反膠束的微結(jié)構(gòu)與前萃率相互關(guān)系的研究

張倩，陳復(fù)生，*，孫倩

（1.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450001；2.北京科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院生物前沿技術(shù)與應(yīng)用研究中心，北京100024）

反膠束的微結(jié)構(gòu)與前萃率相互關(guān)系的研究

張倩1，陳復(fù)生1，*，孫倩2

（1.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450001；2.北京科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院生物前沿技術(shù)與應(yīng)用研究中心，北京100024）

以全脂豆粉為原料，在不同單因素條件下，對丁二酸二異辛酯磺酸鈉（sodium bis（2-ethylhexyl）sulfo succinate，AOT）/異辛烷反膠束萃取體系分離提取大豆分離蛋白的前萃過程中膠束的平均粒徑及W0進(jìn)行分析，結(jié)合前萃率的變化，探討反膠束的微結(jié)構(gòu)與前萃率相互關(guān)系的變化規(guī)律。

全脂豆粉；反膠束；微結(jié)構(gòu)；前萃率

反膠束是兩性表面活性劑分子在非極性溶劑中自發(fā)形成的極性頭朝內(nèi)，非極性尾朝外的熱力學(xué)穩(wěn)定的納米聚集體[1-2]。該體系的內(nèi)部水核結(jié)構(gòu)能夠有選擇性的增溶水溶性物質(zhì)如蛋白質(zhì)、氨基酸等[3-4]，在分離純化的基礎(chǔ)上，能夠較大程度的保持蛋白質(zhì)的生物活性。此外，反膠束體系能夠同時(shí)分離油脂和蛋白，低能耗條件下實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作，因此針對大豆、花生等油料作物的蛋白提取而言，是一種前景廣闊的分離技術(shù)[5]。反膠束萃取蛋白的過程可以分為兩步：前萃和后萃。前萃即蛋白質(zhì)固體與反膠束溶液混合震蕩后增溶至反膠束內(nèi)部水核中的過程，后萃過程即通過加入一定體積的水相，使蛋白質(zhì)從反膠束中轉(zhuǎn)入水相中的過程。前萃過程為液-固萃取，后萃為液-液萃取，pH值、表面活性劑濃度、離子濃度等一系列因素都會影響前萃過程的傳質(zhì)[6]。

目前，多位學(xué)者都對前萃過程有所研究，但大多僅僅局限于不同條件下對提取率的優(yōu)化分析上，對蛋白質(zhì)增溶于反膠束的過程還有待進(jìn)一步的探討。此外，就實(shí)際應(yīng)用而言，關(guān)于反膠束體系的平衡狀態(tài)、不同條件下的粒徑變化等問題依然值得研究[7-8]。此前，有研究就表明表面活性劑濃度和含水量會對反膠束體系的粒徑等有所影響，進(jìn)而影響該體系對蛋白的萃取率[9-11]。因此，本文選取表面活性劑濃度、加水量、pH值和鹽濃度四個關(guān)鍵因素，探討不同條件下蛋白質(zhì)增溶于反膠束前后反膠束體系的W0及粒徑的變化規(guī)律，并結(jié)合前萃率的變化規(guī)律，進(jìn)一步闡明蛋白質(zhì)增溶于反膠束體系的變化過程，為提高反膠束體系萃取率提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

全脂大豆粉：河南省鯤華生物技術(shù)有限公司；丁二酸二異辛酯磺酸鈉（sodium bis（2-ethylhexyl）sulfo succinate，AOT）：上海海曲化工有限公司；異辛烷（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；Na2HPO4、KH2PO4、KCl、濃H2SO4（分析純）：洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司。

BS210S型分析天平：德國Sartorius公司；K1100全自動凱氏定氮儀：濟(jì)南海能儀器股份有限公司；ZSD-2J智能自動水分滴定儀：上海安亭科學(xué)儀器有限公司；Zetasizer Nano ZS90激光粒度分析儀：英國馬爾文儀器公司；GL-20C型高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器有限公司；pH211型pH計(jì)：意大利HANNA公司；SHZ-82型數(shù)顯水浴恒溫振蕩器：常州博遠(yuǎn)實(shí)驗(yàn)分析儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 反膠束溶液的制備

稱取一定質(zhì)量的AOT于錐形瓶中，加入一定體積的異辛烷，用手搖勻至AOT完全溶解。然后加入含一定濃度KCl的特定pH的Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液，氣浴震蕩1 h后，靜置12 h。若溶液澄清透明，即為反膠束溶液。

1.2.2 反膠束萃取大豆蛋白

稱取一定質(zhì)量的全脂豆粉，加入到一定體積的反膠束溶液中，40℃水浴震蕩30min后，5 000 r/min離心25min。上清液即為前萃液（大豆蛋白已經(jīng)增溶進(jìn)入反膠束內(nèi)）。加入與上清液相同體積的含1 mol/L的KCl的Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液，40℃水浴震蕩30min后，4 000 r/min離心30min后，下層水相即為溶有蛋白的后萃液。本文主要針對前萃過程研究。

1.2.3 Karl-fischer法測定膠束體系的W0值

采用智能自動水分滴定儀對反膠束溶液（蛋白質(zhì)增溶前的溶液）和前萃液的含水量進(jìn)行測定，測定方法具體如下：首先自動吸取一定體積的甲醇（一級色譜純）于滴定瓶中，以液面高于金屬鉑片為準(zhǔn)，然后手動吸卡爾費(fèi)休液后打空白，待滴定瓶中的甲醇中的水消耗完之后，用微量進(jìn)樣器直接加入10 μL的水進(jìn)行標(biāo)定，重復(fù)標(biāo)定五次后得到滴定度。然后用微量進(jìn)樣器加入50 μL的待測溶液，測定后可得到待測溶液中的含水量V水。再按照公式1計(jì)算待測溶液的W0值。

1.2.4 反膠束體系粒徑測定方法

采用Zetasizer Nano ZS90激光粒度分析儀對反膠束體系的粒徑進(jìn)行測定。在樣品池中加入1mL左右的待測液，系數(shù)設(shè)定如下：黏度參數(shù)0.47 Cp，折光率為1.389，分散劑為異辛烷，溫度設(shè)定為25℃。每個樣品測定至少3次。最后取平均值得到待測樣品的平均粒徑。

1.2.5 前萃率的測定方法

先稱取一定質(zhì)量的全脂豆粉，用量筒準(zhǔn)確稱量一定體積的反膠束溶液，均倒入錐形瓶中，水浴震蕩后離心處理，棄去豆粉沉渣，上清液即為溶有蛋白質(zhì)的前萃液，通過凱氏定氮的方法測定前萃液中的蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)前萃率按式2計(jì)算：

1.3 試驗(yàn)條件設(shè)置

采用AOT反膠束體系萃取大豆蛋白，以AOT濃度、pH值、加水量和KCl鹽濃度為單因素，探討不同的單因素條件下，反膠束溶液的粒徑大小、含水量W0、前萃液的粒徑大小、含水量W0與前萃率的相互關(guān)系。其中，AOT 濃度水平設(shè)為：0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 g/mL。pH 值水平設(shè)為：5、6、7、8、9。KCl鹽濃度水平設(shè)為：0，0.05、0.10、0.15、0.20 mol/L。加水量水平設(shè)為：0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mL/mL。豆粉濃度定為 0.02 g/mL。加熱溫度設(shè)為40℃，時(shí)間設(shè)為30min。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)采用Microsoft Excel軟件、SPSS16.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析以及繪圖。試驗(yàn)結(jié)果都至少重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 AOT濃度對反膠束萃取的影響規(guī)律研究

AOT濃度對反膠束萃取的影響規(guī)律研究見圖1。

圖1 AOT濃度對反膠束萃取大豆分離蛋白的影響Fig.1 The effect of AOT concentration on the reverse micelle extraction of SPI

AOT濃度對反膠束體系萃取蛋白前后的增溶水量及W0的影響規(guī)律如圖1-（A）所示，在加水量不變的情況下，隨著AOT濃度的增加，反膠束溶液和前萃液的含水量都呈顯著增加趨勢，而且反膠束溶液的增溶水量在0.10 g/mL之后增加趨勢逐漸平緩。這表明隨著AOT濃度的增加，反膠束溶液和前萃液中的增溶水量都明顯增加，并在0.12 g/mL的條件下兩者基本持平。對于反膠束溶液而言，增溶水量在0.04 g/mL～0.08 g/mL范圍內(nèi)變化趨勢明顯，說明AOT濃度較低時(shí)形成的反膠束聚集數(shù)較少，而在未飽和之前，膠束數(shù)目會隨著AOT濃度變化顯著，增溶水量也會增加的較為明顯。而0.08 g/mL～0.12 g/mL范圍內(nèi)，反膠束溶液的增溶水量增加逐漸趨于平緩，表明體系中的反膠束已經(jīng)逐漸飽和，結(jié)合圖1-（B）的W0值不斷下降的趨勢，即體系中形成的膠束數(shù)目在不斷增加，但每個膠束中增溶水量的比例卻在下降。而對于空膠束而言，增溶水量的比例會直接影響反膠束的大小[12]，因此，可以得出結(jié)論，空膠束的尺寸是隨著AOT濃度的增加而遞減的。這與粒徑結(jié)果是相一致的，即反膠束數(shù)目多尺寸小。

對于前萃液而言，圖1-（C）表明前萃液相較于同等條件下的反膠束溶液的增溶水量都有所降低，這是因?yàn)榈鞍自鋈苓M(jìn)反膠束體系后，在水核中發(fā)生水合作用[3]，因此前萃液的增溶水量整體比空膠束溶液低。且圖1-（B）可以看出反膠束溶液和前萃液對應(yīng)的W0值都是逐漸降低的，且前萃液的W0值的變化較為平緩。圖1-（C）表明平均粒徑的整體數(shù)值都相較于空膠束有顯著增加，但整體趨勢卻和空膠束的變化相反，呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。這是因?yàn)榉茨z束體系本身就是一個不斷更新的穩(wěn)定的熱力學(xué)體系，當(dāng)AOT濃度較低時(shí)，整個體系的膠束聚集數(shù)比較少，形成的空膠束尺寸較大，蛋白質(zhì)增溶進(jìn)膠束水核后，水核結(jié)構(gòu)體積變大，整個膠束體系無法被少量的表面活性劑包裹進(jìn)而實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定，會自發(fā)裂解為較小體積的反膠束結(jié)構(gòu)。因此，由圖1-（C）可以看出，當(dāng)AOT濃度在0.04 g/mL～0.08 g/mL的范圍時(shí)，形成的膠束聚集數(shù)還遠(yuǎn)沒有達(dá)到飽和，有機(jī)相中有足夠的空間使其分解為穩(wěn)定的反膠束結(jié)構(gòu)，所以處于平穩(wěn)遞增狀態(tài)。但是當(dāng)AOT濃度在0.08 g/mL～0.12 g/mL的范圍時(shí)，反膠束聚集數(shù)越發(fā)接近飽和，反膠束體系黏度增大，隨著表面活性劑間的分子相互作用和位阻效應(yīng)的明顯增強(qiáng)，蛋白增溶后臨近膠束之間會自發(fā)融合形成大體積的新膠束體系以實(shí)現(xiàn)整個系統(tǒng)的穩(wěn)定[13-14]，因此，在該范圍內(nèi)，增溶后的膠束體系平均粒徑迅速增加，但增溶的蛋白質(zhì)的總量并未有所增加。這和前萃率的變化規(guī)律是一致的，如圖1-（D）所示。整體呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，并在AOT濃度為0.08 g/mL時(shí)前萃率最高。因?yàn)樵贏OT濃度較低時(shí)，形成的反膠束聚集數(shù)目太少，難以增溶較多的大豆蛋白，而AOT濃度太高時(shí)，體系黏度較大，膠束溶液的整體極性增大，反膠束聚集數(shù)目的增加趨勢逐漸平緩，且有效水核結(jié)構(gòu)并未增加，因此增溶蛋白后的膠束相互融合之后雖有利于蛋白的提取，但提取率基本保持不變。

2.2 加水量對反膠束萃取的影響規(guī)律研究

加水量對反膠束萃取的影響規(guī)律研究見圖2。

圖2 加水量對反膠束萃取大豆分離蛋白的影響Fig.2 The effect of water addition on the reverse micelle extraction of SPI

加水量對大豆蛋白增溶于反膠束體系前后的增溶水量和W0的影響規(guī)律如圖2-（A，B）。由圖可以看出隨著加水量的逐漸增加，增溶水量和W0值均逐漸增加，而且前萃液的增溶水量和W0值均低于同等條件下的空膠束溶液。加水量在0.02mL/mL～0.06mL/mL的范圍內(nèi)，增溶水量和W0都迅速增加，這是因?yàn)楫?dāng)反膠束體系膠束聚集情況一樣時(shí)，加水量越多，表面活性劑極性頭水化程度越大，形成的水核結(jié)構(gòu)越大，因此，隨著加水量的增加，增溶水量和W0都不斷增加。但是，反膠束體系水核結(jié)構(gòu)能夠增溶的水量是有限的。因此當(dāng)加水量在0.0mL/mL～0.12mL/mL時(shí)，隨著加水量的增加，反膠束體系的增溶水量逐漸接近飽和，增加趨勢平穩(wěn)緩慢。

加水量對蛋白增溶前后反膠束體系的平均粒徑的影響規(guī)律見圖2-（C）。反膠束溶液的平均粒徑整體呈現(xiàn)遞增趨勢，且在加水量為0.02mL/mL～0.06mL/mL的范圍內(nèi)迅速增加，而在0.06mL/mL～0.10mL/mL的范圍內(nèi)基本沒有變化，這與增溶水量和W0的變化規(guī)律是一致的，這是因?yàn)樵诜茨z束水核結(jié)構(gòu)飽和前，加水量對水核的大小影響較為明顯。但加水量大于0.06mL/mL的時(shí)候，反膠束體系中的水核結(jié)構(gòu)接近飽和，因此水核的大小不再隨著加水量增加而變化，甚至加水量過多時(shí)會破壞穩(wěn)定的反膠束體系。對于前萃液，平均粒徑是在加水量為0.04 g/mL時(shí)激增后迅速下降，之后隨著加水量的增加平均粒徑保持平穩(wěn)。加水量為0.02mL/mL時(shí)，反膠束體系中大多數(shù)為不含水核結(jié)構(gòu)的“實(shí)心膠束”，不具備增溶蛋白質(zhì)的能力，因此前萃液中的平均粒徑較小。而隨著加水量的遞增，當(dāng)加水量增加至0.04mL/mL時(shí)，前萃液的粒徑出現(xiàn)明顯增加，當(dāng)加水量繼續(xù)增加時(shí)，前萃液粒徑減小并保持穩(wěn)定。這可能是由于加水量在0.04mL/mL時(shí)，蛋白質(zhì)增溶后，膠束的體積和表面積增加，需要額外的表面活性劑覆蓋以形成完整的體系，然而增溶水量和W0值未出現(xiàn)異常變化，只有前萃液膠束體系粒徑出現(xiàn)激增，極有可能是因?yàn)槟z束之間發(fā)生了融合現(xiàn)象，形成了較大的膠束[15]。

加水量對反膠束體系萃取大豆分離蛋白的前萃率的影響規(guī)律見圖2-（D）。由圖2-（D）中前萃率的規(guī)律也可以看出，隨著加水量的增加，前萃率逐漸增加然后基本保持穩(wěn)定，這是因?yàn)殡S著加水量的增加，膠束粒徑增大，增溶蛋白質(zhì)的能力逐漸增強(qiáng)。當(dāng)加水量在0.06 g/mL之后，反膠束溶液含水量基本飽和，因此前萃率也基本保持穩(wěn)定。結(jié)合粒徑變化規(guī)律可以看出，反膠束的粒徑與前萃率是存在一定的正相關(guān)性的，但前萃液的粒徑對前萃率的影響就沒有直接的相關(guān)性。

2.3 pH值對反膠束萃取的影響規(guī)律研究

反膠束溶液配制過程中所添加的鹽溶液的pH值對反膠束溶液的增溶水量和W0值的影響如圖3所示，均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，且不同pH梯度下并未有較為顯著的差異，表明酸堿度對于反膠束溶液的增溶水量影響并不明顯。

反膠束萃取前后體系的平均粒徑變化規(guī)律如圖3-（C）所示。

圖3 pH值對反膠束萃取大豆分離蛋白的影響Fig.3 The effect of pH on the reverse micelle extraction of SPI

由圖3-（C）可以看出pH值對于反膠束溶液的膠束粒徑大小影響也是呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢，這和體系W0的變化規(guī)律是一致的。而且，蛋白增溶后的膠束直徑也呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，且在pH值為7的情況下粒徑最大。研究表明[16]反膠束增溶蛋白的能力與反膠束的平均粒徑存在一定線性關(guān)系，反膠束的粒徑較大，便可以增溶較大分子的蛋白，進(jìn)而在一定程度上提高蛋白的萃取率。當(dāng)AOT濃度和加水量恒定的情況下，反膠束數(shù)目和反膠束粒徑并未出現(xiàn)較大波動，均在小范圍內(nèi)呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，因此，由圖3-（D）可以看出前萃率的變化趨勢也與粒徑基本保持一致，在pH為7時(shí)前萃率最高，這和楊光勝。大豆分離蛋白的等電點(diǎn)4.5，在pH高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的情況下，帶負(fù)電的蛋白質(zhì)分子依然能增溶進(jìn)入陰離子表面活性劑形成的反膠束體系，表明蛋白增溶于反膠束體系的動力并非主要是由靜電相互作用引起的，還有疏水相互作用和空間位阻效應(yīng)[17]。因?yàn)槟承﹤?cè)鏈氨基酸如谷氨酸和天冬氨酸等會在高于蛋白等電點(diǎn)的情況下表現(xiàn)出較強(qiáng)的疏水性[18]。而且前萃率的變化規(guī)律和粒徑的變化規(guī)律較為一致，也表明在表面活性劑和加水量恒定（即反膠束數(shù)目基本穩(wěn)定）的狀態(tài)下，粒徑較大能為蛋白質(zhì)的增溶提供相對較大的空間，提高萃取率。

2.4 KCl濃度對反膠束萃取的影響規(guī)律研究

KCl濃度對反膠束萃取大豆分離蛋白的前萃過程的影響如圖4所示。

圖4 KCl濃度對反膠束萃取大豆分離蛋白的影響Fig.4 The effect of KCl on the reverse micelle extraction of SPI

由圖4可以看出來隨著KCl濃度的增加，增溶水量和W0值均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。這表明鹽離子濃度較大時(shí)，反膠束的水核結(jié)構(gòu)較小，這很可能是因?yàn)辂}離子濃度的增加導(dǎo)致水相的界面張力增加，進(jìn)而阻礙了鹽溶液的增溶。與此同時(shí)，蛋白質(zhì)增溶后的膠束的增溶水量和W0也呈相應(yīng)減小的趨勢。由于水核的大小能很大程度上影響反膠束的尺寸及相關(guān)特性[19]，因此，反膠束的平均粒徑隨著鹽離子濃度的增加也應(yīng)該是呈現(xiàn)逐漸較小的趨勢，這和圖4-（C）的反膠束平均粒徑的變化規(guī)律是一致的。即鹽離子濃度較小時(shí)，體系中反膠束的數(shù)目較多尺寸較小，而鹽離子濃度增加后，反膠束的數(shù)目較少尺寸增大。這一反膠束溶液的尺寸變化規(guī)律另一方面是由于隨著鹽離子濃度的增加，膠束雙電子層的厚度變薄，導(dǎo)致電位之間靠的更為接近從而形成足夠的斥力來平衡反膠束形成的力，因此，整體粒徑變化是逐漸減小的[20]。而對于前萃液，膠束的平均粒徑的變化規(guī)律恰好相反，呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，這可能是由于鹽離子濃度較大時(shí)，反膠束數(shù)目多但水核尺寸較小，因此臨近膠束之間相溶增加水核結(jié)構(gòu)從而更好的實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的增溶。

圖4-（D）反映的是KCl濃度對反膠束體系萃取大豆分離蛋白的前萃率的影響規(guī)律。從圖4-（D）中可以看出前萃率隨著KCl濃度的增加呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢，一方面原因是如上所述，增溶水量的逐漸減小直接影響蛋白質(zhì)的增溶過程，即便較大鹽濃度時(shí)臨近膠束相溶也并未增加增溶蛋白質(zhì)的量；另一方面鹽濃度的增加直接導(dǎo)致界面張力的增加，進(jìn)一步阻礙蛋白質(zhì)的增溶。因此，該現(xiàn)象進(jìn)一步證明適當(dāng)?shù)撵o電引力作用才能促進(jìn)前萃率的提高。

3 結(jié)論

研究表明，不同單因素均會對反膠束溶液的增溶水量、W0及膠束粒徑產(chǎn)生影響。反膠束體系的微結(jié)構(gòu)的變化會直接影響蛋白質(zhì)的增溶過程造成前萃率的變化。而且研究再次證實(shí)蛋白增溶過程中，膠束之間會發(fā)生相互融合的現(xiàn)象以實(shí)現(xiàn)體系的穩(wěn)定。

此外，整體來看，反膠束溶液的含水量均低于同條件下的前萃液的含水量，且前萃液的平均粒徑整體顯著高于反膠束溶液，這表明蛋白增溶進(jìn)反膠束后，會與水核中的水分子發(fā)生相互作用，且導(dǎo)致膠束粒徑有顯著增加，可以推斷反膠束加溶蛋白質(zhì)的過程更為符合“水殼模型”。

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The Changes of Relationship between the Microstructure of Reverse Micelles and Their Extraction Rates

ZHANG Qian1，CHEN Fu-sheng1，*，SUN Qian2
（1.College of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，Henan，China；2.Advanced Biotechnology and Application Research Center，School of Chemistry and Biological Engineering，University of Science and Technology Beijing，Beijing 100024，China）

The changes about the average size and the W0of the sodium bis（2-ethylhexyl）sulfo succinate（AOT）/isooctane reverse micelles during the forward extraction were studied under different conditions in this work.And the correlation between the microstructure of the reverse micelles and the forward extraction rate was discussed in conjunction with the trends of the forward extraction.

full-fat soybean powder；reverse micelle；microstructure；forward extraction rate

張倩，陳復(fù)生，孫倩.反膠束的微結(jié)構(gòu)與前萃率相互關(guān)系的研究[J].食品研究與開發(fā)，2018，39（1）：4-10

ZHANG Qian，CHEN Fusheng，SUN Qian.The Changes of Relationship between the Microstructure of Reverse Micelles and Their Extraction Rates[J].Food Research and Development，2018，39（1）：4-10

10.3969/j.issn.1005-6521.2018.01.002

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21376064、21676073）

張倩（1992—），女（漢），在讀碩士研究生，研究方向：蛋白質(zhì)資源開發(fā)與利用。

*通信作者：陳復(fù)生（1963—），男（漢），教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：食品資源開發(fā)與利用。

2017-06-06