阿爾海默茨病模型大鼠ERK的變化及山茱萸多糖干預(yù)①

邵 嘉，劉子純，詹 項，王萬濤，王宇嬌，王景霞

(1.佳木斯大學(xué)材料學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

阿爾海默茨病模型大鼠ERK的變化及山茱萸多糖干預(yù)①

邵 嘉1，劉子純2，詹 項2，王萬濤2，王宇嬌2，王景霞2

(1.佳木斯大學(xué)材料學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：觀察絲山茱萸對AD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響。方法：清潔級Wistar大鼠共75只；體重200～250g，隨機分為6組：(1)假手術(shù)組，10只；(2)青年組，13只；(3)Aβ對照組，13只；(4)陽性對照組，13只；(5)水煎劑組，13只；(6)多糖組，13只；標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一喂養(yǎng)，飲水自由。除青年組外，其他各組大鼠連續(xù)42d腹腔注射D-半乳糖(60mg/kg )，之后建立AD大鼠模型，采用淀粉樣蛋白1-40(Bamyloid,1-40) 海馬立體定向微量注射方法；通過HE染色、erk的檢測，觀察大鼠海馬CA1 、CA3區(qū)神經(jīng)元的變化。結(jié)果：青年組大鼠海馬區(qū)錐體細(xì)胞排列緊密均勻，輪廓清楚，細(xì)胞核大而圓，胞漿清亮；假手術(shù)組大鼠海馬細(xì)胞排列尚緊密、欠均勻，輪廓尚清；而Aβ對照組細(xì)胞排列松散、紊亂，胞體可見明顯萎縮，可見細(xì)胞空泡樣變、核固縮；陽性對照組、多糖組和水煎劑組細(xì)胞排列、細(xì)胞密度、核著色和細(xì)胞核形狀等較Aβ對照組有所改善。ERK染色結(jié)果：模型組與正常對照組和假手術(shù)組比較，CA1和CA3區(qū)陽性細(xì)胞率明顯下降，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。山茱萸多糖、水煎劑及多奈哌齊組與模型組比較， CA1和CA3區(qū)陽性細(xì)胞率升高(P<0.01), 多奈哌齊、山茱萸多糖及水煎劑組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：本實驗以Aβ毒性學(xué)說為切入點，采用海馬注射Aβ1-40制作大鼠AD模型，探討山茱萸對AD的治療作用及ERK的變化，為臨床應(yīng)用山茱萸治療AD提供實驗依據(jù)。

阿爾海默茨?。淮笫?；山茱萸多糖；ERK

老年性癡呆(Alzheimer’s disease，AD)是以智力減退、行為損害為主要特征的臨床綜合征，發(fā)病緩慢，呈進行性加重，發(fā)病率隨年齡增高[1]。主要病理特征是老年斑神經(jīng)元纖維纏結(jié)、海馬錐體細(xì)胞變性和神經(jīng)元數(shù)量減少。老年斑的主要成分是Aβ，高濃度Aβ對神經(jīng)元有毒性作用，Aβ沉積引起AD腦膽堿能神經(jīng)元減少，Aβ沉積范圍與神經(jīng)損傷和認(rèn)知功能缺損有直接相關(guān)性。神經(jīng)纖維纏結(jié)以成對螺旋絲樣結(jié)構(gòu)存在，患者癡呆的程度伴隨神經(jīng)纖維纏結(jié)的數(shù)量的增加逐漸加重[2]。上述病理性改變發(fā)生在與學(xué)習(xí)記憶以及認(rèn)知有關(guān)的皮質(zhì)、海馬等膽堿能系統(tǒng)。山茱萸主要具有免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗氧化及抗癌等作用，且毒副作用小，與治療AD的藥物多奈呱齊在提高AD患者操作性總有效率方面，差異無顯著性[3]。本實驗以Aβ毒性學(xué)說為切入點，采用海馬注射Aβ1-40制作大鼠AD模型，探討山茱萸對AD的治療作用及機制，為臨床應(yīng)用山茱萸治療AD提供實驗依據(jù)。

1 實驗動物和藥品

清潔級Wistar大鼠75只，購自大連醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，體重200～250g，隨機分為6組：(1)假手術(shù)組，10只；(2)青年組，13只；(3)Aβ對照組，13只；(4)陽性對照組，13只；(5)水煎劑組，13只；(6)多糖組，13只；標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一喂養(yǎng)，飲水自由。除青年組外，其他各組大鼠連續(xù)42d腹腔注射D-半乳糖(60mg/kg )，這后進行手術(shù)。術(shù)前進行水迷宮檢測，10%的水合氯醛腹腔注射進行麻醉(380mg/kg)，將大鼠固定在腦立體定位儀上，前囟后3.8mm，中線右側(cè)2mm，進針至距腦表面3mm，2min內(nèi)緩慢注射，2μL生理鹽水注射與假手術(shù)組大鼠，其余各組(青年組除外)大鼠注射Aβ1-40(10μg·μL-1) 2μL，留針10min后，緩慢拔出，縫合切口，低溫環(huán)境下大鼠蘇醒。連續(xù)經(jīng)胃灌服給藥30d，于最后一次給藥后次日，行水迷宮檢測。

2 標(biāo)本采集

2.1 組織病理學(xué)觀察

大鼠乙醚麻醉、主動脈插管、生理鹽水灌洗、 10%多聚甲醛灌注約30min、組織變白，位于前囟后4mm處取腦組織，常規(guī)固定、脫水、透明、石蠟包埋，切片厚5μm，常規(guī)脫蠟入水，備用。

2.2 erk表達的檢測

將石蠟切片脫蠟入水，滴加3%H2O2室溫孵育10min，蒸餾水洗2min·(次×3)-1，微波熱修復(fù)抗原20min，PBS洗2min·(次)-1×3，滴加山羊血清封閉液37℃孵育20min，甩去多余血清，加erk抗體，置于濕盒中4℃過夜，PBS洗5min·(次)-1×3，滴加生物素化Ⅱ抗，水洗5min·(次)-1×3；滴加SABC37℃孵育30min，加DAB顯色3min，阻斷后蘇木素復(fù)染，脫水中性樹脂封片。觀察大鼠海馬CA1、CA3區(qū)40×檢測陽性細(xì)胞數(shù)。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠海馬區(qū)一般病理學(xué)變化

見圖1～2，青年組大鼠海馬區(qū)錐體細(xì)胞排列均勻，輪廓清晰整齊，胞漿亮，核大核仁明顯；假手術(shù)組大鼠海馬細(xì)胞排列尚緊密、欠均勻，輪廓尚清；而Aβ對照組細(xì)胞排列松散、紊亂，胞體可見明顯萎縮， 可見細(xì)胞空泡樣變、核固縮；陽性對照組、多糖組和水煎劑組細(xì)胞排列、細(xì)胞密度、核著色和細(xì)胞核形狀等較Aβ對照組有所改善。

圖1 大鼠海馬CA1區(qū)一般形態(tài)變化(400×)

圖2 大鼠海馬CA3區(qū)一般形態(tài)變化(400×)

3.2 海馬CA1區(qū)、海馬CA3 區(qū)ERK檢測結(jié)果

見表1。

表1 各組海馬CA1區(qū)、海馬CA3 區(qū)ERK陽性細(xì)胞

由表1可見模型組：與青年組和假手術(shù)組相比，ERK陽性細(xì)胞率明顯減少，有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。山茱萸水煎劑組、山茱萸多糖組、多奈哌齊組：與模型組相比，ERK陽性細(xì)胞率增加，有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，三個用藥組無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05) 。

4 討論

阿爾茨海默病(AD)是一種病因和發(fā)病機制尚未完全明了且常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。國內(nèi)外學(xué)者研制很多種AD動物模型，符合其臨床和病理特點，為AD的研究奠定了基礎(chǔ)。大鼠基底核膽堿能神經(jīng)元，發(fā)出投射纖維到海馬，扣帶皮質(zhì)和大腦半球，包括額葉、頂葉和顳葉等廣泛區(qū)域，與學(xué)習(xí)記憶過程有關(guān)。Aβ通過毒性作用使中樞膽堿能神經(jīng)元變性壞死，上行投射纖維變性，位于海馬及大腦皮質(zhì)神經(jīng)元膽堿能支配丟失，導(dǎo)致?lián)p害發(fā)生，膽堿攝取能力及釋放減少，膽堿能系統(tǒng)退化，活性下降、基底前腦膽堿能神經(jīng)元嚴(yán)重丟失，導(dǎo)致 AD 患者進行性記憶障礙[4～6]。由此可見，Aβ在 AD 的發(fā)病過程發(fā)揮核心作用，通過直接引發(fā)細(xì)胞凋亡發(fā)生。實驗結(jié)果顯示:海馬內(nèi)注射Aβ1-40的模型組大鼠HE染色可見海馬區(qū)神經(jīng)元不規(guī)則排列，數(shù)量減少，可見錐體細(xì)胞大量壞死，海馬內(nèi)注射Aβ1-40建立的AD模型大鼠符合神經(jīng)元丟失等病理學(xué)改變，可靠且有實用意義。青年組大鼠海馬區(qū)可見排列緊密均勻，輪廓清楚的椎體細(xì)胞，胞漿清亮；假手術(shù)組大鼠海馬細(xì)胞排列尚緊密、欠均勻，輪廓尚清；而Aβ對照組細(xì)胞排列松散、紊亂，胞體可見明顯萎縮，可見細(xì)胞空泡樣變、核固縮；陽性對照組、多糖組和水煎劑組細(xì)胞排列、細(xì)胞密度、核著色和細(xì)胞核形狀等較Aβ對照組有所改善。ERK信號通路是目前研究較活躍的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，ERK參與調(diào)控細(xì)胞的增殖分化、凋亡，神經(jīng)的損傷與修復(fù)等過程，腦內(nèi)神經(jīng)元長時程增強的形成[7～10]以及認(rèn)知學(xué)習(xí)功能與ERK密切相關(guān)[8～10]山茱萸可能通過激活ERK途徑，作用機制可能是ERK1/2磷酸化水平增高，可以調(diào)節(jié)樹突蛋白合成，影響與LTP以及神經(jīng)突觸可塑性相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子和蛋白質(zhì)翻譯起始因子的磷酸化狀態(tài)，提高AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力, 山茱萸多糖改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力通過激活ERK途徑實現(xiàn)的。

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1.黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目，編號：201610222031；2.黑龍江省教育廳科研項目,編號：12541791。

邵嘉(1997～)女，黑龍江佳木斯人,在讀本科生。

王景霞(1964～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:wangjingxia1964@163.com。

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1008-0104(2017)06-0039-02

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