Cu2+、Zn2+對(duì)三疣梭子蟹幼蟹的急性毒性

蘇志星，何 杰，許文軍，鄭寬寬，羅佶龍，王緒杰

（1.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021）

Cu2+、Zn2+對(duì)三疣梭子蟹幼蟹的急性毒性

蘇志星1，何 杰2，許文軍1，鄭寬寬1，羅佶龍2，王緒杰2

（1.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021）

以三疣梭子蟹幼蟹（體質(zhì)量為：15.3±1.2 g）為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采用靜水體外暴露法,開展了兩種常見重金屬離子（Cu2+、Zn2+）的急性毒性和加和等毒性強(qiáng)度聯(lián)合毒性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：（1）Cu2+、Zn2+對(duì)三疣梭子蟹幼蟹的96 h半致死質(zhì)量濃度分別為3.934 mg/L和3.901 mg/L；三疣梭子蟹幼蟹對(duì)Cu2+、Zn2+的96 h安全質(zhì)量濃度分別為0.039 34 mg/L和0.039 01 mg/L，表明兩種重金屬對(duì)梭子蟹幼蟹的毒性相近；（2）Cu2+、Zn2+離子在加和等毒性強(qiáng)度下對(duì)三疣梭子蟹幼蟹96 h聯(lián)合毒性與其濃度配比相關(guān)，低毒性強(qiáng)度的Cu2+對(duì)Zn2+具有拮抗作用，低毒性強(qiáng)度的Zn2+對(duì)Cu2+具有協(xié)同作用，當(dāng)Cu2+、Zn2+毒性強(qiáng)度相當(dāng)時(shí)表現(xiàn)為相互獨(dú)立作用。

Cu2+；Zn2+；急性毒性；聯(lián)合毒性；三疣梭子蟹；幼蟹

三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus，以下簡稱梭子蟹）隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門、甲殼綱、十足目、梭子蟹科、梭子蟹屬，由于其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，已成為我國最受歡迎的養(yǎng)殖品種之一。隨著養(yǎng)殖技術(shù)的改進(jìn)和提升，梭子蟹養(yǎng)殖面積不斷增加，2016年全國養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到12.5萬t[1]。但是，在梭子蟹池塘養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展的同時(shí)，養(yǎng)殖環(huán)境的日漸惡化已成為遏制梭子蟹產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一。

近年來工業(yè)“三廢”和農(nóng)業(yè)污染物向海洋中肆意排放，使自然海區(qū)環(huán)境日漸惡化，對(duì)海洋生物的生存產(chǎn)生嚴(yán)重威脅[2]。廢水中所含重金屬已成為周邊養(yǎng)殖海域水環(huán)境惡化的最主要污染源之一，其中Cu2＋、Zn2＋為常見兩類；另外，由于Cu2＋可用于防治原生動(dòng)物引起的多種魚病，Zn2＋可以滅殺或除去蝦蟹等水產(chǎn)養(yǎng)殖生物的固著類纖毛蟲，致使Cu2＋、Zn2＋已作為常見藥物的主要成分而廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)踐生產(chǎn)中，因此，有關(guān)Cu2＋、Zn2＋對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的存活、生長及養(yǎng)成質(zhì)量的影響成為了養(yǎng)殖從業(yè)者極為關(guān)注的問題。

迄今為止，有關(guān) Cu2＋、Zn2＋對(duì)蝦蟹類甲殼動(dòng)物的毒性作用國內(nèi)已有較多研究[3-6]，但 Cu2＋、Zn2＋對(duì)三疣梭子蟹急性毒性研究主要集中于大眼幼體、溞狀幼體和稚蟹期，尚未見其對(duì)梭子蟹幼蟹期的生態(tài)毒理報(bào)道。筆者于2017年7月在浙江海洋水產(chǎn)研究所西軒島實(shí)驗(yàn)基地以三疣梭子蟹幼蟹作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，開展Cu2＋、Zn2＋兩種常見重金屬離子對(duì)梭子蟹幼蟹的急性毒性效應(yīng)研究，以期為養(yǎng)殖環(huán)境評(píng)估和水產(chǎn)養(yǎng)殖安全用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)于2017年7月在浙江海洋水產(chǎn)研究所西軒漁業(yè)科技島進(jìn)行。在養(yǎng)殖池塘去雄期間用誘釣的方法捕捉梭子蟹幼蟹500余只，暫養(yǎng)于室內(nèi)水泥池內(nèi)，水深0.5 m，暫養(yǎng)期間連續(xù)增氧，每天下午17：00投喂新鮮野雜魚。3 d后，選擇表體無損傷，十足健全、規(guī)格相近（平均體質(zhì)量為15.3±1.2 g）的健康個(gè)體參試。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

實(shí)驗(yàn)藥物CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O購自于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水配置成一定質(zhì)量濃度的母液備用，實(shí)驗(yàn)時(shí)用海水稀釋到所需濃度。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)理化條件

實(shí)驗(yàn)所用海水經(jīng)24 h暗沉淀處理，二次脫脂棉過濾，水溫26.2～29.5℃，鹽度26～27，pH 7.8～8.2，水質(zhì)符合我國《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》（GB11607-89）[7]。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)容器

實(shí)驗(yàn)所用容器為聚乙烯水族箱，規(guī)格（39×21×20.5 cm），實(shí)驗(yàn)前用對(duì)應(yīng)的濃度藥物浸泡12 h以上。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Cu2＋、Zn2＋單一金屬離子對(duì)梭子蟹幼蟹的急性毒性

經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定梭子蟹幼蟹實(shí)驗(yàn)藥物濃度范圍（96 h后的全致死濃度下限和全活濃度上限）后，設(shè)置5個(gè) Cu2＋和 Zn2＋質(zhì)量濃度梯度組，分別為 1.25 mg/L、2.50 mg/L、5.00 mg/L、10.00 mg/L、20.00 mg/L 和 2.07 mg/L、3.11 mg/L、4.67 mg/L、7.00 mg/L、11.20 mg/L，組內(nèi)設(shè)3個(gè)重復(fù)，另設(shè)對(duì)照組。向?qū)嶒?yàn)容器內(nèi)分別加入不同質(zhì)量濃度Cu2＋、Zn2＋溶液，溶液所用體積為10 L。采用不投餌、靜水連續(xù)充氣的方法，保持水質(zhì)和Cu2＋、Zn2＋的穩(wěn)定，開展單一藥物對(duì)幼蟹的急性毒性實(shí)驗(yàn)。每一質(zhì)量濃度梯度各放梭子蟹幼蟹10只，每隔2 h檢查一次實(shí)驗(yàn)蟹的情況，及時(shí)撈出死亡個(gè)體以免影響水質(zhì)，每隔24 h將所有溶液更換一次并記錄當(dāng)日死亡率。

1.2.2 Cu2＋、Zn2＋對(duì)梭子蟹幼蟹的聯(lián)合毒性

以單一重金屬離子96 h的半致死質(zhì)量濃度LC50作為致死閾濃度，計(jì)為一個(gè)毒性強(qiáng)度單位，通過加和等毒性強(qiáng)度方式設(shè)置兩種重金屬聯(lián)合毒性濃度梯度，Cu2＋、Zn2＋兩種重金屬的加和方式為 A（0＋1.0）、B（0.2＋0.8）、C（0.4＋0.6）、D（0.6＋0.4）、E(0.8＋0.2)和 F（1.0＋0）6 個(gè)組合，其中 A 和 F 組為對(duì)照組，藥液所用體積為10 L，每組內(nèi)設(shè)3個(gè)重復(fù)，采用不投餌、靜水連續(xù)充氣的方法，連續(xù)觀察受試個(gè)體的活動(dòng)情況，及時(shí)取出死亡個(gè)體，同上述方法一樣，每24 h換液一次并計(jì)算死亡率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)實(shí)驗(yàn)藥物對(duì)梭子蟹的急性毒性結(jié)果，建立死亡率-質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)直線回歸方程，借助SPSS19.0得到各相應(yīng)時(shí)段的回歸方程和半致死濃度值LC50以及死亡率和質(zhì)量濃度之間的相關(guān)性（P＜0.05為顯著水平），利用96 h的半致死濃度通過以下公式計(jì)算安全濃度（SC）：SC=0.01×96 h LC50。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 Cu2+-Zn2+對(duì)梭子蟹幼蟹的單一毒性效應(yīng)

實(shí)驗(yàn)開始后，梭子蟹幼蟹在兩種重金屬毒性脅迫下表現(xiàn)出相似的行為特征，但在同種重金屬不同實(shí)驗(yàn)藥物質(zhì)量濃度下的中毒現(xiàn)象存在明顯差異，具體表現(xiàn)為低質(zhì)量濃度組藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)蟹的毒性作用不明顯，與對(duì)照組基本相同，受試個(gè)體在入液后沒有表現(xiàn)明顯的不適反應(yīng)，靜置于容器底部，而高質(zhì)量濃度組藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)蟹的毒性作用明顯，實(shí)驗(yàn)蟹入液后反應(yīng)劇烈，焦躁不安，上下游動(dòng)，活動(dòng)頻率增加，個(gè)體不適性明顯增強(qiáng)，經(jīng)過一段時(shí)間的適應(yīng)才趨于安靜。隨著時(shí)間的延長，各藥物濃度組受試個(gè)體在容器內(nèi)的活動(dòng)能力也明顯減弱，死亡個(gè)體數(shù)量明顯增加。由表1可知，死亡率與藥物質(zhì)量濃度和受試時(shí)間之間成正相關(guān)，即隨著藥物濃度的升高，死亡率顯著升高，但從梭子蟹幼蟹急性致毒死亡情形隨時(shí)間變化來看，在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度設(shè)置范圍內(nèi)，各藥物致梭子蟹幼蟹急性死亡的躍變特征表現(xiàn)為：Cu2+對(duì)梭子蟹幼蟹的死亡躍變臨界質(zhì)量濃度在5～10 mg/L之間，Zn2+的死亡躍變臨界質(zhì)量濃度為7～11.2 mg/L之間。

表1 Cu2+、Zn2+對(duì)梭子蟹幼蟹的急性毒性效應(yīng)Tab.1 The acute toxicity of Cu2+,Zn2+to juveniles of P.trituberculatus

根據(jù)表1中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算獲得Cu2+、Zn2+對(duì)梭子蟹急性毒性的死亡率-質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)回歸方程（表2）。結(jié)果表明，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，不同實(shí)驗(yàn)藥物質(zhì)量濃度組的致死效應(yīng)存在明顯差異（F值均大于相應(yīng)的 F0.05），建立的回歸方程也顯示出較好的正相關(guān)性（R2均大于 0.9）。Cu2+、Zn2+對(duì)梭子蟹 24 h、48 h、72 h、96 h的半致死質(zhì)量濃度 LC50值分別為 12.299 mg/L、7.192 mg/L、4.826 mg/L、3.934 mg/L和 7.280 mg/L、5.607 mg/L、4.397 mg/L、3.901 mg/L，LC50值隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長而減小。另外，各實(shí)驗(yàn)時(shí)間段內(nèi)的Cu2+的LC50值均略大于Zn2+，這表明Zn2+對(duì)梭子蟹的毒性比Cu2+稍強(qiáng)。由96 h半致死質(zhì)量濃度LC50值計(jì)算可得Cu2+、Zn2+離子的安全質(zhì)量濃度分別為0.039 34 mg/L和0.039 01 mg/L。

2.2 Cu2+-Zn2+對(duì)梭子蟹幼蟹的聯(lián)合毒性效應(yīng)

Cu2+-Zn2+對(duì)梭子蟹幼蟹的聯(lián)合毒性作用見表3?？芍?，Cu2+-Zn2+在加和等毒性強(qiáng)度下對(duì)梭子蟹幼蟹96 h聯(lián)合毒性所表現(xiàn)的毒性特征，與兩種離子之間的匹配比例緊密相關(guān)。由表3可知，在同一毒性強(qiáng)度配比內(nèi)，隨著時(shí)間的增加，死亡率逐漸上升；而不同毒性強(qiáng)度配比間在相同受試時(shí)間內(nèi)的死亡率也存在明顯差異，具體表現(xiàn)為：Cu2+-Zn2+兩種離子之間存在協(xié)同、拮抗或相互獨(dú)立作用，即較低毒性強(qiáng)度的Cu2+對(duì)Zn2+具有拮抗作用，低毒性強(qiáng)度的Zn2+對(duì)Cu2+具有協(xié)同作用，當(dāng)Cu2+、Zn2+毒性強(qiáng)度相當(dāng)時(shí)表現(xiàn)為相互獨(dú)立作用。

表2 Cu2+、Zn2+對(duì)梭子蟹幼蟹單一毒性效應(yīng)特征分析Tab.2 Analysis on acute toxicity of Cu2+,Zn2+to juveniles of P.trituberculatus

表3 Cu2+-Zn2+聯(lián)合毒性對(duì)梭子蟹幼蟹的毒性效應(yīng)Tab.3 The joint toxicity of Cu2+and Zn2+to juveniles of P.trituberculatus

3 討論

3.1 Cu2+、Zn2+對(duì)梭子蟹幼蟹的毒性效應(yīng)

Cu2+、Zn2+是甲殼動(dòng)物生存所必需的微量元素，低濃度的Cu2+、Zn2+有益于生長發(fā)育，但高濃度的Cu2+、Zn2+會(huì)對(duì)甲殼動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生毒害作用。梭子蟹幼蟹在高質(zhì)量濃度的Cu2+、Zn2+溶液中表現(xiàn)出明顯的中毒癥狀，主要表現(xiàn)為焦躁不安，上下游動(dòng)，試圖逃逸進(jìn)行避毒，而在掙扎無果后，其選擇靜臥不動(dòng)，以減少代謝水平和能量消耗，這與大多數(shù)水生動(dòng)物應(yīng)對(duì)毒物脅迫的行為對(duì)策相似。另外，同其它水生動(dòng)物一樣，蝦蟹類甲殼動(dòng)物機(jī)體中也含有重要的生物解毒組分-熱穩(wěn)定蛋白（HSP），對(duì)重金屬的毒性作用都有一定的抵御能力。金屬硫蛋白（MT）是HSP的主要成分[9]，含有大量的半胱氨酸殘基，其對(duì)金屬離子具有高度親和力[10]。當(dāng)生物機(jī)體中含有過量重金屬時(shí)，可以誘導(dǎo)MT與其結(jié)合，產(chǎn)生絡(luò)合物，有效緩解重金屬對(duì)機(jī)體的毒害作用。但是，蝦蟹類機(jī)體內(nèi)的MT的含量有限，誘導(dǎo)其表達(dá)也是有一定限度的，隨著金屬離子的濃度不斷升高以及機(jī)體在溶液中暴露時(shí)間不斷延長，MT絡(luò)合物的形成將成下降趨勢(shì)，導(dǎo)致的結(jié)果是重金屬離子不斷在生物機(jī)體中富集，其生理生化功能將受到嚴(yán)重?fù)p害，具體表現(xiàn)為中毒現(xiàn)象加深以致死亡率上升。本研究發(fā)現(xiàn)：低濃度Cu2+、Zn2+實(shí)驗(yàn)組在機(jī)體暴露24 h內(nèi)的死亡率極低，隨著重金屬濃度的不斷上升以及實(shí)驗(yàn)時(shí)間的不斷延長，而且Cu2+、Zn2+兩種金屬離子不同質(zhì)量濃度梯度組的致死效應(yīng)存在顯著差異（F均大于F0.01），建立的各時(shí)間段死亡率-質(zhì)量濃度之間的回歸方程具有高度擬合性（可決定系數(shù)R2均大于等于0.9197），且兩者之間的相關(guān)性極高（r均為顯著水平），這表明梭子蟹幼蟹死亡率與重金屬質(zhì)量濃度之間緊密相關(guān)，這與重金屬對(duì)水生動(dòng)物的作用特征相吻合。銅鋅與其他一些重金屬不同，低濃度銅鋅是生物體必需的；結(jié)合幼蟹和成蟹金屬硫蛋白含量情況、對(duì)銅鋅的需求情況分析毒性區(qū)別分析。

3.2 關(guān)于梭子蟹幼蟹對(duì)Cu2+、Zn2+安全濃度的評(píng)價(jià)

Cu2+、Zn2+可用于殺滅原生動(dòng)物、纖毛蟲以及控制藍(lán)藻的爆發(fā)等，已作為常見漁藥的主要成分而廣泛應(yīng)用于蝦蟹類養(yǎng)殖生產(chǎn)中。由表4所列不同蝦蟹類對(duì)Cu2+、Zn2+的96 h質(zhì)量安全濃度中可見，不同種類蝦蟹對(duì)Cu2+、Zn2+的耐受性不同，其中中華絨螯蟹Eriocheir sinensis與克氏原螯蝦Procambarus clarkii的耐受強(qiáng)度遠(yuǎn)高于鋸緣青蟹Scylla serrata和羅氏沼蝦Macrobrachium rosenbergii，而且同一種類不同發(fā)育階段或規(guī)格對(duì)同種重金屬離子的安全濃度也不同，本研究中梭子蟹幼蟹對(duì)Cu2+、Zn2+離子的質(zhì)量安全濃度分別為0.039 34 mg/L和0.039 01 mg/L，遠(yuǎn)高于大眼幼體階段的質(zhì)量安全濃度（分別為：0.002 91 mg/L和0.010 4 mg/L），表現(xiàn)出生物體規(guī)格越大，對(duì)有毒物質(zhì)耐受性越強(qiáng)的特征。另外，梭子蟹幼蟹對(duì)Cu2+的質(zhì)量安全濃度高于我國漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（GB11607-89）所規(guī)定的濃度（0.01 mg/L），這表明梭子蟹幼蟹對(duì)Cu2+耐受性較高，因此筆者建議在商品蟹的檢測(cè)中應(yīng)特別注意Cu2+的含量。

表4 我國主養(yǎng)蝦蟹類對(duì)Cu2+、Zn2+的96 h質(zhì)量安全濃度Tab.4 The safety concentrations of Cu2+and Zn2+of foremost cultivation shrimp and crabs in China

3.3 Cu2+、Zn2+對(duì)梭子蟹幼蟹的聯(lián)合毒性效應(yīng)機(jī)理的初步探討

本研究在設(shè)定的質(zhì)量濃度配比與時(shí)間范圍內(nèi)，Cu2+、Zn2+對(duì)梭子蟹幼蟹的聯(lián)合作用效果會(huì)隨著毒性強(qiáng)度的配比不同而改變，具體表現(xiàn)為低毒性強(qiáng)度的Cu2+對(duì)Zn2+具有拮抗作用，而低毒性強(qiáng)度的Zn2+對(duì)Cu2+具有協(xié)同作用。這可能是Cu2+、Zn2+共同作用改變了單一重金屬離子對(duì)機(jī)體的毒性作用機(jī)制，使細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，導(dǎo)致重金屬離子進(jìn)入細(xì)胞的難易程度發(fā)生改變[16]。同時(shí)，作為水生生物機(jī)體重要解毒組分金屬硫蛋白與不同重金屬離子的鰲合性存在差異，一般毒性較強(qiáng)的重金屬會(huì)先和金屬硫蛋白結(jié)合[17]。所以，當(dāng)Cu2+、Zn2+同時(shí)存在時(shí)，機(jī)體中的金屬硫蛋白鰲合物的合成速率受到影響；當(dāng)金屬硫蛋白鰲合物達(dá)到飽和，重金屬離子對(duì)機(jī)體的毒害作用將顯著增強(qiáng)，即當(dāng)Cu2+毒性強(qiáng)度為0.2時(shí)，金屬硫蛋白鰲合物未能飽和度，致使需要部分Zn2+參與形成螯合物而消除了毒性，表現(xiàn)為低濃度的Cu2+對(duì)Zn2+的拮抗作用；而當(dāng)Cu2+與MT結(jié)合達(dá)到飽和會(huì)和Zn2+一起表現(xiàn)毒性，并且較之前的毒性更強(qiáng)，表現(xiàn)為低毒性強(qiáng)度的Zn2+對(duì)Cu2+的協(xié)同作用；而當(dāng)Cu2+、Zn2+毒性強(qiáng)度相近時(shí)，表現(xiàn)為相互獨(dú)立作用。但是，由于實(shí)驗(yàn)中的各種因素，如生物、環(huán)境以及毒性強(qiáng)度配比設(shè)計(jì)等都會(huì)對(duì)聯(lián)合毒性的結(jié)果產(chǎn)生影響，所以，有關(guān)Cu2+、Zn2+對(duì)梭子蟹幼蟹的聯(lián)合毒性作用機(jī)理還需進(jìn)一步開展研究。

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Acute Toxicity of Cu2+,Zn2+to Juveniles of Portunus trituberculatus

SU Zhi-xing1,HE Jie2,XU Wen-jun1,et al
(1.School of Fisheries of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022;2.Marine and Fishery Research Intitute of Zhejiang Ocean University,Marine and Fisheries Research Institute of Zhejiang Province,Zhoushan 316021,China)

Portunus trituberculatus juveniles with body weight of 15.3±1.2 g have been chosen as the subjectsof our experiment which were exposed to heavy metalions(Cu2+,Zn2+)to investigate the influences of acute toxicity and joint toxicity by using stagnophile test method.The results showed that the median lethal concentrations(LC50)of Cu2+,Zn2+for 96 h to juveniles of P.trituberculatus was 3.934 mg/L and 3.901 mg/L respectively,and the safety concentrations(SC)of Cu2+,Zn2+for 96 h was 0.039 34 mg/L and 0.039 01 mg/L,respectively.The results of the joint toxicity experiment showed that the joint toxicity at 96 h by the pairs of Cu2+-Zn2+was found complicated in relation to the concentration,low intensity Cu2+and high intensity Zn2+were antagonism,low intensity Zn2+and high intensity Cu2+were synergism and same intensity of Cu2+and Zn2+showed absolute effect.

Cu2+;Zn2+;actute toxicity;joint toxicity;Portunus trituberculatus;juveniles

S912

A

2096-4730(2017)04-0302-06

2017-03-30

浙江省科技廳計(jì)劃項(xiàng)目（2016F50042；2015F30003）；舟山市科技項(xiàng)目（2017C43032）；浙江海洋大學(xué)博士啟動(dòng)基金（22135010815）

蘇志星(1991-)，男，安徽安慶人，碩士研究生，研究方向：蟹類健康養(yǎng)殖.E-mail：zxsu1991@hotmail.com

許文軍(1971-)，男，教授，研究方向：海水健康養(yǎng)殖.E-mail：wjxu1971@hotmail.com.