納米孔DNA測(cè)序?qū)＠夹g(shù)綜述

馬妍妍

（國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作四川中心，四川 成都 610000）

納米孔DNA測(cè)序?qū)＠夹g(shù)綜述

馬妍妍

（國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作四川中心，四川 成都 610000）

基于CNABS和DWPI數(shù)據(jù)庫(kù)，通過檢索、統(tǒng)計(jì)和分析國(guó)內(nèi)外有關(guān)納米孔DNA測(cè)序的專利申請(qǐng)，對(duì)該領(lǐng)域申請(qǐng)量趨勢(shì)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，梳理了納米孔DNA測(cè)序領(lǐng)域的技術(shù)發(fā)展歷程，同時(shí)，對(duì)納米孔DNA測(cè)序領(lǐng)域的核心專利和重要申請(qǐng)人進(jìn)行分析，以期為國(guó)內(nèi)相關(guān)企業(yè)的發(fā)展提供參考。

納米孔；測(cè)序；核心專利；技術(shù)發(fā)展

引言

基因測(cè)序技術(shù)是對(duì)DNA進(jìn)行分析、檢測(cè)的技術(shù)，在產(chǎn)前篩查和診斷，以及多種疾病的診斷、預(yù)測(cè)、預(yù)防干預(yù)等方面具有重要意義。從測(cè)序技術(shù)的發(fā)展演變來看，基因測(cè)序技術(shù)主要經(jīng)歷了4代：基于1975年Sanger和Coulson發(fā)明的脫氧終止法的測(cè)序原理的第一代基因測(cè)序技術(shù)，到以新型的固態(tài)納米孔單分子測(cè)序?yàn)樘攸c(diǎn)的第四代基因測(cè)序，目前,第四代基因測(cè)序技術(shù)正處在研究熱潮。納米孔DNA測(cè)序技術(shù)借助電泳驅(qū)動(dòng)單個(gè)分子逐個(gè)穿過納米孔來進(jìn)行測(cè)序。與傳統(tǒng)的基因測(cè)序技術(shù)相比，納米孔DNA測(cè)序技術(shù)具有低成本、高讀長(zhǎng)、小型化、易集成等優(yōu)勢(shì)，近年來發(fā)展非常迅速。為了解掌握納米孔DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展及產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀，從全球納米孔DNA測(cè)序技術(shù)的專利入手，研究分析納米孔DNA測(cè)序技術(shù)的專利申請(qǐng)趨勢(shì)、重要申請(qǐng)人、專利技術(shù)發(fā)展歷程等相關(guān)信息，以期為國(guó)內(nèi)相關(guān)企業(yè)提供參考。

1 納米孔DNA測(cè)序技術(shù)分支

基于CNABS、DWPI數(shù)據(jù)庫(kù)，通過分類號(hào)和關(guān)鍵詞檢索，人工去噪得到供分析的納米孔DNA測(cè)序技術(shù)專利數(shù)據(jù)樣本536篇文獻(xiàn)。通過瀏覽專利和相關(guān)非專利文獻(xiàn)，對(duì)納米孔DNA測(cè)序所涉及的技術(shù)分支進(jìn)行分解（詳見表1）。

2 全球申請(qǐng)量趨勢(shì)分析

對(duì)檢索到的納米孔DNA測(cè)序?qū)＠暾?qǐng)按申請(qǐng)年份分別統(tǒng)計(jì)申請(qǐng)量。

數(shù)據(jù)顯示（見圖1），1996年，哈佛大學(xué)的Daniel Bran?ton、加州大學(xué)的David Deamer及其同事，在PNAS雜志上首次發(fā)表文章指出，可以用膜通道檢測(cè)多核苷酸序列，讓DNA堿基一個(gè)個(gè)穿過納米孔，同時(shí)快速鑒定每個(gè)堿基。1998年加州大學(xué)和哈佛大學(xué)作為申請(qǐng)人，首次申請(qǐng)了納米孔DNA測(cè)序相關(guān)專利。然而，為致力于解決遇到的大量生產(chǎn)同樣尺寸的納米孔、DNA鏈穿過納米孔時(shí)的速度等問題，納米孔測(cè)序技術(shù)在1998年-2001年間進(jìn)入了萌芽期。

2001年，哈佛大學(xué)的Daniel Branton和Golovchenko等首次報(bào)道了使用固態(tài)納米孔來檢測(cè)DNA，在SiN薄膜中使用具有反饋控制的離子束雕刻工具制備確定尺寸的納米孔。從2002年開始，國(guó)內(nèi)外各公司、研究機(jī)構(gòu)開始對(duì)納米孔測(cè)序技術(shù)產(chǎn)生關(guān)注，相關(guān)專利申請(qǐng)進(jìn)入了發(fā)展期，2007年-2014年間，納米孔測(cè)序技術(shù)的專利申請(qǐng)迅猛增長(zhǎng)。

2014年之后的專利申請(qǐng)量急劇下降，其原因可能有兩個(gè)，其一是由于基因測(cè)序相關(guān)企業(yè)入行門檻低、市場(chǎng)比較混亂，存在巨大風(fēng)險(xiǎn)，2014年國(guó)家食藥監(jiān)管總局、國(guó)家衛(wèi)計(jì)委聯(lián)合發(fā)出通知叫停了產(chǎn)前基因檢測(cè)在內(nèi)的基因測(cè)序，可能對(duì)申請(qǐng)量造成了一定的影響。其二是由于部分專利申請(qǐng)還未公開。

圖1 全球申請(qǐng)量趨勢(shì)

3 全球重要申請(qǐng)人分析

對(duì)各申請(qǐng)人的申請(qǐng)量進(jìn)行分析，將不同公司名稱（中英文）進(jìn)行人工整合后，以申請(qǐng)量為準(zhǔn)對(duì)申請(qǐng)人進(jìn)行排名，結(jié)果顯示如圖2。

全球納米孔DNA測(cè)序技術(shù)專利申請(qǐng)量排名前20的重要申請(qǐng)人中，國(guó)際商業(yè)機(jī)器公司（IBM）作為電子計(jì)算機(jī)行業(yè)的領(lǐng)頭羊申請(qǐng)量位居第一，2007年開始涉足納米孔DNA測(cè)序領(lǐng)域。而作為納米孔DNA測(cè)序技術(shù)的始創(chuàng)者，哈佛大學(xué)和加利福尼亞大學(xué)申請(qǐng)量位居第二和第五名。此外，前20名申請(qǐng)人中，深圳華大基因科技有限公司是國(guó)內(nèi)領(lǐng)先的基因測(cè)序企業(yè)，自1990年“人類基因組計(jì)劃”啟動(dòng)至2003年，華大基因參與并完成了1%的人類基因組計(jì)劃，之后的10多年間，華大基因在利用基因檢測(cè)進(jìn)行產(chǎn)前檢測(cè)方面投入了很大的精力，其在納米孔DNA測(cè)序方面的專利申請(qǐng)也持續(xù)增長(zhǎng)，在全球申請(qǐng)量排名第九。伊魯米那（Illumina）公司作為測(cè)序領(lǐng)域的巨頭，在基因測(cè)序產(chǎn)業(yè)鏈上利潤(rùn)最大的上游設(shè)備端和耗材領(lǐng)域占有最重的市場(chǎng)份額，許多國(guó)內(nèi)基因測(cè)序企業(yè)從Illumina公司購(gòu)買基因測(cè)序設(shè)備。牛津納米孔為英國(guó)的一家基因測(cè)序公司，早在2012年，牛津納米孔公司就發(fā)布了一款U盤大小的DNA測(cè)序器，將其命名為MinION，它可以直接通過USB連接到筆記本上，使用的技術(shù)便是納米孔DNA測(cè)序技術(shù)，一個(gè)MinION有500個(gè)納米孔，可并行測(cè)序，每個(gè)孔每秒30bp，該測(cè)序器在2016年8月被NASA宇航員帶上了太空，開啟了太空基因組測(cè)序的新篇章。

在申請(qǐng)量排名前20的申請(qǐng)人中，國(guó)外申請(qǐng)人占13個(gè)，超過半數(shù)，國(guó)內(nèi)申請(qǐng)人相對(duì)較少，這反映了與國(guó)外納米孔DNA測(cè)序技術(shù)相比，國(guó)內(nèi)還存在一定的差距。而排名前20的國(guó)內(nèi)申請(qǐng)人中，申請(qǐng)量位居第一的為上海交通大學(xué)，其專利申請(qǐng)主要涉及通過電磁或光學(xué)鑷手段捕獲DNA一端的磁珠來減慢DNA穿過納米孔的速度、借助外切酶進(jìn)行測(cè)序以及制備固態(tài)納米孔方面的研究。東南大學(xué)、浙江大學(xué)、北京大學(xué)、清華大學(xué)在納米孔DNA測(cè)序領(lǐng)域研究也位居國(guó)內(nèi)申請(qǐng)人排名前七，近年來，北京大學(xué)與哈佛大學(xué)在DNA在固態(tài)納米孔中的減速方法方面有多項(xiàng)合作，這種國(guó)內(nèi)外高校的合作模式也推進(jìn)了我國(guó)納米孔DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展。

表1 納米孔DNA測(cè)序技術(shù)分支

圖2 全球申請(qǐng)人申請(qǐng)量排名

4 重要申請(qǐng)人專利技術(shù)發(fā)展及核心專利

哈佛大學(xué)和加利福尼亞大學(xué)（即加州大學(xué)）是最早提出納米孔DNA測(cè)序這一技術(shù)的申請(qǐng)者，為納米孔DNA測(cè)序領(lǐng)域的始創(chuàng)者，且二者申請(qǐng)量分別位居第二和第五，他們的后續(xù)研究也是圍繞納米孔測(cè)序在開展，其研究技術(shù)發(fā)展歷程在一定程度上反映了納米孔DNA測(cè)序領(lǐng)域的發(fā)展方向。

4.1 測(cè)序的檢測(cè)方式

測(cè)序的檢測(cè)手段經(jīng)歷了從檢測(cè)離子流阻斷、到通過光學(xué)讀取、通過橫向電子隧穿、再到通過電容檢測(cè)的發(fā)展。由哈佛大學(xué)和加利福尼亞大學(xué)合作最早提交的專利（US6746594B2，1998年）是根據(jù)離子流阻斷原理進(jìn)行DNA的納米孔直接測(cè)序。隨后的一系列專利都是關(guān)于離子流檢測(cè)的納米孔直接測(cè)序的研究。2003年加利福尼亞大學(xué)申請(qǐng)的專利（US7444053B2）和2004年哈佛大學(xué)申請(qǐng)的專利（CN101103357B）中，均使用光學(xué)手段讀取的檢測(cè)方式對(duì)DNA進(jìn)行納米孔測(cè)序，通過讀取熒光信號(hào)推測(cè)DNA的序列。橫向電子隧穿的檢測(cè)方式在哈佛大學(xué)于2005年相繼提交的專利（CN102183630A和CN101203740A）中被使用，這兩篇專利文獻(xiàn)中均使用碳納米管在納米孔處產(chǎn)生橫向偏電壓，使得DNA在穿過納米孔時(shí)速度減慢。在之后的研究中，加利福尼亞大學(xué)2013年申請(qǐng)了專利（US2015337367A1），其中，將納米孔測(cè)序儀在半導(dǎo)體基板上制作，使得微縮的多納米孔檢測(cè)設(shè)備成為可能，另外測(cè)序儀中還集成設(shè)置了復(fù)合膜片鉗電容放大器-差分放大器網(wǎng)絡(luò)，提高了檢測(cè)信噪比，通過電容檢測(cè)的方式進(jìn)行DNA測(cè)序。

4.2 測(cè)序所使用的納米孔的發(fā)展

主要經(jīng)歷了從生物蛋白質(zhì)納米孔到固態(tài)納米孔的轉(zhuǎn)變。對(duì)于生物蛋白質(zhì)納米孔而言，以α-溶血素（英文簡(jiǎn)稱α-HL）為例，α-HL蛋白是金黃色葡萄球菌分泌的分子量為232.4kDa的蛋白質(zhì)，以七聚體方式插入脂質(zhì)雙分子層中形成跨膜通道蛋白[4]，由2個(gè)主要部分組成：約2.5nm內(nèi)徑的帽子和約1.5nm內(nèi)徑的通道，后者穿過細(xì)胞膜，帽子寬約10nm，整個(gè)α-HL納米孔從帽子到通道長(zhǎng)約10nm，當(dāng)KCl濃度為1mol/L時(shí)，α-HL納米孔通道大約可容納11個(gè)K+和11個(gè)Cl-[5]。哈佛大學(xué)和加利福尼亞大學(xué)早期的研究多集中在使用生物蛋白質(zhì)納米孔來檢測(cè)核酸。而最早使用的α-HL納米孔的通道有約5nm長(zhǎng)，可同時(shí)容納約7個(gè)核苷酸，這就造成檢測(cè)的干擾，這種納米孔不能分辨通道中的7個(gè)核苷酸，其空間和時(shí)間分辨率較低。在這之后哈佛大學(xué)和加利福尼亞大學(xué)的申請(qǐng)也多集中于生物蛋白質(zhì)納米孔的測(cè)序技術(shù)，并相繼提交了使用MspA孔蛋白（WO2016053891A1）、噬菌體Phi29連接器（CN103392008A）等生物納米孔進(jìn)行測(cè)序的專利。

生物納米孔在測(cè)序方面進(jìn)展較早，但由于其自身在穩(wěn)定性、持久性等方面存在不足，難以滿足持續(xù)的大規(guī)模測(cè)序工作的需求。隨著微加工技術(shù)的不斷進(jìn)步，固態(tài)納米孔技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。固態(tài)納米孔測(cè)序原理與生物納米孔一樣，其是人造納米孔，但與生物納米孔相比，具有更優(yōu)良的性質(zhì)：一是尺寸可控；二是更好的機(jī)械強(qiáng)度、穩(wěn)定性；三是可重復(fù)使用，成本降低；四是可適應(yīng)復(fù)雜的檢測(cè)環(huán)境；五是易于與其他微型探測(cè)器和探針或分析電路集成具備單分子檢測(cè)能力的靈敏生物傳感器，其克服了生物納米孔的一系列缺點(diǎn)。1999年加利福尼亞大學(xué)提交的專利（US6617113B2）中在云母層上利用HF酸進(jìn)行濕法腐蝕得到固態(tài)納米孔，且使用這種固態(tài)納米孔區(qū)分單鏈、雙鏈核酸分子。2001年，Li等發(fā)表了關(guān)于聚焦離子束制備直徑為1.8nm納米孔的研究，之后，哈佛大學(xué)在2003年提交的專利（WO2005061373A1）中使用離子束刻蝕的方法制備納米孔用于納米孔DNA測(cè)序。2005年之后哈佛大學(xué)的納米孔DNA測(cè)序技術(shù)的專利申請(qǐng)多集中在使用固態(tài)納米孔進(jìn)行測(cè)序，2013年哈佛大學(xué)提交的專利申請(qǐng)（CN105408241A）中使用電子束刻蝕制備的固態(tài)納米孔進(jìn)行DNA測(cè)序研究。

4.3 納米孔DNA測(cè)序的技術(shù)難點(diǎn)

主要集中：在一是如何提高單堿基檢測(cè)靈敏度；二是如何減慢DNA穿孔速率這兩大方面。這兩方面又相輔相成，減慢DNA穿孔的速率則在檢測(cè)時(shí)間上有了保障，進(jìn)而便可提高單堿基的檢測(cè)靈敏度。哈佛大學(xué)2004年提交的專利申請(qǐng)（CN101103357B）借助雜交探針與靶核酸之間的相互作用來減緩納米孔穿線速度，其于2005年提交的兩項(xiàng)專利（CN102183630A和CN101203740A）均使用碳納米管與DNA分子的耦合作用減慢DNA穿過納米孔的速度。而后哈佛大學(xué)還圍繞增加檢測(cè)靈敏度進(jìn)行了研究，分別在2008年和2009年提交了兩項(xiàng)專利（WO2009/035647Al和CN102630304A），使用石墨烯納米孔進(jìn)行檢測(cè)，由于石墨烯膜很薄，其厚度小于DNA兩個(gè)堿基之間的間距，因此可提高單堿基檢測(cè)的靈敏度。此外，加利福尼亞大學(xué)于2011年申請(qǐng)的專利（CN104774757A）中使用兩個(gè)納米孔，并在兩個(gè)納米孔上施加不同的電壓，產(chǎn)生相反方向的作用力來減慢DNA穿過納米孔的速率，以期提高檢測(cè)準(zhǔn)確率。2012年申請(qǐng)的專利（CN102590314B和CN102621214B）中，哈佛大學(xué)又提出了新的手段，這兩篇專利文獻(xiàn)是與北京大學(xué)合作完成的，其中通過引入壓強(qiáng)外場(chǎng)作為電場(chǎng)的反向外場(chǎng)來減慢DNA穿孔的速率。

5 結(jié)語

基因測(cè)序領(lǐng)域自基于Sanger的脫氧終止法的第一代基因測(cè)序至今已經(jīng)歷了將近40年的發(fā)展歷程。而從專利發(fā)展的演進(jìn)來看，納米孔DNA測(cè)序技術(shù)始于1998哈佛大學(xué)和加利福尼亞大學(xué)共同提出的生物納米孔的離子流阻斷檢測(cè)，至今也經(jīng)歷了10余年的發(fā)展。縱觀納米孔DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展歷程，該技術(shù)領(lǐng)域主要圍繞納米孔的制備方法、納米孔尺寸的縮小、減緩DNA穿孔速度、提高檢測(cè)靈敏度這4方面進(jìn)行研究。通過技術(shù)綜述的梳理，便于了解上述4方面的重點(diǎn)專利技術(shù)，該領(lǐng)域的重點(diǎn)申請(qǐng)人，對(duì)國(guó)內(nèi)企業(yè)有一定的參考意義。

[1]王躍.基于納米孔和納米陣列的單分子DNA測(cè)序技術(shù)基礎(chǔ)研究，中國(guó)優(yōu)秀碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)基礎(chǔ)科學(xué)輯[C].2015，(06)：A006-7.

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Review of Patents in Nanopore DNA Sequencing

Ma Yanyan
（Patent Examination Cooperation Sichuan Center of the Patent Office,SIPO,Chengdu Sichuan 610000）

Based on the databases of CNABS and DWPI,the domestic and foreign patents of nanopore DNA se?quencing are analyzed by examination and statistics method,including the growth trend of application amount and the technique progress in the field of nanopore DNA sequencing.Furthermore,the core patents and important ap?plicants of nanopore DNA sequencing are analyzed.This paper aims to provide references for the development of re?lated domestic enterprises.

nanopore;sequencing;core patents;technique progress

Q812

A

1003-5168(2017)11-0051-04

2017-9-20

馬妍妍（1988-），女，碩士，實(shí)習(xí)研究員，研究方向：發(fā)明專利實(shí)質(zhì)審查工作。