼠血腦屏障通透性的影響①

張雅麗，王顯鶴，鮑 勃，朱章龍

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒內(nèi)一科，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：研究法舒地爾對(duì)缺氧缺血性腦損傷(Hypoxic ischemic brain damage，HIBD)新生大鼠血腦屏障(blood brain barrier，BBB)通透性的影響，并探討其對(duì)腦損傷潛在的保護(hù)機(jī)制。方法：隨機(jī)選取7d齡Wistar新生大鼠144只，分為3組：假手術(shù)組，缺氧缺血組(Hypoxic ischemic ，HI組)和法舒地爾組。建立HIBD動(dòng)物模型，所有動(dòng)物于造模后6h、24h、72h處死。伊文思藍(lán)(evans blue ，EB)滲漏實(shí)驗(yàn)評(píng)估BBB的通透性，大腦皮層Claudin-5的表達(dá)采用免疫組織化學(xué)法。結(jié)果:HI組新生大鼠腦組織中Claudin-5表達(dá)在HI后6h下降明顯(P<0.05)，同時(shí)伴有明顯的BBB通透性明顯增高(P<0.05)。法舒地爾組各時(shí)間點(diǎn)Claudin-5表達(dá)均高于HI組(P<0.05)，且其BBB 通透性較HI組明顯減低(P<0.05)。結(jié)論:法術(shù)地爾對(duì)HIBD新生大鼠的BBB有保護(hù)作用，其可能機(jī)制是通過促進(jìn)緊密連接蛋白Claudin-5的表達(dá)，減少緊密連接的破壞，發(fā)揮BBB的保護(hù)作用。

缺氧缺血性腦損傷；Claudin-5；血腦屏障 ；法舒地爾

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic ischemic encephalopathy，HIE)是危及新生兒生命的重要原因。其中10%～20%死于新生兒期[1]，存活者中25%～30%遺留不同程度的后遺癥[2]，如腦癱，精神發(fā)育遲緩，癲癇等。這給家庭和社會(huì)造成了巨大的負(fù)擔(dān)，同時(shí)增加了兒科醫(yī)生的壓力。因此，急需對(duì)HIE的發(fā)病機(jī)制及有效治療方法進(jìn)行進(jìn)一步研究。

腦水腫是HIE最基本的病理改變，而且是其病情發(fā)展，甚至惡化、死亡的主要原因。因此，及早控制腦水腫對(duì)HIE的愈后至關(guān)重要。目前為止，已有許多機(jī)制用來闡明腦水腫的發(fā)生及發(fā)展。Claudin-5是BBB旁通路中緊密連接的重要蛋白之一，大量研究發(fā)現(xiàn)其在腦缺血后的腦水腫中發(fā)揮重要作用，然而，其在新生大鼠HIBD及其腦水腫的研究中鮮有報(bào)道。法舒地爾通過抑制Rho/ROCK信號(hào)通路，可抑制腦缺氧缺血后的一系列病理生理變化，是作為目前唯一應(yīng)用于臨床的ROCK抑制劑，有研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)保持血腦屏障完整性也具有重要作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

法舒地爾(天津紅日)，伊文思藍(lán)(EB，Sigma公司)，甲酰胺(Sigma公司)，Claudin-5抗體(武漢博士德生物工程公司)，DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程公司)。

1.2 動(dòng)物分組與給藥方法

7d齡Wistar大鼠144只，雌雄不限，體重11～19g，由哈醫(yī)大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，隨機(jī)分成3組：假手術(shù)組，缺氧缺血組，法舒地爾組。假手術(shù)組僅行右側(cè)頸總動(dòng)脈游離，HI組參照動(dòng)物模型制造。法舒地爾組在缺氧后即刻腹腔注射法舒地爾10mg/kg。每組再隨機(jī)分為2個(gè)亞組：分別用于BBB通透性及免疫組織化學(xué)染色。該研究嚴(yán)格按照國(guó)際衛(wèi)生院關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理及使用指南。

1.3 動(dòng)物模型的制備

參照經(jīng)典Rice模型，結(jié)合國(guó)內(nèi)母得志等人的方法建立HIBD模型，7d齡新生大鼠，乙醚吸入麻醉后，仰臥位固定于操作臺(tái)上，依次切開皮膚及皮下組織，游離右側(cè)頸總動(dòng)脈，7-0手術(shù)絲線結(jié)扎后還納，縫合皮下組織及皮膚。整個(gè)手術(shù)過程在10min內(nèi)完成。放回母鼠身邊恢復(fù)30min后，將其放入8% O2、92% N2混合氣體的低氧艙處理2.5h，流量為2 L/min，經(jīng)低氧處理后的新生大鼠放回母鼠籠中飼養(yǎng)。假手術(shù)組僅行右側(cè)頸總動(dòng)脈游離，不行結(jié)扎及缺氧處理。

1.4 伊文思藍(lán)BBB通透性的測(cè)定

通過檢測(cè)腦組織伊文思藍(lán)含量測(cè)定腦組織通透性，每亞組隨機(jī)抽取8只新生大鼠，在取腦前30min經(jīng)尾靜脈注射2% EB生理鹽水溶液(2mL/kg),可見小鼠鞏膜及皮膚迅速變成藍(lán)色。麻醉后快速開胸，暴露心臟，剪開右心耳，用生理鹽水左心室進(jìn)行心臟灌流，直至流出液體為清亮，立即斷頭取腦，分離雙側(cè)大腦皮層，分別稱重兩側(cè)腦組織，加入2倍體積的甲酰胺，60℃水浴中孵育24h，離心取上清液，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀，620mm測(cè)定上清液吸光度(optical density，OD)值，腦組織EB含量計(jì)算公式：腦組織EB含量(μg/g)=待測(cè)樣品EB含量(μg/mL)×甲酰胺溶液(mL)/腦濕重(g)，待測(cè)樣品EB含量是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求得。

1.5 大鼠大腦皮質(zhì)Claudin-5蛋白的表達(dá)

每亞組隨機(jī)抽取8只新生大鼠，乙醚麻醉后，快速打開胸腔，用20mL注射器于左心室灌注生理鹽水，同時(shí)剪開右心耳，至流出液體變清為止。再灌注4% 多聚甲醛，至肝臟明顯變白后斷頭取全腦，并立即保存于4% 多聚甲醛溶液中固定72h以上。將固定的鼠腦從視交叉后2～6mm以5μm厚度進(jìn)行連續(xù)冠狀切片。免疫組織化學(xué)SABC法觀察大腦皮質(zhì)Claudin-5的表達(dá)。切片染色后每個(gè)樣本選取3張切片，每張切片于400倍光鏡下系統(tǒng)隨機(jī)選取2個(gè)

視野進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)用image-pro-plus6.0軟件分析系統(tǒng)測(cè)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 法舒地爾對(duì)HIBD新生大鼠BBB通透性的影響

與假手術(shù)組相比，HI后6hBBB通透性明顯升高(P<0.05)，隨后開始下降，但72h時(shí)其通透性仍高于假手術(shù)組；法舒地爾組各時(shí)間點(diǎn)BBB通透性較HI組降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組新生大鼠腦組織伊文思藍(lán)的含量；n=8)

注：假手術(shù)組相比，▲P<0.0.5；與HI組比，#P<0.05；與組內(nèi)6h比較*P<0.05。

2.2 法舒地爾對(duì)HIBD新生大鼠大腦皮質(zhì)Claudin-5表達(dá)的影響

免疫組化法顯示，Claudin-5陽性染色為棕黃色顆粒，廣泛分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞包漿中。假手術(shù)組Claudin-5表達(dá)水平較高，深染，陽性密集分布。HI后6h組表達(dá)最低，染色淺(P<0.05)。與HI組比較，法舒地爾組各時(shí)間點(diǎn)大腦皮質(zhì)Claudin-5表達(dá)均有升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組新生大鼠大腦皮質(zhì)Claudin-5蛋白的表達(dá)

注：與假手術(shù)組相比，▲P<0.0.5；與HI組比，#P<0.05；與組內(nèi)6h相比，*P<0.05。

3 討論

圍生期窒息引起的部分或完全缺氧、腦血流減少或暫停而導(dǎo)致的胎兒或新生兒腦損傷是HIE的主要原因。其中，腦水腫是早期最主要病理改變，首先由于能量供應(yīng)不足表現(xiàn)為細(xì)胞毒性腦水腫，隨著BBB的破壞，血管源性腦水腫占主要地位。近年來，越來越多的研究證實(shí)，BBB的破壞是腦水腫發(fā)生的直接原因。而緊密連接是BBB的重要組成成分，Claudin-5 作為腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接中的特異性蛋白[3]，研究發(fā)現(xiàn)，Claudin-5的外源性表達(dá)可誘導(dǎo) BBB 的形成[4]，亦有研究發(fā)現(xiàn) Claudin-5基因剔除小鼠BBB嚴(yán)重受損[5]。馬騰等[6]通過建立體外血腦屏障氧糖剝奪模型，證實(shí)BBB通透性的增高與Claudin-5的降低相關(guān)。本研究結(jié)果顯示：假手術(shù)組新生大鼠 Claudin-5 沿腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞持續(xù)表達(dá)，呈連續(xù)性分布，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)并無明顯下降；在HI后6h，新生大鼠Claudin-5 在微血管內(nèi)皮細(xì)胞上的連續(xù)性分布及表達(dá)量顯著降低，且較同組其他時(shí)間相比，Claudin-5表達(dá)最低，同時(shí)間點(diǎn)BBB 通透性增加最顯著。這與王靜娥等[7]關(guān)于大鼠大腦中動(dòng)脈缺血模型研究結(jié)果顯示缺血后6hBBB通透性最大相一致。提示，在新生大鼠HIBD中， BBB 通透性改變與 Claudin-5 表達(dá)下調(diào)、緊密連接開放可能存在密切關(guān)聯(lián)，且存在BBB通透高峰期。

Rho被認(rèn)為與神經(jīng)發(fā)育密切相關(guān)，其在神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育和突起形成中具有不可忽視的作用。Rho激酶作為目前研究最清楚的其下游靶分子，具有兩種異構(gòu)體：ROCKⅠ和ROCKⅡ。其中，ROCKⅠ主要存在于肺、心、骨骼肌等組織細(xì)胞中，ROCKⅡ則主要存在與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。ROCK能夠引起免疫細(xì)胞激活、BBB破壞、炎癥細(xì)胞遷徙等一系列病理改變。抑制其活化被認(rèn)為是治療神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，HIBD新生大鼠腦組織Nogo表達(dá)明顯增高，阻斷Rho/Rho激酶信號(hào)通路可提高損傷后CNS的軸突再生和功能恢復(fù)[8，9]。Yamashita K[10]等研究發(fā)現(xiàn)，Rho激酶抑制劑法術(shù)地爾可能直接作用于神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。雖然有大量研究表明，法術(shù)地爾具有神經(jīng)保護(hù)作用，但其具體作用機(jī)制并不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，法術(shù)地爾組新生大鼠各時(shí)間點(diǎn)，大腦皮層Claudin-5在腦組織微血管上分布的連續(xù)性和表達(dá)明顯高于HI組(P<0.05)，同時(shí)其BBB通透性明顯下降(P<0.05)。其可能是通過使 Claudin-5的表達(dá)升高，封閉緊密連接，維持 BBB 的完整性，減輕腦水腫發(fā)生，進(jìn)而保護(hù)腦組織。

綜上所述，法舒地爾對(duì)維持血腦屏障通透性具有重要作用。猜測(cè)其可能通過促進(jìn)緊密連接Claudin-5 的表達(dá)，關(guān)閉血腦屏障旁通路，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)，減少細(xì)胞水腫的發(fā)生,對(duì)HIBD起到保護(hù)作用。但本研究并未對(duì)炎癥因子進(jìn)行研究，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)行進(jìn)一步研究。

[1]Northington FJ,Chavez-Valdez R,Martin LJ.Neuronal cell death in neonatal hypoxia-ischemia[J]. Annals of Neurology,2011,69(5):743-758

[2]Doyle OM, Temko A, Murray DM, et al.Predicting the neurodevelopmental outcome in newborns with hypoxic-ischaemic injury[J]. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc,2010(10):1370-1373

[3]Ueno M. Molecular anatomy of the brain endothelial barrier： an overview of the distributional features[J].Current Medicinal Chemistry,2007,14(11):1199-1206

[4]Ohtsuki S,Sato S,Yamaguchi H,et al. Exogenous expression of claudin-5 induces barrier properties in culturedrat brain capillary endothelial cells[J].Journal of Cellular Physiology,2007 ,210(1):81-86

[5]Nitta T,Hata M,Gotoh S,et al.Size-selective loosening of the blood-brain barrier in Claudin5-deficient mice[J].Journal of Cell Biology,2003,161( 3) :653-660

[6]馬騰,劉云會(huì),薛一雪. 血腦屏障氧糖剝奪體外模型中缺氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)及血腦屏障通透性的變化[J]. 解剖科學(xué)進(jìn)展,2010,16(2):160-163

[7]王靜娥,田國(guó)萍,周進(jìn),等. 大鼠腦缺血時(shí)緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin和Claudin-5表達(dá)的變化[J]. 解剖科學(xué)進(jìn)展,2010,16(2):149-152[8]Chen S,Xiao N,Zhang X. Effect of combined therapy with ephedrine and hyperbaric oxygen on neonatal hypoxic-ischemic brain injury[J].Neuroscience Letters,2009,465(2):171-176

[9]孟慶云,李麗,邵巍,等. 法舒地爾對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦損傷中Nogo-A的影響[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2015,38(4):10-11，13

[10]Yamashita K,Kotani Y,Nakajima Y,et al.Fasudil,a Rho kinase (ROCK) inhibitor,protects against ischemic neuronal damage in vitro and in vivo by acting directly on neurons[J].Brain Research, 2007,1154(1):2l5-224

佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目，編號(hào): YM2016_059。

張雅麗(1988～)女，山西晉城人，在讀碩士研究生。

王顯鶴(1966～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：xh99wang@163.com。

R743

B

1008-0104(2017)06-0069-02

2017-03-15)