microRNA-26a在原發(fā)性肝癌患者中的表達(dá)及臨床意義研究

杜磊 苗成龍 馮方棟

microRNA-26a在原發(fā)性肝癌患者中的表達(dá)及臨床意義研究

杜磊 苗成龍 馮方棟

目的 探討microRNA-26a在原發(fā)性肝癌（HCC）患者中的表達(dá)及臨床意義。方法 選取HCC、慢性乙型肝炎（CH）患者各28例。HCC患者留取癌組織、癌旁組織、血漿標(biāo)本，CH患者留取血漿標(biāo)本，采用RT-PCR法檢測(cè)標(biāo)本microRNA-26a的表達(dá)水平。比較HCC患者與CH患者microRNA-26a表達(dá)水平；分析HCC患者癌組織、癌旁組織microRNA-26a表達(dá)水平的相關(guān)性；比較血漿microRNA-26a與血清甲胎蛋白（AFP）診斷HCC的靈敏度、特異度；以血漿microRNA-26a水平最佳臨界值（2.873）為界，將HCC患者分為microRNA-26a高表達(dá)組和低表達(dá)組，比較兩組患者術(shù)后1年生存率。結(jié)果 HCC患者血漿microRNA-26a表達(dá)水平低于CH患者（P＜0.05）。HCC患者癌組織microRNA-26a表達(dá)水平低于癌旁組織（P＜0.05）。HCC患者癌組織、癌旁組織microRNA-26a表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.574，P＜0.038）。血漿microRNA-26a診斷HCC的靈敏度較血清AFP強(qiáng)（85.8%vs 57.8%，P＜0.05），但特異度較血清AFP弱（65.2%vs 80.52%，P＜0.05）。microRNA-26a高表達(dá)組患者術(shù)后1年生存率高于低表達(dá)組（60.25%vs 45.77%，P＜0.05）。結(jié)論 HCC患者microRNA-26a表達(dá)水平較低，microRNA-26a可作為早期診斷HCC的生物標(biāo)志物，也可作為HCC患者預(yù)后評(píng)估指標(biāo)。

原發(fā)性肝癌 microRNA-26a 甲胎蛋白 相關(guān)性 生存曲線

肝細(xì)胞癌是原發(fā)性肝癌（primary hepatic carcinoma，HCC）的主要類(lèi)型，占HCC的70%～85%，是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。我國(guó)每年約有40萬(wàn)HCC新增病例[1]，HBV感染導(dǎo)致肝硬化進(jìn)而發(fā)展成HCC是其發(fā)病率逐年上升的主要原因[2]。HCC具有惡性程度、發(fā)病率、病死亡率高，治愈率低的特點(diǎn)，早期不易診斷，多數(shù)患者首診時(shí)已發(fā)展至中晚期，失去了接受根治性手術(shù)治療的機(jī)會(huì)[3]。甲胎蛋白（AFP）作為一種血清學(xué)生物標(biāo)志物用于早期HCC的臨床診斷和預(yù)測(cè)，但其靈敏度和特異度偏低。因此，尋找新型生物標(biāo)志物用于早期HCC診斷迫在眉睫[4]。microRNA是一類(lèi)含有19～25 bp的非編碼單鏈小RNA分子，其在生物體的發(fā)育，細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5]。microRNA異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，且不同疾病狀態(tài)下microRNA表達(dá)存在明顯差異，這提示microRNA或可作為生物標(biāo)志物用于惡性腫瘤的診斷和預(yù)后評(píng)估[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-26a在肝癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織[8]，提示其或可作為HCC臨床診斷潛在的生物標(biāo)志物。本研究通過(guò)檢測(cè)microRNA-26a在HCC組織和血漿中的表達(dá)水平，探討其作為生物標(biāo)志物用于HCC臨床診斷和預(yù)后評(píng)估的意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2011年1月至2016年1月本院普外科收治的HCC患者28例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）由乙型肝炎導(dǎo)致肝硬化進(jìn)而發(fā)展成HCC的患者；（2）NCCN臨床實(shí)踐指南[9]規(guī)定的可接受根治性手術(shù)治療的HCC患者；（3）組織病理學(xué)診斷為HCC的患者；（4）術(shù)后存活1年以上的HCC患者。另同期擇與HCC患者性別、年齡相近的慢性乙型肝炎（CH）患者28例作為對(duì)照，入組的CH患者均無(wú)重大疾病。

1.2 方法

1.2.1 資料采集 使用Epidata 3.0軟件建立病歷數(shù)據(jù)庫(kù)，項(xiàng)目包括患者人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征、腫瘤生物學(xué)行為、實(shí)驗(yàn)室及影像學(xué)檢查結(jié)果、腫瘤臨床分期及手術(shù)情況。

1.2.2 標(biāo)本留取 HCC患者留取癌組織、癌旁組織、血漿標(biāo)本，CH患者留取血漿標(biāo)本，均保存于本院中心實(shí)驗(yàn)室-80°C環(huán)境中。

1.2.3 HCC患者與CH患者microRNA-26a表達(dá)檢測(cè)應(yīng)用RT-PCR法，檢測(cè)工作由武漢康圣達(dá)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所統(tǒng)一于2016年8至10月完成。按照miRNeasy Mini試劑盒（德國(guó)QIAGEN公司）說(shuō)明書(shū)提取HCC患者癌組織、癌旁組織總RNA；按照BLOODmisi試劑盒（中國(guó)Aidlab公司）說(shuō)明書(shū)提取HCC患者、CH患者血漿標(biāo)本總RNA；按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，反應(yīng)條件為 37°C，1h，合成的cDNA置于-80°C保存。取2ng cDNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性5min；95°C，30s；60°C，30s；72°C，35s，40 個(gè)循環(huán)；72°C，10min。采用SYBR GreenⅡ熒光染料法和IQ5TM RTPCR Detection System（美國(guó)Bio-rad公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果經(jīng)U6RNA內(nèi)參校正，microRNA-26a相對(duì)表達(dá)水平用2-ΔΔCt表示，進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 血漿microRNA-26a和血清AFP的診斷效能分析 運(yùn)用ROC曲線及AUC評(píng)價(jià)血漿microRNA-26a和血清AFP診斷HCC的能力，得出microRNA-26a作為診斷HCC生物標(biāo)志物的最佳臨界值。

1.2.5 HCC患者短期生存分析 以最佳臨界值為界，根據(jù)HCC患者血漿microRNA-26a水平分為microRNA-26a高表達(dá)組和低表達(dá)組，比較兩組患者術(shù)后1年生存率。

1.3 觀察指標(biāo) 比較HCC患者與CH患者的臨床資料；比較HCC患者與CH患者microRNA-26a表達(dá)水平；分析HCC患者癌組織、癌旁組織microRNA-26a表達(dá)水平的相關(guān)性；比較血漿microRNA-26a與血清AFP診斷HCC的靈敏度、特異度；比較microRNA-26a高表達(dá)組和低表達(dá)組患者術(shù)后1年生存率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，兩組比較采用χ2檢驗(yàn)；采用直線相關(guān)分析HCC患者癌組織、癌旁組織microRNA-26a表達(dá)水平的關(guān)系；采用Kaplan-Meier法估計(jì)兩組患者的生存率并繪制生存曲線，兩組患者生存率的比較采用log-rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC患者與CH患者臨床資料比較 見(jiàn)表1。

表1 HCC患者與CH患者臨床資料比較

由表1可見(jiàn)，HCC患者與CH患者性別、年齡、RBC、WBC、PLT、Hb、ALT、AST、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、堿性磷酸酶、TBil及肝功能 Child-Pugh分級(jí)等比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；HCC患者AFP水平高于HC患者（P＜0.05）。

2.2 HCC患者與CH患者microRNA-26a表達(dá)水平比較 HCC患者癌組織、癌旁組織的microRNA-26a表達(dá)水平分別為 0.420±0.02、1.325±0.03，癌組織低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 HCC患者、CH患者血漿microRNA-26a表達(dá)水平分別為0.893±0.01、4.125±0.14，HCC患者低于CH患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 HCC患者癌組織、癌旁組織microRNA-26a表達(dá)水平的相關(guān)性分析 見(jiàn)圖1。

圖1 28例HCC患者癌組織、癌旁組織microRNA-26a表達(dá)水平的相關(guān)性

由圖1可見(jiàn)，HCC患者癌組織、癌旁組織microRNA-26a表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.574，P＜0.038）。

2.4 血漿microRNA-26a與血清AFP診斷HCC效能比較 見(jiàn)圖2。

圖2 血漿microRNA-26a和血清AFP診斷HCC的ROC曲線

由圖2可見(jiàn)，當(dāng)血漿microRNA-26a臨界值為2.873 時(shí)，AUC 最大值為 0.725（95%CI：0.608～0.912，P＜0.05），此時(shí)microRNA-26a診斷HCC的靈敏度和特異度分別為85.8%、65.2%。當(dāng)血清AFP臨界值為20.42ng/ml時(shí)，AUC 最大值為 0.610（95%CI：0.615～0.833，P＜0.05），此時(shí)AFP診斷HCC的靈敏度和特異度分別為57.8%、80.52%。這提示血漿microRNA-26a診斷HCC的靈敏度較血清AFP強(qiáng)，但特異度較血清AFP弱。

2.5 microRNA-26a高表達(dá)組和低表達(dá)組患者術(shù)后生存率比較 見(jiàn)圖3。

圖3 microRNA-26a高表達(dá)組和低表達(dá)組患者術(shù)后生存曲線

由圖3可見(jiàn)，microRNA-26a高表達(dá)組和低表達(dá)組患者術(shù)后1年生存率分別為60.25%、45.77%，高表達(dá)組患者生存率高于低表達(dá)組（P＜0.05）。

3 討論

HCC是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，好發(fā)于40～50歲人群，男性發(fā)病率高于女性。目前臨床尚無(wú)有效治療HCC的靶向藥物以及優(yōu)等的早期診斷HCC生物標(biāo)志物，AFP是臨床上用于診斷HCC的常用生物標(biāo)志物，但其靈敏度和特異度偏低（分別為40%～65%、76%～90%），易導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果[4,10]。早期診斷是影響HCC預(yù)后和生存的關(guān)鍵因素，因此尋找新型的高效腫瘤標(biāo)志物用于HCC的早期診斷和預(yù)后判斷已成為迫切需要解決的問(wèn)題。

microRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有重要作用，其表達(dá)譜與腫瘤類(lèi)型相關(guān)，不同種類(lèi)的腫瘤具有不同的表達(dá)模式[5]，提示microRNA可作為腫瘤疾病的生物標(biāo)志物用于腫瘤診斷、預(yù)后判斷[11]。本研究對(duì)28例HCC患者的癌組織、癌旁組織，HCC患者和CH患者血漿樣本進(jìn)行microRNA-26a檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)HCC患者癌組織中microRNA-26a表達(dá)水平低于癌旁組織，HCC患者血漿中的microRNA-26a表達(dá)水平低于CH患者，這提示microRNA-26可作為早期診斷HCC潛在的標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，HCC患者血清 AFP水平明顯高于CH患者，同時(shí)發(fā)現(xiàn)microRNA-26a診斷HCC的靈敏度較血清AFP強(qiáng)，但特異度較血清AFP弱。

研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-26a可作為大腸癌[12]和乳腺癌[13]患者預(yù)后評(píng)估指標(biāo)；在HCC中的研究以現(xiàn)，microRNA-26a可通過(guò)HGF-cMet抑制腫瘤血管重建，是一種潛在的治療靶標(biāo)[8，14]。生存曲線結(jié)果顯示microRNA-26a高表達(dá)組患者術(shù)后1年生存率高于低表達(dá)組患者，這提示microRNA-26a作為一種抑癌基因在HCC發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示HCC患者microRNA-26a表達(dá)水平較低，microRNA-26a可作為早期診斷HCC的生物標(biāo)志物，也可作為HCC患者預(yù)后評(píng)估指標(biāo)，但其生物學(xué)功能尚待進(jìn)一步深入研究。

[1] JemalA,Bray F,Center M M,et al.Globalcancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

[2] Kudo M.Immune checkpoint inhibition in hepatocellular carcinoma:basics and ongoing clinical trials[J].Oncology,2017,92(1):50-62.

[3] Kirstein M M,VogelA.Epidemiology and Risk Factors of Cholangiocarcinoma[J].Visc Med,2016,32(6):395-400.

[4] Kondo Y,Kimura O,Shimosegawa.Significant biomarkers for the management of hepatocellular carcinoma[J].Clin J Gastroenterol,2015,8(3):109-115.

[5] Zhou L,Liu F,Wang X,et al.The roles of microRNAs in the regulation of tumor metastasis[J].CellBiosci,2015,5(1):32-35.

[6] Budhu A,Jia H L,Forgues M,et al.Identification of metastasis-related microRNAs in hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2008,47(3):897-907.

[7]Lu M,Kong X,Wang H,et al.A novel microRNAs expression signature for hepatocellular carcinoma diagnosis and prognosis[J].Oncotarget,2017,8(5):8775-8784.

[8] Yang X,Zhang X F,Lu X,et al.MicroRNA-26a suppresses angiogenesisin human hepatocellular carcinoma by targeting HGF-cmet pathway[J].Hepatology,2013,18(26):147-154.

[9] Benson A R,Abrams T A,Ben-Josef E,et al.NCCN clinical practice guidelines in oncology:hepatobiliary cancers[J].J Natl Compr Canc Netw,2009,7(4):350-391.

[10] Bertino G,Ardiri A,Malaguarnera M,et al.Hepatocellualar carcinoma serum markers[J].Semin Oncol,2012,39(4):410-433.

[11] Piao Y,Piao M,Ryu K H.Multiclass cancer classification using a feature subset-based ensemble from microRNA expression profiles[J].Comput BiolMed,2017,80(1):39-44.

[12] Chen D L,Wang Z Q,Zeng Z L,et al.Identification of miR-214 as a negative regulator of colorectal cancer liver metastasis via regulation of FGFR1 expression[J].Hepatology,2014,60(2):598-609.

[13] Bojmar L,Karlsson E,Ellegard S,et al.The role of microRNA-200 in progression of human colorectal and breast cancer[J].PLoS One,2013,8(12):e84815.

[14] Koberle V,Kronenberger B,Pleli T,et al.Serum microRNA-1 and microRNA-122 are prognostic markers in patients with hepatocellular carcinoma[J].Eur J Cancer,2013,49(16):3442-3449.

Expression of microRNA-26a in primary liver cancer and its clinical significance

DU Lei,MIAO Chenglong,FENG Fangdong.
Department of General Surgery,Pizhou People's Hospital of Jiangsu Province,Pizhou 221300,China

Objective To investigate the expression of microRNA-26a (mRNA-26a)in primary hepatocellular carcinoma(HCC)and its clinical significance. Methods The expression of mRNA-26a were detected with RT-PCR in plasma,cancer tissue and pericancerous liver tissue samples from 28 patients with HCC and plasma samples from 28 patients with chronic hepatitis B(CHB).The clinical significance of mRNA-26a expression in HCC was analyzed. Results The expression level of plasma microRNA-26a in HCC patients was lower than that in CHB patients(P＜0.05).The expression level of microRNA-26a in cancer tissues of HCC patients was lower than that of pericancerous liver tissues(P＜0.05).There was a positive correlation between the expression of microRNA-26a in cancer tissues and pericancerous liver tissues(r=0.574,P＜0.05).The sensitivity of plasma microRNA-26a in diagnosis of HCC was higher than that in serum AFP(85.8%vs 57.8%,P＜0.05),but the specificity was lower than that of serum AFP(65.2%vs 80.52%,P＜0.05).The 1-year survival rate of patients with high expression of mRNA-26a was higher than that of low expression group(60.25%vs 45.77%,P＜0.05). Conclusion The expression level of mRNA-26a in HCC tissues is down-regulated,it may be used as a molecular marker for early diagnosis of HCC.

Primary hepatocellular carcinoma MicroRNA-26a Alpha-fetoprotein Correlation Survival curve

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.24.2017-542

221300 江蘇省邳州市人民醫(yī)院普外科

馮方棟，E-mail：ffd2013hb@163.com

2017-03-13）

李媚）