兒童遺傳性果糖不耐受癥1例臨床和基因突變分析

葉曉琴 常國(guó)營(yíng) 李 娟 丁 宇 李 牛 王 劍 王秀敏 沈亦平

1.安徽省蚌埠市第三人民醫(yī)院（安徽蚌埠 233000）；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心（上海 200127）

兒童遺傳性果糖不耐受癥1例臨床和基因突變分析

葉曉琴1*常國(guó)營(yíng)2*李 娟2丁 宇2李 牛2王 劍2王秀敏2沈亦平2

1.安徽省蚌埠市第三人民醫(yī)院（安徽蚌埠 233000）；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心（上海 200127）

目的 分析遺傳性果糖不耐受癥（HFI）的臨床及基因突變特點(diǎn)。方法 回顧分析1例HFI患兒的臨床特征以及患兒及其父母的基因檢測(cè)結(jié)果?；驒z測(cè)采用高通量測(cè)序方法，并以Sanger測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果 患兒，女，4歲3個(gè)月。表現(xiàn)為反復(fù)低血糖發(fā)作，明顯生長(zhǎng)落后。病情穩(wěn)定時(shí)乳酸、尿微量蛋白稍高，甲狀腺激素、皮質(zhì)醇、糖化血紅蛋白、胰島素、C肽等無(wú)異常。腦電圖示癇樣活動(dòng)?；驕y(cè)序顯示存在醛縮酶B基因（ALDOB）復(fù)合雜合突變，3號(hào)內(nèi)含子發(fā)現(xiàn)剪切突變（c.325-1G＞A），8號(hào)外顯子移碼突變（c. 865delC;p.L289fs*10）；其父親攜帶移碼突變，母親攜帶剪切突變。結(jié)論 通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，可確診由ALDOB突變致病的HFI。

靶向基因測(cè)序； 低血糖； 果糖不耐受； ALDOB基因； 基因突變

兒童低血糖（血糖＜3.9 mmol/L）可由眾多因素引發(fā)，除饑餓等生理因素外，包括1型糖尿病、2型糖尿病、新生兒糖尿病以及胰島素水平升高等病理因素均可誘發(fā)低血糖的發(fā)生，但仍有部分低血糖的發(fā)生原因不明[1,2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，基因缺陷是低血糖發(fā)生的重要原因之一。目前共有270余種單基因突變的報(bào)道（人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)http∶//www.omim.org/）。遺傳性果糖不耐受癥（hereditary fructose intolerance，HFI）是一種糖代謝途徑酶缺陷誘發(fā)的以低血糖為主要癥狀的先天性遺傳病，該病患者若不能有效避免低血糖反復(fù)發(fā)作可能會(huì)繼發(fā)其他多器官系統(tǒng)異常，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。如何快速準(zhǔn)確地進(jìn)行病因診斷是臨床關(guān)注的焦點(diǎn)。現(xiàn)將1例通過(guò)靶向基因測(cè)序診斷的HFI的臨床診療過(guò)程及基因分析結(jié)果報(bào)告如下，以期提高臨床醫(yī)師對(duì)該疾病的認(rèn)識(shí)。

1 臨床資料

患兒，女，漢族，上海兒童醫(yī)學(xué)中心初診年齡為4歲3個(gè)月。因反復(fù)低血糖2年余就診。患兒入院前2年反復(fù)發(fā)生低血糖，常在饑餓時(shí)發(fā)作，表現(xiàn)為大汗、精神差、昏昏欲睡，伴四肢抖動(dòng)、雙眼上翻等，當(dāng)?shù)蒯t(yī)院急診查血糖低，靜脈補(bǔ)充糖后可緩解。入院前3個(gè)月曾發(fā)生昏迷1小時(shí)，查血糖0.82 mmol/L，血鉀1.56 mmol/L，予靜脈補(bǔ)糖、鉀后好轉(zhuǎn)。入院前1個(gè)月來(lái)頻繁出現(xiàn)大汗、四肢抖動(dòng)等低血糖癥狀。患兒平素體質(zhì)差，易患上呼吸道感染，不喜甜食?；純篏1P1，足月剖宮產(chǎn)，出生體質(zhì)量3 350 g，產(chǎn)時(shí)無(wú)窒息，母孕史正常?；純荷L(zhǎng)發(fā)育較落后。父母否認(rèn)近親結(jié)婚，家族中無(wú)類(lèi)似疾病患者。體格檢查：腋溫36.8 ℃，脈搏99次/min，呼吸30次/min，血壓105/64 mmHg。身高 94 cm（－2.7 SD），體質(zhì)量 12 kg，體質(zhì)指數(shù)（BMI）為13.6 kg/m2；神清，反應(yīng)可，無(wú)特殊面容。心肺無(wú)殊。腹軟，肝臟肋下3 cm，劍突下2.5 cm，質(zhì)軟；神經(jīng)系統(tǒng)未見(jiàn)異常。實(shí)驗(yàn)室檢查示血常規(guī)、糞常規(guī)、肝腎功能及電解質(zhì)正常；三酰甘油1.94 mmol/L（↑），血氨19 ?mol/L，乳酸3.00 mmol/L（↑）；甲狀腺功能、醛固酮、皮質(zhì)醇以及促腎上腺皮質(zhì)激素檢測(cè)均未見(jiàn)異常；空腹血糖4.8 mmol/L，胰島素8.7 ?IU/mL，C肽 1.61 ng/mL，糖化血紅蛋白（HbA1C）5.6%；尿常規(guī)示白蛋白+，尿微量白蛋白90.9 mg/L（↑）、尿轉(zhuǎn)鐵蛋白7.00 mg/L（↑）、尿α1微球蛋白38.3 mg/L（↑）、尿IgG 11.20 mg/L（升高），24小時(shí)尿電解質(zhì)正常。腦電圖示左顳、兩枕區(qū)癇樣活動(dòng)。心臟彩超示左房、左室稍增大。甲狀腺及腹部超聲正常。頭顱MRI平掃+增強(qiáng)未見(jiàn)異常。

經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，并取得患兒父母知情同意后，采集患兒及其父母外周血2 mL，置于含乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝試管，充分混勻；取200 ?L全血，使用QIAamp DNA Blood Mini Kit 試劑盒（Qiagen，德國(guó)）提取基因組DNA，用NanoDrop 2000 分光光度計(jì)對(duì)所提DNA 定量。

采用高通量測(cè)序進(jìn)行致病基因鑒定。取3 ?g患兒的基因組DNA經(jīng)M220型核酸打斷儀（美國(guó)Covaris公司）處理后得到150～200 bp的DNA片段，采用SureSelect試劑盒（美國(guó)Agilent公司）制備測(cè)序文庫(kù)，捕獲探針為包含2 742個(gè)已知致病基因的Agilent Inherited Disease Panel 試劑盒（目標(biāo)區(qū)域約為12 Mb）。經(jīng)2200 TapeStation儀器（Agilent，美國(guó)）對(duì)文庫(kù)樣本進(jìn)行質(zhì)量及濃度檢測(cè)（確認(rèn)雜交捕獲文庫(kù)的峰值為310～350 bp，濃度為2～20 mmol/L）。使用HiSeq 2500 System（Illumina，美國(guó)）進(jìn)行高通量測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)Illumina Sequence Control Software（SCS）評(píng)估合格后，使用NextGENe軟件（美國(guó)SoftGenetics公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取，讀取完畢后的數(shù)據(jù)上傳到美國(guó)Ingenuity Systems公司的Ingenuity Variant Analysis軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析。Ingenuity軟件對(duì)變異篩選的參數(shù)包括：①去除測(cè)序質(zhì)量差、可信度低的變異；②去除正常對(duì)照人群數(shù)據(jù)庫(kù)（包括ExAC數(shù)據(jù)庫(kù)和千人基因數(shù)據(jù)庫(kù)）中頻率＞1%的變異；③去除“良性變異”，包括同義變異、經(jīng)PolyPhen-2 和 SIFT軟件預(yù)測(cè)為非有害的錯(cuò)義變異以及經(jīng)MaxEntScan軟件預(yù)測(cè)不會(huì)改變mRNA剪切的變異；④以“低血糖（hypoglycemia）”為臨床指征篩選變異。結(jié)果顯示患兒存在ALDOB基因的復(fù)合雜合突變，其中3號(hào)內(nèi)含子發(fā)現(xiàn)1個(gè)雜合剪切突變（c.325-1G＞A），8號(hào)外顯子存在1個(gè)雜合的移碼突變（c.865delC，p.L289fs*10），其中c.325-1G＞A為國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道。

隨后以Sanger測(cè)序驗(yàn)證ALDOB的基因變異。用于擴(kuò)增ALDOB（GenBank序列號(hào)：NM_000035.3）基因的引物使用UCSC在線(xiàn)軟件（http：//genome.ucsc.edu/index.html）進(jìn)行設(shè)計(jì)，針對(duì)ALDOB基因3號(hào)內(nèi)含子和4號(hào)外顯子區(qū)域的引物序列是：正向引物 5'-TGGGTCCCTCGCACTAATAC-3'，反向引物5'-AAACCAGGTACGTGTGGCTC-3'；針對(duì)ALDOB基因8號(hào)外顯子區(qū)域的引物序列是：正向引物5'-AACTAGCTTCAGCAAAAGCAAAC-3'，反向引物5'-TGACCTCTACTGCCACATTTTC-3'。使用rTaq DNA聚合酶（日本TaKaRa公司）進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)后使用QIAquick Gel Extraction Kit（德國(guó)Qiagen公司）進(jìn)行純化，純化后的產(chǎn)物經(jīng)ABI3730XL測(cè)序儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）Sanger測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)使用美國(guó)SoftGenetics公司Mutation Surveyor軟件進(jìn)行分析。結(jié)果表明該患兒存在兩處雜合變異，其父親攜帶移碼突變而母親攜帶剪切突變（圖1A）。采用HSF以及MaxEntScan在線(xiàn)軟件對(duì)c.325-1G＞A的分析結(jié)果表明，該變異可破壞原有的剪切位點(diǎn)，從而導(dǎo)致ALDOB基因mRNA水平的異常剪切（圖1B）。使用Human Splicing Finder （HSF, http∶//www.umd.be/HSF3/HSF.html）和MaxEntScan (http∶//genes.mit.edu/burgelab/maxent/Xmaxentscanscoreseq.html)對(duì)ALDOB基因 c.325-1G＞A變異進(jìn)行剪切位點(diǎn)影響評(píng)估，結(jié)果顯示c.325-1G＞A可破壞原有的剪切位點(diǎn)（HSF軟件的變異值為－32.84%，MaxEnt軟件的變異值為－112.63 %。HSF軟件的變異值＜－10%、MaxEnt軟件的變異值＜－30%判定為剪切位點(diǎn)破壞）。

圖1 患兒基因測(cè)序結(jié)果

確診HFI后，患兒每日睡前按5 g/kg加食生玉米淀粉以避免夜間饑餓，同時(shí)服用左卡尼汀、輔酶Q10及維生素等改善代謝，另外告知日常飲食杜絕攝入含果糖的食物?；純撼鲈汉蠖ㄆ陂T(mén)診隨訪，未再見(jiàn)低血糖發(fā)生，生長(zhǎng)發(fā)育良好，復(fù)查尿常規(guī)及腎功能均正常，尿微量蛋白較前好轉(zhuǎn)。

2 討論

HFI是由果糖二磷酸醛縮酶（fruetaidolase，fructose-1,6-diphosphatealdolase）缺陷導(dǎo)致的代謝病，屬常染色體隱性遺傳，1956 年Chambers等[3]首次報(bào)道。發(fā)病率在英國(guó)約為1∶22 000、波蘭約為1∶31 000、歐洲中部約為1∶26 100，而中國(guó)人群的發(fā)病率未知[4]。該病臨床表現(xiàn)各異，其重要臨床特征為攝入果糖、蔗糖或山梨醇后發(fā)生嚴(yán)重低血糖。若不及時(shí)終止食入該類(lèi)食物，患兒可發(fā)生肝、腎損傷及生長(zhǎng)發(fā)育障礙，甚至死于進(jìn)行性肝衰竭[5]。該病患兒年齡越小，癥狀越嚴(yán)重[6]。尤其是嬰兒期斷奶時(shí)，添加含果糖等食物可導(dǎo)致患兒喂食后20 ～ 30分鐘即可發(fā)生嘔吐、腹痛、昏迷等嚴(yán)重低血糖癥狀。多數(shù)患兒有拒甜食表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)室檢查可有高轉(zhuǎn)氨酶血癥、高乳酸、低磷、高尿酸、高鎂血癥、蛋白尿、非特異性氨基酸尿、腎小管酸中毒等[7]。本例患兒以反復(fù)低血糖就診，平素不喜甜食，存在生長(zhǎng)發(fā)育障礙，實(shí)驗(yàn)室檢查示肝腎功能、電解質(zhì)等尚正常，尿蛋白+，尿微量蛋白升高，提示可能存在腎臟早期損傷。其腦電圖示癇樣活動(dòng)可能繼發(fā)于低血糖。

HFI由ALDOB基因（OMIM#612724）突變導(dǎo)致。該基因位于9q31.1，由9個(gè)外顯子組成，其cDNA全長(zhǎng)1 095 bp，編碼由364個(gè)氨基酸組成的B型醛縮酶[8]。醛縮酶是一種同源四聚體的同工酶，主要催化果糖-1,6-二磷酸與果糖-1-磷酸之間的醇醛分裂。人體內(nèi)存在3種組織特異性的醛縮酶：肌肉組織中的ALDOA，肝臟、小腸和腎臟組織中的ALDOB以及腦組織中的ALDOC[4]。HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)共收錄了65個(gè)ALDOB基因的各類(lèi)變異，包括錯(cuò)義、無(wú)義、缺失、插入、剪接位點(diǎn)突變等，亦有啟動(dòng)子區(qū)域突變報(bào)道[9,10]。目前尚無(wú)基因型與表型相關(guān)性報(bào)道，疾病嚴(yán)重程度與攝食情況、年齡、文化和飲食習(xí)慣密切相關(guān)。歐洲和北美患者中最常見(jiàn)的是A149P、 A174D和 N334K這三種突變[11]。中國(guó)人群中曾報(bào)道1例基因診斷明確的HFI患者存在ALDOB基因的純合突變(c.479-482delAACA)[12]。本例患兒基因測(cè)序顯示存在ALDOB基因的復(fù)合雜合突變（c.325-1G＞A和c.865delC, p.L289fs*10），其中c.325-1G＞A為首次報(bào)道，生物信息學(xué)分析表明其可破壞原有的mRNA正常剪切；c.865delC, p.L289fs*10已在HFI患者中報(bào)道過(guò)[13]，是已知的致病變異。因此該患兒確診為HFI。

本例患兒以不明原因低血糖為首發(fā)癥狀反復(fù)就醫(yī)，因較長(zhǎng)時(shí)間無(wú)法明確診斷并采取有效預(yù)防措施，患兒出現(xiàn)不同程度繼發(fā)其他系統(tǒng)異常。糖代謝途徑涉及的酶學(xué)反應(yīng)及致病基因較多，僅從臨床表型難以確診。HFI這類(lèi)肝臟代謝酶缺陷疾病的確診主要依靠肝臟活檢酶活性的測(cè)定和一些特殊檢測(cè)手段，如HFI還可采用果糖耐受實(shí)驗(yàn)[14]。但這些方法創(chuàng)傷較大，存在一定程度的風(fēng)險(xiǎn)，且檢測(cè)過(guò)程繁瑣，因此難以在臨床診斷中廣泛采用。近年來(lái)的研究表明，基因測(cè)序特別是高通量測(cè)序適用于這類(lèi)遺傳代謝性病的診斷[15,16]。通過(guò)靶向基因測(cè)序，不僅使該例患兒在較短時(shí)間內(nèi)得到確診并接受有針對(duì)性的臨床干預(yù)和治療，同時(shí)也為再次生育提供產(chǎn)前咨詢(xún)和產(chǎn)前診斷的依據(jù)。此外，本研究可為先天性酶缺陷誘發(fā)反復(fù)低血糖的臨床診治提供借鑒思路。

目前對(duì)于HFI無(wú)根治方法，主要是對(duì)癥治療及飲食控制。一旦確診，需嚴(yán)格限制一切果糖、蔗糖或山梨醇等的攝入，避免低血糖發(fā)生。注意補(bǔ)充多種維生素，特別是水溶性維生素，防止微量元素缺乏。急性低血糖發(fā)作時(shí)主要給予葡萄糖靜滴及肝、腎功能不全輔助治療。并密切定期隨訪患兒肝、腎功能及生長(zhǎng)發(fā)育等情況。

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The analysis of clinical manifestations and genetic mutations in a child with hereditary fructose intolerance

YE Xiaoqin1, CHANG Guoying2, LI Juan2, DING Yu2, LI Niu2, WANG Jian2, WANG Xiumin2, SHEN Yiping2(1.The Third People’s Hospital of Bengbu, Bengbu 233000, Anhui, China; 2.Shanghai Children’s Medical Center Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200127, China)

Objective To analysis the clinical and gene mutation characteristics of hereditary fructose intolerance (HFI).Methods The clinical features and the results of gene testing in the child with HFI and her parents were analyzed retrospectively.Gene sequencing was carried out by high-throughput sequencing and validated by Sanger sequencing. Results The 4-year-3-month old girl had recurrent hypoglycemia episodes and growth retardation. When the condition was stable, the levels of lactic acid and urine micro protein were slightly higher, and the levels of thyroid hormone, cortisol, glycosylated hemoglobin, insulin and C peptide were normal. EEG showed epileptiform activity. Gene sequencing revealed the presence of aldolase B gene (ALDOB)compound heterozygous mutations, a novel splicing mutations (c.325-1G＞A) in intron 3 and a frameshift mutation (c. 865delC;p.L289fs*10) in exon 8. Her father carries a frameshift mutation, and her mother carries a splicing mutation. Conclusion The diagnosis of HFI caused by ALDOB mutation can be conf i rmed by high-throughput sequencing technology.

targeted gene sequencing; hypoglycemia; hereditary fructose intolerance; ALDOB gene; gene mutations

doi∶10.3969/j.issn.1000-3606.2017.12.002

李牛 電子信箱：liniu0509@163.com

*共同第一作者

2017-06-06)

蔡虹蔚)