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    微觀世界的可視化顯微鏡發(fā)展的歷史征程

    2018-01-02 08:39:57IlkaOttleben
    實驗與分析 2017年3期
    關(guān)鍵詞:電子顯微鏡蔡司顯微鏡

    文/ Ilka Ottleben

    微觀世界的可視化顯微鏡發(fā)展的歷史征程

    文/ Ilka Ottleben

    圖1 從這里開始——19世紀耶拿光學(xué)儀器生產(chǎn)作坊

    19世紀中葉,德國耶拿市——一座被歌德先生恭恭敬敬稱之為“科學(xué)堆建而成的城市”,主要由科研機構(gòu)、大學(xué)和與科學(xué)技術(shù)相關(guān)的生產(chǎn)作坊構(gòu)成。那一時期,科學(xué)和醫(yī)學(xué)突飛猛進,科研人員開始理解生物有機體的基本結(jié)構(gòu),“細胞”這一專業(yè)術(shù)語的含義越來越多。

    在這樣的環(huán)境中,30歲的卡爾·蔡司先生(1816年至1888年)于1846年11月17日在耶拿市Neugasse街7號開設(shè)一間從事精密機械和光學(xué)儀器的生產(chǎn)作坊——也是具有170多年歷史蔡司公司的搖籃和奠基石。

    探索微觀世界

    顯微鏡的歷史可以追溯至17世紀中葉,這一悠久歷史告訴我們:人的本性就是要不斷探索微觀世界。19世紀初,一種博得達官貴人更多歡樂的小玩意變成科學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究中的重要利器,凸顯其在科研領(lǐng)域中的重要性。1847年,卡爾?蔡司聽取從前他老師、植物學(xué)家和細胞理論奠基人之一的Mattias Jacob Schkeiden先生(1804~1881)的建議開始生產(chǎn)制造簡單但很精確的顯微鏡。由于他的勤奮和努力使他很快小有名氣,紛至沓來的訂單和需求同樣證實他當初的決定完全正確。將顯微鏡疊放在一起能夠?qū)崿F(xiàn)較大的放大倍數(shù)。為了在競爭中不輸給競爭對手,蔡司先生于1857年開始制造復(fù)合顯微鏡——Stativ I成為這家公司的技術(shù)里程碑。

    當時獲取顯微鏡鏡頭非常麻煩:典型的鏡頭選配方法就是要將不同無色透明鏡片進行分組“適配”,通過不同的鏡頭組合選配尋找到最佳的一組,這完全破壞了顯微鏡的生產(chǎn)穩(wěn)定性,也不利于提高顯微鏡的光學(xué)質(zhì)量。認識到需要在堅實的科學(xué)基礎(chǔ)之上制造顯微鏡是卡爾·蔡司的基本功績之一。在顯微鏡的研發(fā)過程中與科學(xué)家們密切合作是卡爾·蔡司一個具有里程碑意義的決定,也是公司發(fā)展的基本原則之一,他與耶拿大學(xué)物理學(xué)講師Ernst Carl Abbe先生(1840年至1905年)進行了多年富有成效的合作。1866年,蔡司先生首先聘請他擔任公司的科研人員,從1876年起成為企業(yè)的隱名股東。

    早期的開路先鋒

    Abbe先生于1860年年底在蔡司公司完成光學(xué)系統(tǒng)計算,成果具有開創(chuàng)性,同樣奠定了顯微圖像理論——阿貝成像原理基礎(chǔ)。阿貝分辨率極限定理告訴我們:能夠被光學(xué)分辨的兩點間的距離總是大于波長的一半。他在自己的一系列試驗中發(fā)現(xiàn)了能夠圍繞光軸形成清晰圖像的(阿貝)正弦條件,并提出了數(shù)值孔徑(N.A.)的概念。

    他根據(jù)這些研究認識得出結(jié)論:在最佳條件下,通過使用紫外光和1.4數(shù)值孔徑光學(xué)顯微鏡理論上能夠?qū)崿F(xiàn)的分辨率為0.2 μm。

    從1872年開始,蔡司公司開始生產(chǎn)制造基于科學(xué)計算基礎(chǔ)的光學(xué)顯微鏡——明顯具有更好的光學(xué)性能。1877年,公司生產(chǎn)出第一臺油浸物鏡光學(xué)顯微鏡,奠定了當前幾乎所有的實驗室用油浸物鏡顯微鏡基礎(chǔ),明顯提供更高的檢測分辨率。

    從那時起,Ernst Abbe先生便有能力計算顯微鏡數(shù)據(jù)、避免重要的數(shù)據(jù)錯誤。根據(jù)他掌握的知識:光學(xué)鏡頭的質(zhì)量限制顯微鏡應(yīng)用。年輕化學(xué)家Otto Schott先生(1851年至1935年)發(fā)明出一種適用于制造光學(xué)鏡頭的新玻璃同樣證明了該事實。他們一起于1882年在耶拿成立了玻璃技術(shù)實驗室。隨后的工作就是生產(chǎn)制造質(zhì)地均勻、尺寸準確、具有良好光學(xué)性能的玻璃鏡頭。1886年,面目全新的、采用復(fù)消色差物鏡的顯微鏡首次上市,這是一塊堅實的里程碑。

    科研先鋒

    光學(xué)理論基礎(chǔ)知識不僅保證蔡司公司在技術(shù)上明顯優(yōu)于競爭對手,而且在自然科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有開創(chuàng)性突破。Robert Koch先生于1880年發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核和霍亂病原體并因此獲得1905年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎。他在1804年寫給卡爾·蔡司的一封信中表明:“我對自己在科學(xué)研究領(lǐng)域中所獲得的成就向您表示感謝,您發(fā)明的出色顯微鏡功不可沒。”

    在隨后的1906年里,西班牙的神經(jīng)科學(xué)和組織學(xué)家Ramon Y Cajal與Camillo Golgi同樣因他們在物理學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中對神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和精細的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)明所做貢獻獲得諾貝爾獎。在他們的科研工作中,Cajal先生使用的就是蔡司公司生產(chǎn)的顯微鏡。時至今日,已經(jīng)有超過30名的諾貝爾獎獲得者使用的是蔡司公司的技術(shù)產(chǎn)品。

    以科研和工業(yè)化生產(chǎn)密切合作為基礎(chǔ),以研究微觀世界、打破人類肉眼視覺界限為目標進一步推動科學(xué)技術(shù)發(fā)展是蔡司公司締造者蔡司先生和Abbe先生在企業(yè)搖籃時期定下的原則。1889年,在Abbe先生逝世一周年后,該原則同樣寫入了蔡司先生創(chuàng)立的卡爾·蔡司基金會章程中;1891年,他又將自己的資產(chǎn)捐給光學(xué)儀器生產(chǎn)廠和耶拿玻璃廠;為耶拿大學(xué)的科學(xué)研究提供幫助。時至今日,蔡司股份公司每年都拿出一定的股息投入到卡爾·蔡司基金會去,促進科研和教學(xué)。

    日益增加的多樣性

    19世紀末,顯微鏡已不再只是科學(xué)研究中的重要工具,它同樣發(fā)展成為醫(yī)療、衛(wèi)生和材料檢驗日常工作中的常規(guī)儀器設(shè)備。1884年第一家成立于英國倫敦的分公司標志著蔡司公司全球擴張的開始。

    1896年,蔡司公司應(yīng)美國昆蟲學(xué)家Horatio S. Greenough先生要求設(shè)計制造第一臺立體顯微鏡。從這一年起,蔡司公司開始按照用戶需求生產(chǎn)制造量身定制的專用顯微鏡,從中學(xué)到的知識和技術(shù)被應(yīng)用于其他產(chǎn)品的設(shè)計與生產(chǎn)之中,例如,用于望遠鏡、攝影鏡頭、天文學(xué)儀器設(shè)備、分光儀或大地測量儀器設(shè)備中,為企業(yè)開辟新的經(jīng)營領(lǐng)域。

    1904年, 由 August K?hler先 生和Mortz von Roht先生發(fā)明的紫外線顯微鏡和由K?hler先生安裝制造、Henry Siedentopf先生1908年改進完善的熒光顯微鏡進一步擴大光學(xué)顯微鏡的可利用光源。

    第一次世界大戰(zhàn)暫時中斷了“民用儀器設(shè)備”的研發(fā)工作,到1933年,著名的L-Stativ成為顯微鏡中的典范。在蔡司公司發(fā)展的歷史長河中,德國的分裂和統(tǒng)一是公司發(fā)展過程中兩個重要歷史時期。

    位相襯度的發(fā)明

    在光學(xué)顯微鏡技術(shù)領(lǐng)域中,眾所周知的阿貝分辨率極限為0.2微米。典型的動物細胞直徑在10-20微米之間,比肉眼可見的最小微粒小五倍,但卻能夠被光學(xué)顯微鏡分辨出來??辞鍎游锛毎Y(jié)構(gòu)并了解各種細胞組成部分的功能更加困難,再加上動物細胞無色、透明,幾乎不吸收任何光線,細胞學(xué)家擔心:通過細胞固定與染色可能會改變細胞的組成(和功能)或使其丟失。從細胞生物學(xué)的角度出發(fā)追溯顯微鏡的發(fā)展歷史可以快速了解:科學(xué)技術(shù)的進步曾經(jīng)依靠的是新對比法,而不是新輻射源發(fā)展。

    這些恰恰是蔡司公司需要解決的問題:在透明物體高對比度檢測技術(shù)的突破中與荷蘭物理學(xué)家Fritz Zernike先生合作開發(fā)具有極大幫助。Zernike先生在1930年利用反射式衍射光柵進行工作時發(fā)現(xiàn):可觀測到單獨光束的相位位置。為在顯微鏡中能夠利用該效應(yīng),他與蔡司公司合作開發(fā)出第一臺相襯顯微鏡:1936年誕生第一臺樣機。利用該種相襯顯微鏡可以觀察活體細胞,不會因染色使細胞受損。

    需要自動化

    顯微鏡用戶的最大問題是什么?蔡司公司怎樣才能幫助用戶解決他們遇到的難題?早在20世紀30年代,相機便能簡化顯微圖像定影和文字記錄,該技術(shù)進步能夠?qū)⒂脩魪姆爆嵉?、非常不準確的顯微圖像縮寫簽字中解放出來。隨著技術(shù)的不斷進步,電子產(chǎn)品憑借其先進的功能進一步實現(xiàn)顯微檢測技術(shù)領(lǐng)域中的自動化。1955年,集成有攝像頭和自動照明控制的全新攝影顯微鏡問世。

    電子時代

    在電子時代,蔡司公司與電子技術(shù)企業(yè)密切合作,利用不同形式的光源生成圖像,對蔡司公司的產(chǎn)品進行多樣化產(chǎn)品改進。為保留細胞生物學(xué)中的圖片,需要配備一臺高分辨率顯微鏡拍攝出清晰細胞結(jié)構(gòu)圖片。由Abbe先生發(fā)現(xiàn)的入射光分辨率極限和波長之間的關(guān)系定理適用于各種輻射形式。因此,使用該電子顯微技術(shù)后,分辨率極限可以很小、分辨能力會大幅度提高。粗略的說,電子顯微鏡的分辨率是光學(xué)顯微鏡的100倍,極大增加了所提供信息量深度。

    1940年開始,蔡司公司與ARG公司合作進入電子顯微鏡領(lǐng)域。電子顯微鏡研發(fā)中遇到的挑戰(zhàn)是:電子透鏡錯誤比光學(xué)玻璃透鏡難解決。1949年,蔡司公司推出第一臺EM8靜態(tài)校正透射型電子顯微鏡TEM,同樣奠定蔡司公司研發(fā)生產(chǎn)電子顯微鏡的基石。

    1956年后,陸續(xù)推出的EM9型電子顯微鏡是世界上第一臺具有自動曝光控制的電磁式透射電子顯微鏡TEM。

    1984年,蔡司公司又在市場上推出EM 902型配用Castaing-Henry過濾器商用電子顯微鏡。用戶利用該種新產(chǎn)品能夠得到高分辨率元素分布圖片。

    本刊提示:多束電子顯微鏡

    運用蔡司公司MultiSEM技術(shù)的顯微鏡工作時,具有多束平行電子射線(綠色:照明光束路徑)和探測光束。微調(diào)檢測路徑(紅色)為大量二次離子,每條光束都能同步掃描被測樣本的同一位置并形成各自的識別圖像。發(fā)射的電子束呈六邊形圖案,整個圖像由所有圖塊組成。為快速記錄數(shù)據(jù)采取平行計算機配置,從而提高圖像處理速度,圖像采集和工作流程控制完全分開。

    圖2 蔡司公司的Zeiss LSM顯微鏡——迄今為止市場中技術(shù)最領(lǐng)先的共聚焦激光掃描顯微鏡

    1993年,配用靜電電磁物鏡(Gemini技術(shù))的場發(fā)射掃描電子顯微鏡DSM 982 Gemini投放市場。

    蔡司公司2007年推出的Orion顯微鏡實際上是一個顯微系統(tǒng):被測樣本在氦離子的掃描下,而不是在電子掃描下顯微觀測,因此,具有更高分辨率和更高對比度,這是氦離子顯微鏡首次在市場上亮相。同年出現(xiàn)的、采用了Crisp系統(tǒng)的TEM透射式電子顯微鏡是當時全球唯一具有原子水平成像能力的顯微系統(tǒng)。

    在當代的電子顯微鏡中,最新型的蔡司MultiSEM 505型電子顯微鏡(參見本刊提示)是全球第一臺具有61條平行射線、4納米像素點、每秒鐘拍攝速度1220百萬像素的電子顯微鏡,這在腦科學(xué)家研究神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)時十分有用。過去需要幾年時間才能完成的大量樣本檢驗分析能夠快速完成檢測分析。

    從2013年起,蔡司公司同樣介入到X射線顯微技術(shù)領(lǐng)域產(chǎn)品研發(fā)并提供Versa系列具有亞微米級高分辨率的三維X射線顯微鏡。

    空間立體顯微技術(shù)

    對較大、較厚樣本檢查分析的要求是光學(xué)顯微鏡領(lǐng)域進一步研發(fā)需要解決的重點問題。很長時間以來,在利用光學(xué)顯微鏡對該類樣本進行顯微檢測時需要將其切成薄片。將它們切成薄片時,樣本的空間立體結(jié)構(gòu)信息隨之丟失。

    1982年,蔡司公司推出LSM共聚焦激光掃描顯微鏡,利用振蕩激光束和電子圖像處理進行物體掃描,成為市場中金牌產(chǎn)品。共聚焦激光束允許使用很小量的光對聚焦點進行探測,從而生成高對比度光學(xué)圖片:很窄的光束照射在聚焦層上,可以避免熒光帶來的影像模糊問題、不必再將樣本切成薄片;另一方面,可以從多個光學(xué)視角拆解較厚、較大檢測樣本。按照此種方法,可以得到被測樣本完整的立體信息,利用相應(yīng)的計算機軟件可以得到樣本的空間圖像。計算機技術(shù)和激光技術(shù)的發(fā)展非常迅速,如今的激光掃描顯微鏡系統(tǒng)已經(jīng)具備更多功能,例如,可以完成樣本線性掃描或細胞結(jié)構(gòu)的激光掃描。

    圖3 耶拿蔡司天文館航拍照片

    圖4 蔡司細胞發(fā)現(xiàn)者Celldiscoverer7型全自動校準顯微鏡光學(xué)設(shè)計,確??蒲腥藛T在較長時間窗口內(nèi)的科研實驗具有較高質(zhì)量圖像和重復(fù)再現(xiàn)性能

    突破限制極限

    在熒光顯微鏡中,損失活細胞、組織或生物體毒性、漂白效應(yīng)以及所得信息是用戶亟待解決的一大難題。在生理條件下,研究人員對活體樣本觀察時間越長,所能獲取的活細胞、活組織信息量越多,因此,能夠?qū)⒐庳摵蓽p少到最低程度的成像系統(tǒng)市場急需。蔡司公司最新的代表產(chǎn)品Lightheet Z.1型激光片層掃描顯微鏡將熒光激發(fā)和熒光探測分為兩個獨立的光路,而且,激發(fā)光軸和探測光軸之間的夾角垂直,每次只照亮樣本很薄的一點區(qū)域。該系統(tǒng)能夠柔和切割大型樣本,在很小的光負荷和較高的時間分辨率情況下完成樣本的檢測分析,利用該系統(tǒng)可以在30天時間里對活體對象從不同角度進行三維觀測。

    當然,需要解決的最大問題是分辨率,阿貝分辨率極限原理妨礙進一步提高顯微鏡分辨率。2006年,Eric Betzing先生和他的同事發(fā)明了光激活定位顯微技術(shù)PALM,利用光對熒光照射各個細胞的開關(guān)控制規(guī)避阿貝分辨率極限,實現(xiàn)低于磁限200nm約10倍的分辨率。超高分辨率研究工作于2014年和Stefan W. Hell與William E. Moerner先生一起獲得諾貝爾化學(xué)獎。蔡司公司收購PALM光激活定位顯微技術(shù)的獨家授權(quán),采用該技術(shù)的Elyra PS.1超高分辨率顯微鏡系統(tǒng)實現(xiàn)單分子定位。

    所有技術(shù)發(fā)展從上世紀90年代開始伴隨數(shù)字化一步步發(fā)展起來,在現(xiàn)如今的許多領(lǐng)域中,已完全實現(xiàn)數(shù)字化。顯微鏡也將發(fā)展成為具有圖像采集、數(shù)據(jù)處理和數(shù)據(jù)存儲等功能全新的成像工作站。

    走向未來

    新的電子顯微技術(shù)和離子顯微技術(shù)提供了迄今為止從未有過的分辨率和數(shù)據(jù)質(zhì)量,從而打開了認識新世紀的大門。再加上純圖像處理技術(shù)之外的其它功能,例如,F(xiàn)IB-SEM聚焦離子束——電子束雙束顯微鏡。蔡司公司的Zeiss Crossbeam,能夠完成在半導(dǎo)體領(lǐng)域、電子技術(shù)領(lǐng)域或者電動汽車制造領(lǐng)域中許多新型表面材料結(jié)構(gòu)和納米材料結(jié)構(gòu)的檢測分析。

    如今的顯微系統(tǒng)在越來越短的時間里能夠產(chǎn)生越來越多的3D和4D數(shù)據(jù),在較高程度上平行進行圖像采集和處理,具有明顯更高的數(shù)據(jù)處理能力。最新的技術(shù),例如,蔡司公司最新的LSM 800以及LSM 880中使用的Airyscan超分辨率技術(shù)具有最高的圖像采集和掃描速度,而且,在常規(guī)檢測分析應(yīng)用中,顯微鏡的自動化趨勢同樣與日俱增——蔡司公司當前最先進的、所謂“Box—顯微鏡”所代表的技術(shù)體現(xiàn)于蔡司公司的細胞發(fā)現(xiàn)者Celldiscoverer 7型顯微鏡中(參見圖4)。該系統(tǒng)達到了較高的自動化程度,卻也不失傳統(tǒng)、活細胞倒置顯微研究,所有的科研顯微鏡圖像質(zhì)量和使用靈活性。

    在光學(xué)、電子、離子和X射線顯微技術(shù)中所出現(xiàn)的新技術(shù)能夠讓科研人員越來越多的了解被測樣本。填補這些技術(shù)之間的漏洞、將這些技術(shù)有機的結(jié)合在一起是今后幾年顯微技術(shù)領(lǐng)域中需要解決問題。根據(jù)結(jié)構(gòu)的相關(guān)性、按照結(jié)構(gòu)尋找不同的長度劃分——有點像俗話海底撈針所描述的難度,能夠明顯加快實驗分析的顯微檢驗速度或能夠?qū)⒐δ芟嚓P(guān)的特定結(jié)構(gòu)組成新的特殊功能,這些都將會進一步加快科學(xué)研究的速度,也肯定會再次突破顯微檢測分辨率極限。

    也許阿貝先生已經(jīng)考慮到這些問題,因為,他曾說過:“除了名字以外,未來的顯微鏡會與如今的有所不同?!?/p>

    本文作者系報刊雜志編輯。

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