VTQ和超聲微泡造影技術(shù)對(duì)大鼠肝纖維化的評(píng)估價(jià)值研究

劉芳 黃斌

VTQ和超聲微泡造影技術(shù)對(duì)大鼠肝纖維化的評(píng)估價(jià)值研究

劉芳 黃斌

目的 探討聲觸診組織量化技術(shù)（VTQ）和超聲微泡造影技術(shù)對(duì)大鼠肝纖維化的評(píng)估價(jià)值。方法 將84只SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組（70只）和對(duì)照組（14只）。模型組大鼠采用硫代乙酰胺（TAA）注射法造模，對(duì)照組予等量0.9%氯化鈉注射液處理。采用超聲VTQ檢查大鼠肝臟剪切波速度（Vs），采用超聲微泡造影定量檢測(cè)到達(dá)時(shí)間（AT）、達(dá)峰時(shí)間（TTP）、峰值強(qiáng)度（PI）、平均通過(guò)時(shí)間（MTT）、AUC、肝動(dòng)-靜脈渡越時(shí)間（HA-HVTT)。結(jié)果 大鼠肝纖維化程度與Vs呈正相關(guān)（r=0.887，P＜0.05），與 PI、AUC、HA-HVTT均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.615、-0.782、-0.575，均 P＜0.05），即隨著肝纖維化程度的加重，出現(xiàn)Vs增加，PI降低，AUC減小，HA-HVTT縮短的趨勢(shì)。Vs診斷大鼠肝纖維化程度的靈敏度、特異度最高，AUC次之，HA-HVTT與PI相當(dāng)。結(jié)論 VTQ和超聲微泡造影技術(shù)均可有效評(píng)估大鼠肝纖維化程度，其在人體的效果值得臨床研究。

肝纖維化 聲觸診組織量化技術(shù) 微泡 診斷 大鼠

肝纖維化是許多肝臟疾病尤其是各種慢性肝病常見(jiàn)和共同的病理轉(zhuǎn)歸。目前，臨床判斷肝纖維化程度的金標(biāo)準(zhǔn)是肝臟組織穿刺活檢，但其存在創(chuàng)傷大、不能動(dòng)態(tài)觀察等諸多局限[1-2]。研究表明，肝實(shí)質(zhì)回聲的改變可作為反映肝纖維化程度的指標(biāo)[3-5]，但其受患者主觀因素影響較大，且不能提供詳細(xì)量化信息。超聲的新技術(shù)-聲觸診組織量化技術(shù)（virtual touch tissue quantification，VTQ）結(jié)合超聲微泡造影技術(shù)憑借其安全、無(wú)輻射、無(wú)臨床禁忌，且可量化肝纖維化程度等諸多優(yōu)點(diǎn)，為肝纖維化的無(wú)創(chuàng)診斷研究提供了契機(jī)。基于此，本研究旨在探討VTQ和超聲微泡造影技術(shù)對(duì)肝纖維化程度的評(píng)估價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 84只SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量180～220g，由杭州赫貝科技有限公司提供（合格證編號(hào)：1401016），在 20～25℃燈光晝夜調(diào)控下自由進(jìn)食、飲水。

1.2 動(dòng)物模型制備 將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組（70只）和對(duì)照組（14只）。模型組大鼠予以250mg/kg體質(zhì)量的劑量經(jīng)腹腔注射10%硫代乙酰胺（TAA）制備肝纖維化模型，2次/周，共10周。對(duì)照組大鼠予0.9%氯化鈉注射液同法同劑量處理。于給藥第 4、5、6、7、8、9、10周末，模型組大鼠每次取10只，對(duì)照組大鼠每次取2只，進(jìn)行VTQ和超聲微泡造影檢查；后麻醉下行腹主動(dòng)脈切開(kāi)處死，解剖觀察并取肝組織行病理學(xué)檢查。

1.3 VTQ檢查

1.3.1 儀器 ACUSON S2000彩色多普勒超聲診斷儀（德國(guó)SIEMENS公司），探頭頻率8～11MHz，配有VTQ分析軟件，可進(jìn)行VTQ檢測(cè)。

1.3.2 方法 固定大鼠，應(yīng)用高頻探頭掃查，以肝右靜脈右側(cè)距肝包膜3mm處設(shè)定感興趣區(qū)（感興趣區(qū)大小固定），調(diào)取VTQ功能，激發(fā)獲取剪切波速度（Vs）并記錄，同一大鼠重復(fù)檢查5次取平均值。

1.4 超聲微泡造影檢查

1.4.1 儀器 ACUSON S2000彩色多普勒超聲診斷儀（德國(guó)SIEMENS公司），探頭頻率8～11MHz，對(duì)比劑為六氟化硫微泡（瑞士Bracco International B.V.公司）。

1.4.2 方法 25mg六氟化硫微泡予5ml 0.9%氯化鈉注射液稀釋后，取0.1ml經(jīng)靜脈團(tuán)注并快速用0.9%氯化鈉注射液0.1ml沖管。全程超聲視頻錄像，脫機(jī)后用IMAGE ARENA分析軟件分析獲取肝臟血流灌注的時(shí)間強(qiáng)度曲線和數(shù)據(jù)，并記錄。本研究選取的定量分析相關(guān)參數(shù)包括：到達(dá)時(shí)間（arrive time，AT），達(dá)峰時(shí)間（time to peak，TTP），峰值強(qiáng)度（peak intensity，PI），平均通過(guò)時(shí)間（mean transit time，MTT），AUC，肝動(dòng)-靜脈渡越時(shí)間（hepatic artry to hepatic vein transit time，HA-HVTT）。

1.5 病理學(xué)檢查 剪取大鼠肝左葉相同部位約10mm×10mm×10mm組織標(biāo)本，采用4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋連續(xù)切片，HE、Masson及網(wǎng)狀纖維染色。肝纖維化病理診斷標(biāo)準(zhǔn)采用2015年全國(guó)《病毒性肝炎防治方案》中的慢性肝纖維化分期標(biāo)準(zhǔn)[6]。肝纖維化S0期為無(wú)肝纖維化；S1期為鏡下見(jiàn)肝細(xì)胞間質(zhì)纖維增生較多，肝細(xì)胞片狀壞死；S2期見(jiàn)肝細(xì)胞間質(zhì)明顯橋接纖維化，纖維間隔形成，尚不影響小葉結(jié)構(gòu)；S3期見(jiàn)肝組織間隙大量纖維間隔，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂甚至破壞；S4期肝組織大量纖維增生，纖維間隔包繞形成假小葉，肝組織細(xì)胞廣泛壞死。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，采用Spearman相關(guān)分析肝纖維化程度與VTQ和超聲微泡造影定量參數(shù)的關(guān)系。以肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用ROC曲線分析VTQ和超聲微泡造影定量參數(shù)對(duì)大鼠肝纖維化程度的診斷效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠一般情況及病理學(xué)表現(xiàn)比較 模型組大鼠死亡14只，成模率為80.0%（56/70），對(duì)照組大鼠死亡1只。隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)，模型組大鼠肝纖維化程度逐漸加重，其中S0期1只，S1期16只，S2期17只，S3期13只，S4期9只，病理學(xué)表現(xiàn)見(jiàn)圖1，而對(duì)照組大鼠均為S0期。

圖1 模型組大鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)（a：第4周末，肝組織呈S0期纖維化表現(xiàn)；b：第5周末，肝組織呈S1期纖維化表現(xiàn)；c：第6周末，肝組織呈S2期纖維化表現(xiàn)；d：第8周末，肝組織呈S3期纖維化表現(xiàn)；e：第10周末，肝組織呈S4期纖維化表現(xiàn)；Masson染色，×40）

2.2大鼠肝纖維化程度與VTQ和超聲微泡造影定量參數(shù)的相關(guān)性分析 不同肝纖維化程度大鼠Vs、PI、AUC、HA-HVTT比較見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，大鼠肝纖維化程度與Vs呈正相關(guān)（r=0.887，P＜0.05），與 PI、AUC、HA-HVTT 均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.615、-0.782、-0.575，均 P＜0.05），即隨著肝纖維化程度的加重，出現(xiàn)Vs增加，PI降低，AUC減小，HAHVTT縮短的趨勢(shì)。

表1 不同肝纖維化程度大鼠Vs、PI、AUC、HA-HVTT比較

2.3 Vs、PI、AUC、HA-HVTT診斷大鼠肝纖維化程度的 效能比較 見(jiàn)圖2、表2。

圖2 Vs、PI、AUC、HA-HVTT診斷大鼠肝纖維化程度的ROC曲線（a：肝纖維化S≥2期；b：肝纖維化S≥3期；c：肝纖維化S4期）

表2 Vs、PI、AUC、HA-HVTT診斷大鼠肝纖維化程度的效能比較

由圖2、表2可見(jiàn)，Vs診斷大鼠肝纖維化程度的靈敏度、特異度最高，AUC次之，HA-HVTT與PI相當(dāng)。

3 討論

肝纖維化的形成和發(fā)展是一個(gè)動(dòng)態(tài)的病理學(xué)過(guò)程[7]。有效的病因治療可以逆轉(zhuǎn)肝纖維化。因此，早期和量化診斷肝纖維化程度對(duì)于及時(shí)干預(yù)治療并逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)展具有十分重要的臨床價(jià)值[8]。超聲評(píng)價(jià)肝纖維化是目前臨床無(wú)創(chuàng)診斷肝纖維化研究的熱點(diǎn)之一[9]。常規(guī)的超聲檢查對(duì)已有形態(tài)學(xué)改變的病態(tài)肝有一定的診斷價(jià)值，但其診斷早期肝纖維化或肝硬化的靈敏度不高。超聲檢查受操作者主觀判斷和經(jīng)驗(yàn)的影響，且更多的依賴設(shè)備。這些都是傳統(tǒng)超聲檢查的局限性。

近年來(lái)，超聲彈性成像成為肝纖維化無(wú)創(chuàng)診斷研究的熱點(diǎn)[10]，VTQ技術(shù)是彈性成像的一種，可定量描述“觸診”效果[11]。其原理是聲脈沖輻射力成像和剪切波傳播，將感興趣區(qū)組織的Vs精確快速地計(jì)算出來(lái)，在診斷過(guò)程中不需要檢查者手動(dòng)施壓，不受外部壓力影響，而是由探頭發(fā)射恒定壓力的脈沖波引起，避免了因主觀因素產(chǎn)生的干擾。對(duì)傳統(tǒng)超聲成像結(jié)果有一定價(jià)值的補(bǔ)充作用。VTQ在評(píng)估肝纖維化程度方面的研究在西方國(guó)家是以慢性丙型肝炎為主要研究對(duì)象，并取得了一些成果[12]。本研究以肝纖維化大鼠為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)隨著肝纖維化程度的加重，Vs呈增加趨勢(shì)。應(yīng)用ROC曲線評(píng)估Vs診斷效能，發(fā)現(xiàn)Vs診斷大鼠肝纖維化程度的靈敏度、特異度很高。

超聲微泡造影是一種典型的血池示蹤成像技術(shù)。對(duì)比劑微泡直徑約為2～4 μm，血流動(dòng)力學(xué)與紅細(xì)胞幾乎完全一致，經(jīng)靜脈注射微泡后，可順利通過(guò)肺循環(huán)到達(dá)全身血管系統(tǒng)，并持續(xù)足夠長(zhǎng)的時(shí)間，不但能夠提高低速血流的檢出能力，而且能夠作為良好的血池示蹤劑反映肝臟的血流灌注狀態(tài)。有研究表明，肝臟血流動(dòng)力學(xué)改變的發(fā)生遠(yuǎn)早于肝臟形態(tài)學(xué)改變，隨著肝纖維化程度加重，會(huì)出現(xiàn)肝內(nèi)血流動(dòng)脈化、肝臟血管分支存在異常吻合、肝動(dòng)靜脈瘺等[13]。應(yīng)用超聲造影時(shí)間強(qiáng)度曲線分析系統(tǒng)可以獲得肝內(nèi)動(dòng)脈、門脈和微循環(huán)的血流灌注量化信息，對(duì)肝纖維化程度進(jìn)行有效評(píng)估[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)隨著大鼠肝纖維化的加重，由于纖維組織增生，肝毛細(xì)血管阻力增高，致使PI降低、AUC減小、HA-HVTT縮短，這種趨勢(shì)也越來(lái)越明顯。應(yīng)用ROC曲線評(píng)估各指標(biāo)診斷效能，發(fā)現(xiàn)AUC對(duì)不同分級(jí)的肝纖維化鑒別能力較好，而HA-HVTT與PI的診斷價(jià)值相當(dāng)。

本研究的不足之處在于，作為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，大鼠肝臟的解剖結(jié)構(gòu)和生理病理狀態(tài)下的功能改變與人體存在一定的差別，其檢測(cè)結(jié)果與人體也可能存在不同。本研究采用的是高頻線陣探頭，而臨床患者檢查一般采用低頻凸陣探頭，是否會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果的差異尚需進(jìn)一步研究證實(shí)；再者，有研究顯示肝細(xì)胞炎癥程度、肝功能異常、膽汁淤積等都會(huì)增加Vs[17]，尚需深入探討它們對(duì)彈性檢測(cè)值的影響；本研究所及參數(shù)對(duì)肝纖維化程度的診斷效能還需在有病理學(xué)檢查對(duì)照的人群中進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，Vs、AUC、HA-HVTT、PI均可以有效地評(píng)估肝纖維化程度。VTQ和超聲微泡造影技術(shù)作為超聲無(wú)創(chuàng)診斷肝纖維化程度的方法，值得臨床進(jìn)一步研究。

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本刊編輯部

Assessement of hepatic fibrosis by virtual tough tissues quantification and ultrasound microbubbles in rats

LIU Fang,HUANG Bin.
Department of Ultrasonography,Hangzhou Xixi Hospital,Hangzhou 310023,China

Objective To apply virtual tough tissues quantification(VTQ)and ultrasound microbubbles techniques in evaluation of hepatic fibrosis in rats. Methods Eighty four SPF male Sprague-Dawley rats were randomly divided into model group(n=70)and control group(n=14).Liver fibrosis was induced by injection of thioacetamide(TAA)in model group,while equal volume of normal saline was injected in control group.The liver shear wave velocity(Vs)was examined with VTQ,the time to peak(TTP),peak intensity(PI),mean transit time(MTT),AUC and hepatic artery to hepatic vein transit time(HA-HVTT)were determined with ultrasonic microbubbles. Results The degree of liver fibrosis in rats was positively correlated with Vs(r=0.887,P＜0.05),negatively correlated with PI,AUC and HA-HVTT(r=-0.615,-0.782 and-0.575,all P＜0.05).With the increase of hepatic fibrosis degree,Vs increased and Pi,AUC,HA-HVTT decreased.The sensitivity and specificity of Vs in diagnosis of liver fibrosis degree in rats were the highest,followed by AUC time,while those of HA-HVTTis and PI were similar. Conclusion VTQ and ultrasound microbubbles might be used in evaluating stages of liver fibrosis clinically and further studies should be conducted.

Liver fibrosis Virtual tough tissues quantification Microbubble Diagnosis Rats

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.24.2017-1908

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LY13H180015）作者單位：310023 杭州市西溪醫(yī)院特檢科

黃斌，E-mail：HB2K@163.com

2017-08-09）

李媚）