作用于煙堿乙酰膽堿受體的新穎殺蟲(chóng)劑Flupyrimin

姜 靜，李宇森，馬鏡博，羅梁鋒，張俊峰，呂軍民，曹張軍 編譯

(1.東華大學(xué)，上海 210620；2.澄城中學(xué)，陜西省澄城縣 715200；3.陜西省澄城縣農(nóng)技中心，陜西省澄城縣715200)

作用于煙堿乙酰膽堿受體的新穎殺蟲(chóng)劑Flupyrimin

姜 靜1，李宇森2，馬鏡博2，羅梁鋒3，張俊峰3，呂軍民3，曹張軍1編譯

(1.東華大學(xué)，上海 210620；2.澄城中學(xué)，陜西省澄城縣 715200；3.陜西省澄城縣農(nóng)技中心，陜西省澄城縣715200)

煙堿乙酰膽堿受體(nAChR)是配體門(mén)控氯離子通道，快速地傳遞神經(jīng)的興奮性，是殺蟲(chóng)劑的一個(gè)重要作用靶標(biāo)。煙堿型殺蟲(chóng)劑和相關(guān)相似配體能夠與軟體動(dòng)物煙堿乙酰膽堿結(jié)合蛋白(AChBP)結(jié)合，此蛋白是煙堿乙酰膽堿受體胞外配體結(jié)合域的適合替代物，可用于用高分辨率的化學(xué)/結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法來(lái)弄明白藥物結(jié)合域的識(shí)別特性。隨后用與煙堿配體結(jié)合的位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)成功設(shè)計(jì)出具有獨(dú)特藥效團(tuán)的新穎殺蟲(chóng)化合物。

在數(shù)個(gè)世紀(jì)中，煙草提取物中的煙堿(NIC)或假木賊堿(圖1)是最易得到的防治刺吸式害蟲(chóng)的藥劑，即第一代煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑。另一方面，對(duì)不尋常結(jié)構(gòu)化合物的搜尋和已有化合物結(jié)構(gòu)的優(yōu)化成功地發(fā)現(xiàn)了新煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑(第二代)，代表物有吡蟲(chóng)啉(IMI)、啶蟲(chóng)脒(ACE)、噻蟲(chóng)胺(CLO)和呋蟲(chóng)胺。新煙堿在全球被廣泛使用，占全球殺蟲(chóng)劑市場(chǎng)的 1/4以上。目前，新穎煙堿化合物氟吡呋喃酮[flupyradifurone(FPF)]、三氟苯嘧啶[triflumezopyrim (TFM)]和dicloromezotiaz正在引入市場(chǎng)(圖1)，本文把它們歸為新一代。近年，在亞洲南部、東南部和東部國(guó)家，抗新煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑害蟲(chóng)對(duì)水稻造成嚴(yán)重危害。此外，對(duì)非靶標(biāo)和/或有益生物的安全性是開(kāi)發(fā)農(nóng)化產(chǎn)品的一個(gè)重要要求。在此境況下，Meiji Seika Pharma發(fā)現(xiàn)了新穎化學(xué)類(lèi)型殺蟲(chóng)劑flupyrimin [FLP,N[(E)-1-chloro-3-pyriminyl-methyl]pyridine-2(1H)-ylidene]-2,2,2-trifuoroacetamide]，此殺蟲(chóng)劑對(duì)水稻抗性害蟲(chóng)有杰出的殺蟲(chóng)活性，對(duì)授粉昆蟲(chóng)等有益生物有很高的安全性。

圖1 和內(nèi)源性激動(dòng)劑煙堿競(jìng)爭(zhēng)性作用于昆蟲(chóng)煙堿乙酰膽堿受體的煙堿殺蟲(chóng)劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)

本文由3部分組成，介紹了FLP的殺蟲(chóng)特性和對(duì)昆蟲(chóng)神經(jīng)的生理影響；比較了 FLP、其他煙堿殺蟲(chóng)劑分別與昆蟲(chóng)煙堿乙酰膽堿受體結(jié)合的相互作用特性；三以FLP相似物的藥效團(tuán)吡啶亞基和三氟乙?；臉?gòu)效關(guān)系為基礎(chǔ)預(yù)測(cè)了FLP分子識(shí)別昆蟲(chóng)煙堿乙酰膽堿受體同源物的情況。

1 生物活性

1.1 FLP和相似物

文中涉及的 FLP(1)和相似物如圖2，化合物 3－10、12－17(Tomizawa,M.等，2003；Ohno,I等，2010；Kagabu,S等，2013)和化合物 11，19－21(Ishimitsu,K等，1993；Ishimitsu,K等，1992；Shiokawa,K等，1987)根據(jù)文獻(xiàn)合成。N-[(E)-1-(6-氯-3-吡啶甲基)哌啶-2(1H)-亞基]-2,2,2-三氟乙酰胺(2)合成過(guò)程如下：在冰浴和攪拌條件下，在 1-[(6-氯-3-吡啶)甲基]哌啶-2(1H)亞胺(233 mg,1.00 mmol)的氯仿(15 mL)溶液中緩慢加入三氟乙酸酐(trifluoroacetic anhydrate) (441 mg，2.10 mmol)，再加入 N,N-二異丙基乙胺(452 mg，3.50mmol)。在室溫?cái)嚢璺磻?yīng)液過(guò)夜。在反應(yīng)混合物中加入水(30 mL)，用氯仿(15 mL×2)萃取，合并有機(jī)層，用 1% HCl、10%Na2CO3、水依次沖洗，干燥。真空除去溶液，用硅膠柱色譜法(己烷∶乙酸乙酯=1∶1)分離得到白色固體化合物 2：37 mg(6%)；mp 65～67 ℃；NMR (CDCl3),δH1.80(2H,m),1.85(2H,m),3.06(2H,t,J=6.3 Hz),3.44(2H,t,J=6.3 Hz),4.82(2H,s),7.33(1H,d,J=8.0 Hz),7.75 (1H,dd,J=8.0 Hz,J=2.3 Hz),8.35(1H,d,J=2.3 Hz)；δC19.2,22.2,29.5,48.8,51.1,115.5 (q,JC-F=288.8 Hz),124.8,130.2,139.6,149.7,151.7,164.7(d,JC-F=35.9 Hz),172.1；δF-76.1。C13H13ClF3N3O 的ESI-HRMS：計(jì)算值(+H+) 320.0777；試驗(yàn)值 320.0774。

N-[(E)-1-(6-氯 -3-吡 啶 甲 基)吡 啶 -2(1H)-亞基]-2-碘乙酰胺(18)合成過(guò)程如下：在攪拌條件下，在 1-[(6-氯-3-吡啶)甲基]吡啶-2(1H)亞胺(100 mg,0.45 mmol)的乙腈(10 mL)溶液中加入氯化碘乙酸(102 mg，0.50 mmol)。在室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h，加入乙酸乙酯(30 mL)。然后依次用1 N HCl(10 mL×3)和1 N NaOH(10 mL×3)溶液沖洗。干燥有機(jī)層，真空蒸發(fā)。用硅膠柱色譜法(甲醇∶乙酸乙酯=1∶1)分離得到棕色固體化合物 18：40 mg(23%)；mp 116～118 ℃(decom)；NMR (CDCl3),δH3.88+4.17(2H,2s),5.46 (2H,s),6.64(1H,t,J=13.5 Hz),7.31+7.33(1H,2d,J=4.3 Hz,J=4.3 Hz),7.58(2H,m),7.81(1H,m),8.25+8.33 (1H,2d,J=8.9 Hz,J=9.1 Hz),8.46(1H,t,J=4.5 Hz)；δC47.2,52.7,112.5,121.7,124.6,124.7,130.1,137.6,139.2,140.5,149.4,149.5,151.7。C13H11ClIN3O的ESI-HRMS：計(jì)算值(+H+) 387.9713；試驗(yàn)值 387.9716。

圖2 2個(gè)放射性標(biāo)記的煙堿殺蟲(chóng)劑[3H]FLP和[3H]IMI和FLP相似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)(*表示氚的位置)

N-[(E)-1-(6-氯-3-吡啶甲基)吡啶-2(1H)-亞基]-2-苯甲酰胺(22)合成過(guò)程如下：化合物22的合成與化合物18的相似，只是氯化碘乙酸換為苯甲酰氯，得到黃色固體化合物 22：35 mg(20%)；mp 115～117 ℃；NMR (CDCl3),δH5.53(2H,d,J=4.1 Hz),6.54-6.55(1H,m),7.28-7.30(1H,m),7.38-7.47(3H,重疊 m)，7.53-7.63(2H,重疊 m)，7.72(1H,m),8.16(2H,d,J=8.3 Hz),8.36 (1H,dd,J=8.3 Hz,J=2.7 Hz),8.45(1H,broad s)；δC52.5,111.4,121.8,124.8,128.0,129.3,130.7,131.2,137.7,138.7,138.8,139.7,149.2,151.6,158.9,174.4。C18H14ClIN3O的ESI-HRMS：計(jì)算值323.0825；試驗(yàn)值 323.0810。

其他物質(zhì)都購(gòu)買(mǎi)或合成。

1.2 殺蟲(chóng)活性

按文獻(xiàn)(Kagabu,K等，2013)測(cè)定了試驗(yàn)化合物對(duì)褐飛虱、白背飛虱、灰飛虱、黑尾葉蟬、棉蚜、溫室白粉虱、赤須盲蝽、西花薊馬、小菜蛾、稻負(fù)泥蟲(chóng)和家蠅的活性，以及對(duì)蜜蜂、歐洲熊蜂和角額壁蜂的急性毒性[8]。

表1為FLP、IMI和其他商業(yè)化殺蟲(chóng)劑對(duì)不同標(biāo)靶害蟲(chóng)的活性。FLP對(duì)褐飛虱、白背飛虱、小菜蛾、稻負(fù)泥蟲(chóng)和家蠅的活性高于 IMI，對(duì)灰飛虱、黑尾葉蟬、赤須盲蝽和西花薊馬(葉用或點(diǎn)滴施用)的活性與IMI相當(dāng)，對(duì)棉蚜和溫室白粉虱的活性低于IMI和呋蟲(chóng)胺。FLP對(duì)白背飛虱的活性高于氟啶蟲(chóng)胺腈，對(duì)褐飛虱的活性與氟蟲(chóng)腈相似，對(duì)家蠅的活性與氯菊酯相似。對(duì)稻負(fù)泥蟲(chóng)、西花薊馬和小菜蛾的活性低于呋蟲(chóng)胺、甲氨基阿維菌素和多殺菌素。FLP對(duì)其他種群的褐飛虱[2014和2015年從日本鹿兒島收集(葉用)]的活性是IMI的29和41倍，氟蟲(chóng)腈的5～7倍(表2)。此外，即使噴淋土壤施用，F(xiàn)LP比IMI和氟蟲(chóng)腈穩(wěn)定，對(duì)飛虱有效。對(duì)同一褐飛虱種群，F(xiàn)LP的活性是IMI的5或13倍，與氟蟲(chóng)腈的相似。對(duì)灰飛虱[從小田原(2001和 2006年)、大分(2013)和茨城(2016)，日本]種群，F(xiàn)LP的活性是IMI的2～31倍；對(duì)過(guò)去幾年收集的種群，F(xiàn)LP的活性是氟蟲(chóng)腈的5～22倍，氟蟲(chóng)腈只對(duì)2001年在小田原收集的種群有高活性。在生態(tài)毒理方面，IMI經(jīng)口服和/或點(diǎn)滴施用對(duì)蜜蜂和歐洲熊蜂有高毒，而FLP對(duì)授粉昆蟲(chóng)無(wú)害(表3)。FLP對(duì)角額壁蜂低毒。

表1 FLP、IMI和其他殺蟲(chóng)劑對(duì)不同害蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性

表2 FLP、IMI和氟蟲(chóng)腈對(duì)從日本收集的褐飛虱和灰飛虱田間種群的殺蟲(chóng)活性

表3 FLP與IMI對(duì)傳粉昆蟲(chóng)成蟲(chóng)的急性毒性比較

1.3 電生理作用

從美國(guó)蜚蠊雄成蟲(chóng)分離得到腹神經(jīng)索(從末端腹神經(jīng)節(jié)到第六神經(jīng)節(jié))，按文獻(xiàn)方法(Zhao,X等，2003)培養(yǎng)。用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)研究了煙堿或FLP的電生理作用。

在應(yīng)用10 μM煙堿后激發(fā)解離的末端腹神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元產(chǎn)生內(nèi)向電流(圖3)。相比，10 μM FLP(甚至100 μM (沒(méi)有列出數(shù)據(jù)))不會(huì)激發(fā)產(chǎn)生內(nèi)向電流，隨后用鹽溶液沖洗2 min，再用10 μM煙堿處理能激發(fā)產(chǎn)生反應(yīng)。驚奇的是，在用10 μM煙堿處理前用1 nM FLP處理1 min，F(xiàn)LP有很強(qiáng)的阻斷活性。此外，即使用鹽溶液沖洗6 min，煙堿的激發(fā)作用也不會(huì)恢復(fù)，F(xiàn)LP抑制煙堿誘導(dǎo)產(chǎn)生電流的IC50為0.32 nM(圖3)。

圖3 ACh和FLP(處理2 s)處理使解離的美洲大蠊末端神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元產(chǎn)生的典型電生理反應(yīng)(使用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù))

1.4 構(gòu)-效關(guān)系

集中研究了雜環(huán)(化合物 1-10)二烯 π電子和鹵原子(化合物1和11-20)對(duì)化合物對(duì)家蠅煙堿乙酰膽堿受體的結(jié)合力和對(duì)灰飛虱的殺蟲(chóng)活性影響的構(gòu)-效關(guān)系(表4)。環(huán)上具有二烯π電子的FLP(1)與煙堿乙酰膽堿受體的結(jié)合力(以 IC50表示)大于相應(yīng)的飽和相似物(2)。相似地，不飽和的噻唑啉(3)或咪唑啉(5)相似物的結(jié)合力大于相對(duì)應(yīng)的飽和噻唑烷(4)或咪唑烷(6)。二氫吡啶環(huán)上有一個(gè)氮原子的化合物，即二氫噠嗪(7)、二氫-1,3-嘧啶(8)、二氫-1,5-嘧啶(9)和二氫吡嗪，其環(huán)上電子密度降低，沒(méi)有活性。N-乙?；嗨莆?CH3)(11)的親和力只有相對(duì)應(yīng)的 N-三氟乙酰基(CF3)FLP(1)的1/240。有趣的是，含有取代基 CHF2、CF2Cl、CCl3、CHCl2、CH2Cl、CH2Br 和CH2I的N-鹵乙?；嗨莆锏挠H和力與FLP(1)一樣。N-硝基(19)和N-氰基(20)相似物和家蠅的煙堿乙酰膽堿受體的親和力非常強(qiáng)。對(duì)昆蟲(chóng)煙堿乙酰膽堿受體具有高親合力的化合物(1，12，13，17和19)對(duì)灰飛虱有殺蟲(chóng)(以LD90表示)作用，但其他高親合力的化合物(3，14，15，16，18和20)的殺蟲(chóng)活性低。親合力低的化合物(2，4－11)如預(yù)測(cè)一樣沒(méi)有殺蟲(chóng)活性。有趣的是化合物19有殺蟲(chóng)活性，但化合物20活性很低。

表4 FLP相似物替代[3H]FLP(1 nM)與家蠅nAChR結(jié)合的潛力和對(duì)灰飛虱的殺蟲(chóng)活性

2 與靶標(biāo)的結(jié)合

按照Tomizawa等人(1996)的方法進(jìn)行了[3H]FLP或[3H]IMI與野生家蠅大腦煙堿乙酰膽堿受體結(jié)合的試驗(yàn)。用桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)了哺乳動(dòng)物的α4β2煙堿乙酰膽堿受體。把從Origene Technologies購(gòu)買(mǎi)的大鼠α4或β2亞基cDNA分別插入XhoI/EcoRI位點(diǎn)或BamHI/XhoI位點(diǎn)的pBacPAK8。根據(jù)BacPAK 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Clontech Laboratories,Mountain View,CA)指導(dǎo)手冊(cè)進(jìn)行了Sf21細(xì)胞的轉(zhuǎn)染、噬菌斑篩選、重組病毒擴(kuò)增、感染和收集細(xì)胞。單層細(xì)胞培養(yǎng)，接種α4和β2重組病毒，感染復(fù)數(shù)為10。在感染72 h后收集Sf21細(xì)胞。按D’Amour和Casida的方法進(jìn)行受體制備和[3H]NIC結(jié)合。用SigmaPlot 13 軟件(SYSTAT Software,San Jose,CA)計(jì)算IC50(取代50%結(jié)合的放射配體的試驗(yàn)化合物濃度)和結(jié)合參數(shù)[離解常數(shù)(KD)、最大結(jié)合能力(Bmax)、希爾系數(shù)(nH)]。

按文獻(xiàn)方法(Tomizawa,M.等，2008；Ohno,I.等，2009；Tomizawa,M.等，2011)進(jìn)行了FLP與處于與IMI結(jié)合狀態(tài)的海蝸牛AChBP結(jié)構(gòu)(PDB 3C79)對(duì)接和分子動(dòng)態(tài)(MD)模擬研究。這涉及受體中的一個(gè)水分子(已知在IMI的吡啶氮和loop E氨基酸間形成橋連氫鍵)。FLP與一對(duì)亞基鏈[(+)-和(－) -face subunit chains]對(duì)接。然后，對(duì)AChBP-FLP進(jìn)行MD模擬，來(lái)充分開(kāi)發(fā)活性位點(diǎn)區(qū)域的構(gòu)象空間。由于這對(duì)[(+)-and(－)-chains]鏈模型的結(jié)構(gòu)局限性，對(duì)結(jié)合骨架有一定的限制。隨后，根據(jù)Cerón-Carraco等人的方法，選擇MD模擬的樣本架構(gòu)進(jìn)行詳細(xì)的密度泛函理論(DFT)計(jì)算。以高DFT水平[M06-2X/CCPVTZ(-F)+均衡校正]單獨(dú)計(jì)算了相關(guān)氨基酸和一個(gè)水分子與FLP以在4?距離范圍內(nèi)對(duì)接的相互作用能量。

2.1 結(jié)合特點(diǎn)

比較了[3H]FLP和[3H]IMI分別與家蠅受體結(jié)合的飽和等溫線(圖4)。發(fā)現(xiàn)[3H]FLP有多個(gè)結(jié)合點(diǎn)，即KD有0.27、6.5 nM，Bmax有170、210 fmol/mg蛋白，nH0.66。相比，發(fā)現(xiàn)[3H]IMI只有一個(gè)結(jié)合點(diǎn)，即KD2.2 nM，Bmax220 fmol/mg蛋白，nH0.98。

圖4 [3H]FLP(左)和[3H]IMI(右)與野生家蠅大腦nAChRs特異性結(jié)合的飽和等溫線和Scatchard圖

比較了不同煙堿制劑與[3H]FLP受體和[3H]IMI受體的作用。表5中所有制劑的IC50表明2個(gè)生測(cè)系統(tǒng)具有基本相同的相互關(guān)系。nHs為結(jié)合特性指數(shù)，具有不同N-?；鶊F(tuán)(1、11、21和22)的FLP相似物替代[3H]FLP的nHs與替代[3H]IMI的一致，即nH約為 1.0，表示沒(méi)有協(xié)同作用。然而，其他制劑(NIC、IMI、ACE、CLO 和 FPF)替代[3H]FLP的nH為 0.53～0.78，表明具有拮抗作用，而它們替代[3H]IMI的nH約1.0。值得注意的是，TFM在2個(gè)生測(cè)系統(tǒng)中都表現(xiàn)為拮抗作用(nH0.64～0.65)。

表5 不同煙堿劑代替[3H]FLP(1 nM)或[3H]IMI(5 nM)與家蠅nAChRs結(jié)合的活性

進(jìn)行了同時(shí)雙放射性配體結(jié)合試驗(yàn)(表6)，試驗(yàn)中進(jìn)行了2個(gè)放射性配體與同一家蠅大腦受體溶液同時(shí)結(jié)合或直接競(jìng)爭(zhēng)研究。此試驗(yàn)?zāi)茏C明2個(gè)放射性配體是結(jié)合于不同位點(diǎn)(或受體亞型)還是同一區(qū)域(或緊密偶聯(lián)位點(diǎn))。在飽和試驗(yàn)的基礎(chǔ)上可知(圖4)，1或20 nM [3H]FLP分別為或接近高親和點(diǎn)(KD0.27 nM)和低親和點(diǎn)(KD6.5 nM)的飽和度。20 nM[3H]IMI是KD(2.2 nM)的9.1倍。發(fā)現(xiàn)[3H]FLP(1 nM)和[3H]IMI(20 nM)的結(jié)合率分別為79.4%和20.6%，理論值為 100%。二者同時(shí)結(jié)合的總結(jié)合率只有44.6%。因此，一個(gè)放射性配體對(duì)另一個(gè)放射性配體的結(jié)合有明顯的干擾作用。而[3H]FLP和[3H]IMI(都為20 nM)的結(jié)合率分別為理論值(100%)的88.6%和11.4%。有趣的是，在上述條件下(都為20 nM)，同時(shí)使用2個(gè)放射性配體，結(jié)合率為87.5%，即2個(gè)配體大部分結(jié)合于不同的位點(diǎn)。因此，高親和[3H]FLP結(jié)合點(diǎn)(1 nM就達(dá)到飽和狀態(tài))與[3H]IMI的重疊，2個(gè)物質(zhì)在同一結(jié)合位置競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。相比，低親和[3H]FLP結(jié)合點(diǎn)(20 nM時(shí)飽和)是與上述提及的不同的獨(dú)立受體。此外，α-金環(huán)蛇毒素替代與家蠅受體結(jié)合的[3H]FLP的IC50為860 nM，F(xiàn)LP代替結(jié)合的α-金環(huán)蛇毒的 IC50為 300 nM，表明FLP對(duì) α-金環(huán)蛇毒受體不敏感。

表6 同時(shí)雙放射性配體與家蠅nAChRs結(jié)合

顯然，[3H]FLP(100 nM)與重組的大鼠α4β2煙堿乙酰膽堿受體沒(méi)有特異性結(jié)合(2.4%)，而[3H]NIC(5 nM)特異性結(jié)合(97%)(表7)。此外FLP與2個(gè)代表性煙堿生物堿(－)-NIC和(±)-EPI(分別為2.8、0.09 nM)相比，與α4β2煙堿乙酰膽堿受體([3H]NIC為報(bào)道分子測(cè)定)的結(jié)合親合力非常低(1 100 nM) (表8)。FLP經(jīng)口和真皮施用對(duì)大鼠無(wú)高毒毒性(表8注腳)。

表7 放射性配體與重組大鼠α4β2 nAChR的結(jié)合

表8 煙堿配體替代[3H]NIC(5 nM)與重組大鼠α4β2 nAChR的結(jié)合活性

2.2 結(jié)合點(diǎn)相互作用

在以上構(gòu)-效關(guān)系研究和先前的化學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬建立FLP與海蝸牛AChBP(是昆蟲(chóng)煙堿乙酰膽堿受體胞外配體結(jié)合域的適宜結(jié)構(gòu)代替物)結(jié)合位點(diǎn)相互作用關(guān)系(圖5)。FLP的氯吡啶氯接觸loop E A107和M116，在氯吡啶氮、I106和I118間形成水介導(dǎo)的氫鍵。三氟乙酰的三個(gè)氟原子通過(guò)氫鍵或疏水性相互作用與C226-227、S189、Y55、Q57和I118接觸。=NC(O)氧接觸Y55 OH、或S189/C190骨架的NH。FLP的吡啶亞基上的2個(gè)π-電子系統(tǒng)和W147和Y118形成π-堆積。在較高DFT水平計(jì)算了FLP和海蝸牛AChBP中形成 FLP結(jié)合口袋的每個(gè)相關(guān)氨基酸間的相互作用能量(表9)。Loop B W174和 loop C C190-191和FLP有很強(qiáng)的相互作用。Loop E I118、loop C Y188和水也有重要的相互作用。Loop D Q57或Y55也有一定的貢獻(xiàn)，而loop C S189或loop E M116似有相互作用。

圖5 FLP與海蝸牛AChBP(昆蟲(chóng)nAChR配體結(jié)合域的適宜替代結(jié)構(gòu))結(jié)合位點(diǎn)相互作用的結(jié)構(gòu)模型

表9 FLP與形成結(jié)合腔的主要氨基酸的相互作用能量

3 討 論

與靶標(biāo)具有非典型的相互作用而不會(huì)被解毒的新穎化學(xué)類(lèi)型煙堿殺蟲(chóng)劑的開(kāi)發(fā)可能賦予此類(lèi)物質(zhì)獨(dú)特的生物學(xué)特性，如對(duì)抗新煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑的害蟲(chóng)具有高活性，對(duì)傳粉媒介安全。

本文介紹了Meiji Seika Pharma開(kāi)發(fā)的一個(gè)新藥劑 FLP，此產(chǎn)品具有優(yōu)異的殺蟲(chóng)活性，特別是對(duì)水稻害蟲(chóng)，包括對(duì)IMI不敏感的害蟲(chóng)種群。重要的水稻害蟲(chóng)褐飛虱和和灰飛虱由于細(xì)胞色素 P450(s)的解毒能力增加而對(duì)IMI和其他新煙堿殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性。令人驚奇的是，R81T突變(桃蚜β1 loop D上)的抗IMI的桃蚜(高抗FRC品系)仍保留有一個(gè)高親和性[3H]IMI結(jié)合點(diǎn)(KD4 nM和Bmax2000 fmol/mg蛋白)。要強(qiáng)調(diào)的是在急性毒性評(píng)估中 FLP比 IMI和其他新煙堿殺蟲(chóng)劑對(duì)蜜蜂的毒性低。此外，F(xiàn)LP對(duì)哺乳動(dòng)物安全，部分原因是和脊椎動(dòng)物大腦中表達(dá)的主要煙堿乙酰膽堿受體亞型即重組大鼠 α4β2受體親和性低。

就結(jié)合特性而言，[3H]FLP與多個(gè)受體亞型結(jié)合。有趣的是其中之一被認(rèn)為是[3H]IMI敏感亞型。其他的[3H]FLP位點(diǎn)可能是IMI不敏感亞型。因此，F(xiàn)LP可能作用于不同的昆蟲(chóng)煙堿乙酰膽堿受體亞型。NIC、3個(gè)新煙堿殺蟲(chóng)劑(IMI、ACE和CLO)，和2個(gè)新殺蟲(chóng)劑FPF和TFM以不同于含有N-酰基亞胺藥效團(tuán)的FLP相似物的方式作用于高親和性的[3H]FLP位點(diǎn)。相比，這6個(gè)煙堿藥劑和FLP相似物競(jìng)爭(zhēng)性地作用于[3H]IMI位點(diǎn)。這些發(fā)現(xiàn)表明接納FLP相似物的N-酰基亞胺藥效團(tuán)的結(jié)合亞位點(diǎn)或合適的位置與新煙堿N-硝基/氰亞胺基團(tuán)的不一樣，但是，整個(gè) N-?；Y(jié)合位置的一小部分為與 N-硝基/氰基頂端相互作用點(diǎn)。FLP大概與新煙堿殺蟲(chóng)劑共用同一腔(或緊密偶聯(lián)的亞位點(diǎn))。另一方面，TFM可能以不同于新煙堿或FLP的方式與家蠅煙堿乙酰膽堿受體相互作用，雖然TFM以競(jìng)爭(zhēng)的方式與家蠅[3H]IMI位點(diǎn)結(jié)合。FLP對(duì)草地貪夜蛾的神經(jīng)元有激動(dòng)作用，而TFM為大蠊的煙堿作用拮抗劑。本文研究中，F(xiàn)LP也呈現(xiàn)強(qiáng)的拮抗作用。然而，CLO對(duì)大蠊的神經(jīng)元有興奮作用。毫無(wú)疑問(wèn)FLP具有不同于FPF和新煙堿的生理作用。

IMI和FLP都含有6-氯吡啶-3-基甲基基團(tuán)，然而它們的藥效系統(tǒng)大不同。新煙堿在胍或脒和硝基或氰基取代基間共面，因此產(chǎn)生電子共軛現(xiàn)象，使部分負(fù)電荷朝末端氧或氮原子流動(dòng)。帶負(fù)電荷的氧或氮主要與loop C氨基酸形成氫鍵(圖6)。因此，共軛電子系統(tǒng)為新煙堿主要的藥效團(tuán)。事實(shí)上，硝基/氰亞胺新煙堿與由昆蟲(chóng)α (家蠅的α2或果蠅α2)和哺乳動(dòng)物 β(大鼠 β2)亞基組成的雜交煙堿乙酰膽堿受體(s)有高親和性。一旦雜交受體(果蠅α2/雞β2)的果蠅α2亞基被雞α4亞基替代，此受體對(duì)IMI的反應(yīng)就完全沒(méi)有了。假想雜交受體由昆蟲(chóng)α與脊椎動(dòng)物β2亞基組成，昆蟲(chóng)loop D序列被插入其中，適當(dāng)?shù)卦黾恿薎MI-激發(fā)的興奮性反應(yīng)(EC50s比野生型高幾倍)。形成鮮明對(duì)比的是，F(xiàn)LP三氟乙?；姆优cloop C、D和E氨基酸經(jīng)氫鍵(s)和/或范德瓦爾斯接觸有不同的相互作用。因此，長(zhǎng)的延伸的FLP三氟乙?；幮F(tuán)被由loops C、D和E組成的界面腔錨定。相對(duì)地，相似物N-乙酰氨基(例如具有吡嗪環(huán)的化合物21)型藥效團(tuán)位于上述提到的位置。此外，雜環(huán)上的二烯π-電子和loop B和C的芳香氨基酸形成π-堆積相互作用，賦予非常穩(wěn)定的能量。因此以上2個(gè)獨(dú)特的FLP藥效團(tuán)對(duì)結(jié)合表面的分子識(shí)別具有獨(dú)特的和決定性作用。此外，在電生理學(xué)和放射性配體結(jié)合的基礎(chǔ)上對(duì) FLP相似物構(gòu)-效關(guān)系的研究能夠充分地解釋FLP的殺蟲(chóng)作用機(jī)制。

圖6 FLP C(O)CF3藥效團(tuán)與海蝸牛AChBP loops C、D和E氨基酸(上左)獨(dú)特結(jié)合相互作用的圖示[與IMI NO2頂端氧與loop C氨基酸(PDB 3C79)(上右)相互作用形成鮮明對(duì)比]

總之，F(xiàn)LP為Meiji Seika Pharma發(fā)現(xiàn)的新化學(xué)類(lèi)型煙堿殺蟲(chóng)劑，具有顯著的生物學(xué)特性，對(duì)抗新煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑的水稻害蟲(chóng)具有優(yōu)異的防效，對(duì)授粉媒介高度安全。有趣的是，F(xiàn)LP以不同于其他煙堿殺蟲(chóng)劑的識(shí)別方式作用于昆蟲(chóng)煙堿乙酰膽堿受體，為拮抗劑。

10.16201/j.cnki.cn31-1827/tq.2017.06.04

TQ453

A

1009-6485(2017)06-0016-07

姜靜(1993—)，女，甘肅定西人，在讀研究生。研究方向：藥物篩選新靶點(diǎn)確定及實(shí)踐。E-mail: JannicaJiang@126.com。

2017-12-01。