來自兩個(gè)世界的最佳高效的液相色譜分析方法

文/Isabelle Mller

來自兩個(gè)世界的最佳高效的液相色譜分析方法

將HPLC高效液相色譜操作方法轉(zhuǎn)移至UHPLC超高效液相色譜技術(shù)中實(shí)現(xiàn)更高效檢測。在科學(xué)研究及質(zhì)量控制之間，往往需要交替使用HPLC高效液相色譜峰和UHPLC超高效液相色譜法兩種不同的實(shí)驗(yàn)分析技術(shù)方法?，F(xiàn)代化的HPLC實(shí)驗(yàn)分析設(shè)備和軟件工具同樣支持實(shí)驗(yàn)員在其他系統(tǒng)中采用HPLC法。

圖1 以頭孢菌類抗生素為例：簡單的將HPLC檢測分析方法轉(zhuǎn)換到UHPLC時(shí)出現(xiàn)的問題

在醫(yī)藥產(chǎn)品、食品生產(chǎn)及其他不同生產(chǎn)領(lǐng)域之中，高效液相色譜技術(shù)越來越廣泛應(yīng)用于細(xì)胞連接或雜質(zhì)定性、定量分析。隨著實(shí)驗(yàn)室工作量增加及實(shí)驗(yàn)室工作效率提高，超高效液相色譜分析技術(shù)UHPLC同樣出現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室日常工作中。

這兩種實(shí)驗(yàn)分析技術(shù)區(qū)別在于使用的最大系統(tǒng)壓力不同，在提高了UHPLC超高效液相色譜系統(tǒng)元器件的高壓穩(wěn)定性后，相似的分離性能下，超高效液相色譜技術(shù)所需時(shí)間更短。該高端設(shè)備首先需要在研究與開發(fā)項(xiàng)目中使用，以便能夠更快找到新的實(shí)驗(yàn)分析方法。在醫(yī)療實(shí)驗(yàn)分析過程中，超高效液相色譜技術(shù)同樣得以應(yīng)用：通過快速的實(shí)驗(yàn)分析時(shí)間，提高樣本檢驗(yàn)率和儀器設(shè)備利用率。

在許多常規(guī)分析領(lǐng)域中則相反，例如，質(zhì)量監(jiān)控和質(zhì)量保證中使用的仍然是普通高效液相色譜技術(shù)HPLC；因?yàn)樗鼒?jiān)固耐用、維護(hù)保養(yǎng)成本低。在具有高效和超高效兩種液相色譜分析系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室中出現(xiàn)兩種新情況：一種是將HPLC高效液相色譜技術(shù)方法移植到UHPLC超高效液相色譜技術(shù)中去，以便提高工作效率；另一種，是將UPHLC超高效液相色譜技術(shù)分析方法移植到更加穩(wěn)定的HPLC高效液相色譜法中。

然而，不同系統(tǒng)之間檢測分析技術(shù)方法的相互移植不僅是簡單縮短分析時(shí)間，而且它們的工作參數(shù)，例如，液相流動(dòng)流速、色譜流出曲線和所用色譜柱尺寸必須加以改進(jìn)。將某一生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的液相色譜系統(tǒng)檢測分析方法移植到另一生產(chǎn)廠家系統(tǒng)中使用情況類似。如果檢測分析方法移植不成功，則可能是洗脫順序、分辨率和相對保留數(shù)據(jù)有差異——使檢測分析結(jié)果沒不具可比性（參見圖1）。

色譜柱尺寸和實(shí)驗(yàn)分析條件

從HPLC切換到UHPLC時(shí)最明顯的變化是重新選擇合適的UHPLC色譜柱。UHPLC色譜柱更短、色譜柱內(nèi)徑更細(xì)、分離顆粒物更小，色譜柱尺寸規(guī)格合適后仍需注意檢測分析時(shí)的分離條件。在HPLC高效液相色譜技術(shù)中優(yōu)化了的分析參數(shù)在UHPLC超高效液相色譜分析方法中使用受限；同樣，在UHPLC超高效液相色譜分析技術(shù)中的最佳參數(shù)不是HPLC高效液相色譜分析技術(shù)中的最佳參數(shù)。

不同系統(tǒng)檢測分析方法需要注意的參數(shù)

液相流動(dòng)流速；

色譜流出曲線（梯度、進(jìn)樣閥和事件電路）；

系統(tǒng)死體積；

探測器數(shù)據(jù)采集流速；

注入量；

系統(tǒng)最大壓力；

在梯度分析時(shí)，必須調(diào)整色譜流出曲線。如果僅縮短檢測分析時(shí)間而沒有調(diào)整色譜流出曲線，則分離結(jié)果會(huì)有巨大差異。在規(guī)范檢測分析環(huán)境中常對相對保留時(shí)間和洗脫順序另行規(guī)定。因此，在成功檢測分析方法移植中必須強(qiáng)制對色譜流出曲線做出調(diào)整匹配。

人工手動(dòng)移植檢測分析方法，包括：對所有相關(guān)參數(shù)進(jìn)行調(diào)整，非常復(fù)雜，需要消耗大量時(shí)間。為避免這些問題，有些液相色譜系統(tǒng)的生產(chǎn)廠家提供成功的移植檢測分析方法時(shí)所需的參數(shù)換算程序，有些甚至提供了UHPLC系統(tǒng)專用的轉(zhuǎn)換接口。

本刊提示：方法轉(zhuǎn)換

檢測分析方法的轉(zhuǎn)換具有很多方面原因，不是轉(zhuǎn)換至UHPLC超高效液相色譜法中來縮短檢測分析時(shí)間就是轉(zhuǎn)換至HPLC高效液相色譜法中得以保證檢測分析結(jié)果具有更高的穩(wěn)定性。兩種方法轉(zhuǎn)換至人工手動(dòng)調(diào)整、設(shè)置參數(shù)非常耗費(fèi)時(shí)間和精力。利用軟件工具將現(xiàn)有檢測分析方法轉(zhuǎn)換至UHPLC系統(tǒng)中則是一種易于使用操作、節(jié)約時(shí)間而且參數(shù)換算可靠的可替代解決方案。利用專用復(fù)合式系統(tǒng)，例如，將UHPLC和HPLC合二為一的Nexera-iMT系統(tǒng)，從而省去兩套系統(tǒng)各自獨(dú)立認(rèn)證鑒定費(fèi)用，可以舒適、方便的在HPLC和UHPLC之間進(jìn)行雙向轉(zhuǎn)換。

圖2 Lab Solutions軟件中的方法轉(zhuǎn)換工具

可靠的雙向移植

例如，配用Lab Solutions軟件，由Shimadzu公司研發(fā)生產(chǎn)的Nexera-i MT色譜系統(tǒng)就是能夠?qū)崿F(xiàn)UHPLC系統(tǒng)轉(zhuǎn)換的綜合系統(tǒng)；其配用軟件適用于HPLC和UHPLC雙向轉(zhuǎn)換時(shí)的分析條件換算。該系統(tǒng)具有兩套單獨(dú)的液相流動(dòng)管道，一套用于HPLC，另一套用于UHPLC，兩套液相管道可以無縫彼此進(jìn)行交換。

通過將HPLC與UHPLC在一臺(tái)設(shè)備中進(jìn)行組合可以為用戶帶來諸多便利。首先，兩種檢測分析方法的轉(zhuǎn)換是在一套檢測分析儀上完成，一套設(shè)備替代了原來的兩套設(shè)備。同樣減少了實(shí)驗(yàn)室的面積占用、減少維護(hù)保養(yǎng)工作量。另外，還可以通過不同的配套輔具對系統(tǒng)容量進(jìn)行匹配，從而可以在不同生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的色譜儀之間通過死容積調(diào)整匹配的方式實(shí)現(xiàn)不同檢測分析方法的轉(zhuǎn)換。

圖3 頭孢類抗生素分析時(shí)從HPLC轉(zhuǎn)換到UHPLC時(shí)的最佳參數(shù)

圖4 磺胺類藥物分析從UHPLC變換到HPLC時(shí)的最佳參數(shù)

Lab Solutions軟件可以利用系統(tǒng)內(nèi)置轉(zhuǎn)換工具（參見圖2）完成不同UHPLC系統(tǒng)檢測分析方法轉(zhuǎn)換時(shí)的參數(shù)換算。開啟目前所用的HPLC或UHPLC檢測分析所用方法后，只需輸入老的和新的色譜柱尺寸以及希望的流速即可。其他參數(shù)由軟件自動(dòng)計(jì)算，軟件系統(tǒng)計(jì)算出來的結(jié)果可直接保存到新的檢測分析方法之中去，無需人工手動(dòng)輸入新的參數(shù)。

檢測分析方法轉(zhuǎn)換實(shí)例

頭孢菌類抗生素的快速分析：頭孢菌素是口服或注射給藥的β-內(nèi)酰胺類抗生素。首先利用HPLC高效液相色譜技術(shù)分離出11個(gè)頭孢。在檢測分析方法轉(zhuǎn)換工具的幫助下，確定UHPLC超高效液相色譜分析時(shí)的參數(shù)。圖3所示是兩種方法得到的色譜圖及相應(yīng)的洗脫分離條件。通過HPLC和UHPLC之間的方法轉(zhuǎn)換，在洗脫圖形幾乎完全一致的情況下，洗脫時(shí)間縮短三倍。利用HPLC高效液相色譜技術(shù)分析一份樣本時(shí)需要65分鐘時(shí)間，利用UHPLC則只需要17分鐘即可完全獲得具有可比性的洗脫結(jié)果。

磺胺類藥物的常規(guī)分析：磺胺類藥物由合成抗菌素和抗感染藥物組成。在檢測分析過程中，需要從UHPLC超高效液相色譜法轉(zhuǎn)換至HPLC高效液相色譜法中。運(yùn)用UHPLC方法生產(chǎn)的磺胺類物質(zhì)洗脫分離將在方法轉(zhuǎn)換工具軟件的幫助下進(jìn)行換算、確定出新的HPLC洗脫分離所需色譜柱尺寸。圖4所示是兩種檢測分析方法色譜圖及相應(yīng)的檢測分析條件。通過改用長度更長的色譜圖便能將洗脫分離時(shí)間延長到20分鐘左右，不再是UHPLC超高效液相色譜洗脫時(shí)的5分鐘，但得到的分離結(jié)果幾乎完全一致。

本文作者系杜伊斯堡市Shimadzu德國有限責(zé)任公司的工作人員。